Bau von Defined Menschen Engineered Herzgewebe zur Untersuchung Mechanismen der Herzzelltherapie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, humanes engineeretes Herzgewebe mit einer definierten zellulären Zusammensetzung herzustellen. Diese Methode kann zentrale Herausforderungen im Bereich des Herzgewebe-Engineerings bewältigen, darunter die Kontrolle von Variabilität und Effizienz der kardialen Differenzierung sowie das Verständnis, wie spezifische Zelltypen die kontraktile Herzfunktion beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass das Endergebnis humanes engineeretes Herzgewebe mit kontrollierter und definierter Zusammensetzung ist.

Wiederholungen dieser Technik weisen in Richtung einer Therapie für Herzerkrankungen, da definierte Gewebe eine neuartige, biologisch relevante und biomedizinische Testplattform bieten können, die in der Lage ist, therapeutische Maßnahmen zu bewerten. Obwohl diese Methode Einblicke in neuartige kardiale Therapeutika ermöglichen kann, lässt sich das humanes Gewebe umfassende kardiale Gewebesystem auch nutzen, um Mechanismen der kardialen Zelltherapie zu verstehen. Beginnen Sie mit Kulturen von aus humanen embryonalen Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und geben Sie ein Milliliter 0,04 %igem Trypsin-EDTA hinzu.

Inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Während die Zellen inkubieren, geben Sie 12 Mikroliter ROCK-Inhibitor zu sechs Millilitern Trypsin-Neutralisationslösung. Entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und geben Sie je einen Milliliter der Neutralisationslösung in jedes Loch der sechslochigen Platte.

Überführen Sie alle Zellen aus jedem Wells in ein einzelnes 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Waschen Sie alle sechs Wells mit einem Volumen von drei Milliliter PBS und kombinieren Sie diese Waschung mit den Zellen im Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um die Zellen zu pelletieren.

Um die Zellen für die Sortierung lebender Zellen mittels FACS vorzubereiten, stellen Sie den Färbepuffer her, indem Sie fünf Milliliter FBS und 50 Mikroliter ROCK-Inhibitor zu 45 Milliliter PBS auf Eis hinzufügen. Entfernen Sie den Überstand von den pelletierten Zellen und resuspendieren Sie sie in 1,2 Milliliter Färbepuffer. Überführen Sie 200 Mikroliter der suspendierten Zellen in ein neues vorab gekühltes 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen auf Eis.

Überführen Sie anschließend das verbleibende eine Milliliter der Zellsuspension in ein neues vorgekühltes 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen auf Eis und geben Sie zwei Mikroliter SIRP alpha-PE/Cy7- und vier Mikroliter CD90-FITC-Antikörper hinzu. Mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig mit einer Transferpipette und stellen Sie das Röhrchen auf Eis. Inkubieren Sie die beiden 50-Milliliter-Röhrchen, die die negative Kontrolle und die Probe enthalten, eine Stunde lang auf einem Schüttelrührer auf Eis bei vier Grad Celsius.

Während die Zellen inkubiert werden, überführen Sie drei Milliliter Differenzierungsmedium 2 in jeweils zwei 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie dann drei Mikroliter ROCK-Inhibitor hinzu und lagern Sie diese FACS-Sammelröhrchen vor der Verwendung auf Eis. Anschließend pelletieren Sie die gefärbten Zellen bei 300 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Und waschen Sie sie zweimal mit 10 Milliliter eiskaltem PBS. Resuspendieren Sie das Probenpellet vorsichtig in ein bis drei Milliliter Färbe-Puffer, der DAPI enthält. Geben Sie 500 Mikroliter Färbe-Puffer ohne DAPI zum Pellet der Negativkontrolle hinzu.

Filtern Sie beide Zellsuspensionen durch einen 40-Mikrometer-Zellsieb, um Zellklumpen zu entfernen, und überführen Sie sie anschließend in Polystyrol-FACS-Röhrchen auf Eis. Bringen Sie die Proben unverzüglich zum Zellsortierer. Beginnen Sie mit der negativen Färbekontrollprobe und legen Sie die Gating-Parameter fest.

Dann, während der Analyse der Probenzellen, die Population der lebenden Zellen, die negativ für DAPI sind, auswählen. Sammeln Sie die FITC-positiven und die PE/Cy7-positiven Zellpopulationen jeweils unabhängig bei 20 PSI. Nach dem Kultivieren und erneuten Aggregieren der Zellen gemäß dem schriftlichen Protokoll die Zellkulturschalen aus dem Inkubator nehmen und das Medium in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen.

Spülen Sie die Platten mit drei Milliliter PBS und überführen Sie die Waschflüssigkeit in denselben 50-Milliliter-Zentrifugenrohr. Geben Sie anschließend drei Milliliter 0,04 % Trypsin-EDTA zu den Platten hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Untersuchen Sie nach fünf Minuten die Platten unter dem Mikroskop auf Zellablösung.

Nachdem alle Zellen sich gelöst haben, drei Milliliter Trypsin-Neutralisationslösung zu den Platten hinzufügen. Vorsichtig mischen und die Zellen in das ursprüngliche 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen. Die Platten mit fünf Millilitern PBS waschen und diese Waschung ebenfalls zum Röhrchen hinzufügen.

Die Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für fünf Minuten bei Raumtemperatur pelletieren. Das Überstand entfernen und das Pellet in einem Milliliter neugeborenen Rinderserum oder NBS-Medium resuspendieren. Anschließend die Zellen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.

Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 × g für fünf Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand. Um die Herstellung der sechs modifizierten kardialen Gewebe zu beginnen, verdünnen Sie 60,0 µL der Kollagen-Stammlösung mit 5 mg/mL auf 3,125 mg/mL durch Zugabe von 1,5 µL einer einmolaren Natriumhydroxid-Lösung, 9,6 µL 10× PBS und 24,9 µL sterilem, ultrareinem Wasser. Dabei ist es entscheidend, die Bildung von Luftblasen in der Kollagenmischung zu vermeiden, da sich Luftblasen nur langsam aus der viskosen Lösung lösen und die Gewebebildung während der Gewebekompaktion stören können.

Pipettieren Sie an der Seite des 15-Milliliter-Röhrchens 12,0 Mikroliter 10X MEM und 0,2 normale HEPES bei pH 9 hinzu, um die Kollagenmischung zu verdünnen. Geben Sie dann die Basalmembran-Matrix zur Kollagenmischung, um eine Endkonzentration von 0,9 Milligramm pro Milliliter zu erreichen, und mischen Sie vorsichtig. Lagern Sie diese endgültige Gewebemischung auf Eis.

Überführen Sie anschließend die gesamte Gewebemischung auf das Zellpellet und geben Sie zusätzliche Zellen hinzu, wie im textlichen Protokoll angegeben. Füllen Sie das Röhrchen mit zellfreiem NBS-Medium auf ein Endvolumen von 150 Mikrolitern auf und mischen Sie vorsichtig. Pipettieren Sie vorsichtig jeweils 25 Mikroliter der Zellsuspension in jedes der sechs Löcher in der Basisplatte des Bioreaktors.

Wiederholen Sie den Mischvorgang zwischen jedem Well, um eventuell abgesetzte Zellen erneut aufzuschwemmen. Pipettieren Sie jeweils nur ein Gewebe pro Well, um ein konsistentes Volumen und eine gleichbleibende Zellzahl pro Gewebe zu gewährleisten. Drücken Sie separat zwei Reihen aus Polydimethylsiloxan (PDMS) bestehende Kraftsensoren auf beiden Seiten des Polysulfon-Rahmens an, um sechs Paare gegenüberliegender Säulen zu bilden.

Drehen Sie den Rahmen auf der Grundplatte um, sodass ein Paar Pfosten in jedes Gefäß mit der Zellsuspension eintaucht. Setzen Sie dann den Bioreaktor in eine 60-Millimeter-Schale ein und stellen Sie diese Schale ohne Deckel in eine 10-Zentimeter-Schale. Setzen Sie den Deckel auf die 10-Zentimeter-Schale und bringen Sie die gesamte Bioreaktor-Anordnung in den Zellkultur-Inkubator.

Nach zwei Stunden der Inkubation die Bioreaktorbaugruppe entfernen und 14 Milliliter NBS-Medium hinzufügen, um die Basisplatte zu bedecken. Den Bioreaktor zurück in den Zellkulturschrank stellen und täglich die Hälfte des Mediums wechseln. Nach 48 Stunden die Basisplatte vorsichtig um jeweils einige Millimeter anheben.

Bringen Sie dann den Bioreaktor mit dem Gewebe nach unten in das Medium zurück. Falls ein Gewebe beim Entfernen der Basisplatte von einem Pfosten abfällt, befestigen Sie es vorsichtig erneut am Pfosten. Die Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen führt zu einer gemischten Kultur aus hauptsächlich Kardiomyozyten und Fibroblasten, die sich zu Aggregaten organisieren und im gesamten Gefäß kräftig schlagende Netzwerke bilden.

Die FACS-Analyse dieser Kulturen zeigte, dass dieses Differenzierungsverfahren eine Population ergibt, die mindestens 65 % SIRP-alpha-positive Zellen und 10 % CD90-positive Zellen enthält. Nach Entfernung der Basisplatte können die humanen, gewebetechnisch hergestellten Herzmuskeln, oder HECTs, innerhalb des Bioreaktors selbstständig assemblieren. Ausgereifte und verdichtete HECTs lenken die integrierten Kraftsensoren sichtbar mit einer durchschnittlichen Kraft von fünf bis 15 Mikronewton ab.

Die Messung der Zuckungskraft zeigt, wie isolierte Variablen die kontraktile Kraft in diesen definierten, technisch hergestellten Geweben verändern. Hier wird beobachtet, dass die Zugabe von 10 % menschlichen mesenchymalen Stammzellen eine deutliche Steigerung der kontraktilen Kraft bei beiden Stimulationsfrequenzen, ein Hertz und zwei Hertz, bewirkt. Sobald die Methoden beherrscht sind, dauert die Differenzierung etwa 20 Tage, die Zellsortierung etwa fünf Stunden und die Gewebekonstruktion etwa drei Stunden.

Weitere sieben Tage sind nach der Herstellung für eine angemessene Gewebebildung erforderlich. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Zellmarkierung und die Zugabe weiterer Zellen zum Gewebegemisch durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den Auswirkungen spezifischer Zell-Zell-Interaktionen zu beantworten oder die Mechanismen der Zelltherapie zu untersuchen. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man humanes, technisch erzeugtes Herzmuskelgewebe mit einer bekannten und kontrollierbaren zellulären Zusammensetzung herstellt.