Bau von Defined Menschen Engineered Herzgewebe zur Untersuchung Mechanismen der Herzzelltherapie

Dieses Manuskript beschreibt die Erstellung von definiertem manipuliertem Herzgewebe unter Verwendung von Oberflächenmarker-Expression und Zellsortierung. Die definierten Gewebe können dann in einem Multigewebe-Bioreaktor verwendet werden, um Mechanismen der kardialen Zelltherapie zu untersuchen, um ein funktionsfähiges, aber dennoch kontrolliertes Modellsystem des menschlichen Herzens bereitzustellen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, vom Menschen manipuliertes Herzgewebe mit einer definierten zellulären Zusammensetzung zu erzeugen. Diese Methode kann wichtige Herausforderungen im Bereich des kardialen Tissue Engineering angehen, einschließlich der Kontrolle der Variabilität und der Effizienz der kardialen Differenzierung und des Verständnisses, wie sich bestimmte Zelltypen auf die kontraktile Funktion des Herzens auswirken. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Endergebnis menschlich hergestelltes Herzgewebe mit einer kontrollierten und definierten Zusammensetzung ist.

Replikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von Herzerkrankungen, da definierte Gewebe eine neuartige, biologisch relevante und biomedizinische Screening-Plattform darstellen können, die in der Lage ist, therapeutische Interventionen zu bewerten. Obwohl diese Methode Einblicke in neuartige kardiale Therapeutika geben kann, kann das Human Engineering Cardiac Tissue System auch verwendet werden, um die Mechanismen der kardialen Zelltherapie zu verstehen. Beginnen Sie mit Kardiomyozytenkulturen aus humanen embryonalen Stammzellen, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und fügen Sie einen Milliliter 0,04 % Trypsin-EDTA hinzu.

Inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Wenn die Zellen inkubieren, fügen Sie 12 Mikroliter ROCK-Inhibitor zu sechs Millilitern Trypsin-Neutralisationslösung hinzu. Nehmen Sie die Platten aus dem Inkubator und geben Sie einen Milliliter der Neutralisationslösung in jede Vertiefung der Sechs-Well-Platte.

Übertragen Sie alle Zellen aus jeder Vertiefung in ein einzelnes 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Waschen Sie alle sechs Vertiefungen mit einem Volumen von drei Millilitern PBS und kombinieren Sie diese Wäsche mit den Zellen im Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um die Zellen zu pelletieren.

Um die Zellen für die Lebendzellsortierung mit FACS vorzubereiten, bereiten Sie den Färbepuffer vor, indem Sie fünf Milliliter FBS und 50 Mikroliter ROCK-Inhibitor zu 45 Millilitern PBS auf Eis hinzufügen. Entfernen Sie den Überstand von den pelletierten Zellen und resuspendieren Sie sie in 1,2 Millilitern Färbepuffer. Übertragen Sie 200 Mikroliter der suspendierten Zellen in ein neues vorgekühltes 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen auf Eis.

Übertragen Sie anschließend den restlichen Milliliter der Zellsuspension in ein neues vorgekühltes 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen auf Eis und fügen Sie zwei Mikroliter SIRP alpha-PE/Cy7 und vier Mikroliter CD90-FITC-Antikörper hinzu. Mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig mit einer Transferpipette und legen Sie das Röhrchen auf Eis. Die beiden 50-Milliliter-Röhrchen mit der Negativkontrolle und die Probe auf einem Wippenschüttler auf Eis bei vier Grad Celsius eine Stunde lang inkubieren.

Während die Zellen inkubieren, werden drei Milliliter Differenzierungsmedium zwei auf jeweils zwei 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen übertragen. Fügen Sie dann drei Mikroliter ROCK-Inhibitor hinzu und lagern Sie diese FACS-Sammelröhrchen vor der Verwendung auf Eis. Als nächstes pelletieren Sie die gefärbten Zellen fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 300 mal G.

Und waschen Sie sie zweimal mit 10 Millilitern eiskaltem PBS. Resuspendieren Sie das Probenpellet vorsichtig mit ein bis drei Millilitern Färbepuffer, der DAPI enthält. Geben Sie 500 Mikroliter Färbepuffer ohne DAPI zum Negativkontrollpellet

Filtern Sie beide Zellsuspensionen durch ein 40-Mikron-Zellsieb, um Zellklumpen zu entfernen, und übertragen Sie sie dann auf Eis in Polystyrol-FACS-Röhrchen. Bringen Sie die Proben sofort zum Zellsortierer. Beginnen Sie mit der Kontrollprobe für die Negativfärbung und legen Sie die Gating-Parameter fest.

Wählen Sie dann beim Ausführen der Beispielzellen die DAPI-negative lebende Zellpopulation aus. Sammeln Sie sowohl die FITC-positiven als auch die PE/Cy7-positiven Zellpopulationen unabhängig voneinander bei 20 PSI. Nach der Kultivierung und Reaggregation der Zellen, wie im Textprotokoll angegeben, nehmen Sie die Zellkulturplatten aus dem Inkubator und geben Sie das Medium in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Waschen Sie die Platten mit drei Millilitern PBS und geben Sie die Wäsche in dasselbe 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie dann drei Milliliter 0,04 % Trypsin-EDTA auf die Platten und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Nach fünf Minuten untersuchen Sie die Platten mit einem Mikroskop auf Zellablösung.

Sobald sich alle Zellen abgelöst haben, geben Sie drei Milliliter Trypsin-Neutralisationslösung auf die Platten. Mischen Sie die Zellen vorsichtig und geben Sie sie in das originale 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Waschen Sie die Platten mit fünf Millilitern PBS und geben Sie diese Wäsche ebenfalls in die Tube.

Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 300-facher G für fünf Minuten bei Raumtemperatur pelletiert. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Rinderserum für Neugeborene oder NBS-Medium. Übertragen Sie anschließend die Zellen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Die Zellen werden bei 300-facher G-Temperatur fünf Minuten lang bei Raumtemperatur pelletiert und der Überstand entfernt. Um mit der Erzeugung der sechs manipulierten Herzgewebe zu beginnen, verdünnen Sie 60,0 Mikroliter der fünf Milligramm pro Milliliter Kollagenbestand auf 3,125 Milligramm pro Milliliter mit 1,5 Mikrolitern einem molaren Natriumhydroxid, 9,6 Mikrolitern 10X PBS und 24,9 Mikrolitern sterilem Reinstwasser. Hier ist es wichtig, das Einbringen von Luftblasen in die Kollagenmischung zu vermeiden, da sich die Luftblasen nur langsam aus der viskosen Lösung lösen und die Gewebebildung während der Gewebeverdichtung beeinträchtigen können.

Pipettieren Sie an der Seite des 15-Milliliter-Röhrchens entlang und fügen Sie jeweils 12,0 Mikroliter 10X MEM und 0,2 normale Häufchen bei pH 9 hinzu, um die Kollagenmischung zu verdünnen. Geben Sie dann die Basalmembranmatrix bis zu einer Endkonzentration von 0,9 Milligramm pro Milliliter in die Kollagenmischung und mischen Sie vorsichtig. Bewahren Sie diese endgültige Gewebemischung auf Eis auf.

Übertragen Sie anschließend die gesamte Gewebemischung auf das Zellpellet und fügen Sie zusätzliche Zellen hinzu, wie im Textprotokoll angegeben. Füllen Sie das Röhrchen bis zu einem Endvolumen von 150 Mikrolitern mit zellfreien NBS-Medien und mischen Sie es vorsichtig. Pipettieren Sie vorsichtig 25 Mikroliter der Zellsuspension in jede der sechs Vertiefungen in der Bioreaktor-Grundplatte.

Wiederholen Sie den Mischvorgang zwischen den einzelnen Vertiefungen, um eventuell abgesetzte Zellen wieder zu resuspendieren. Pipettieren Sie jeweils nur ein Gewebe pro Vertiefung, um ein konsistentes Volumen und eine konsistente Zellzahl pro Gewebe zu gewährleisten. Schieben Sie separat zwei Reihen Polydimethylsiloxan oder PDMS auf beide Seiten des Polysulfonrahmens, um sechs Paar gegenüberliegende Stifte zu bilden.

Drehen Sie den Rahmen auf der Grundplatte um, sodass ein Paar Stifte in jede Vertiefung eintritt, die die Zellsuspension enthält. Stellen Sie dann den Bioreaktor in eine 60-Millimeter-Schale und platzieren Sie diese Schale ohne Deckel in einer 10-Zentimeter-Schale. Setzen Sie den Deckel auf die 10-Zentimeter-Schale und schieben Sie die gesamte Bioreaktorbaugruppe in den Gewebekultur-Inkubator.

Nach zweistündiger Inkubation entfernen Sie die Bioreaktorbaugruppe und fügen Sie 14 Milliliter NBS-Medium hinzu, um die Grundplatte zu bedecken. Stellen Sie den Bioreaktor wieder in den Zellkultur-Inkubator und wechseln Sie täglich die Hälfte des Mediums. Entfernen Sie nach 48 Stunden die Grundplatte vorsichtig einige Millimeter lang.

Setzen Sie dann den Bioreaktor mit dem Gewebe nach unten auf das Medium zurück. Wenn beim Entfernen der Grundplatte ein Taschentuch von einem Pfosten abfällt, befestigen Sie das Taschentuch vorsichtig wieder am Pfosten. Die Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen führt zu einer Mischkultur von hauptsächlich Kardiomyozyten und Fibroblasten, die sich selbst zu Clustern organisieren und robust schlagende Netze in der gesamten Schale bilden.

Die FACS-Sortierung dieser Kulturen ergab, dass diese Differenzierungsmethode zu einer Population führt, die mindestens 65% SIRP-alpha-positive Zellen und 10% CD90-positive Zellen enthält. Nach dem Entfernen der Grundplatte kann sich das vom Menschen hergestellte Herzgewebe (HECTs) im Bioreaktor selbst ansammeln. Ausgewachsene und verdichtete HECTs lenken die integrierten Kraftmesssäulen mit durchschnittlich fünf bis 15 Mikronewton Kraft sichtbar ab.

Messungen der Twitch-Kraft zeigen, wie isolierte Variablen die kontraktile Kraft in diesen definierten künstlich hergestellten Geweben verändern. Wenn das Gewebe mit 10 % menschlichen mesenchymalen Stammzellen ergänzt wird, wird eine erhebliche Erhöhung der kontraktilen Kraft sowohl bei der Ein-Hertz- als auch bei der Zwei-Hertz-Stimulationsfrequenz beobachtet. Sobald die Differenzierung gemeistert ist, dauert die Differenzierung etwa 20 Tage, die Zellsortierung etwa fünf Stunden und der Gewebeaufbau etwa drei Stunden.

Weitere sieben Tage werden für die ordnungsgemäße Gewebebildung nach dem Bau benötigt. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, einschließlich der Zellmarkierung und der Supplementierung des Gewebemixes, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den Auswirkungen spezifischer Zell-Zell-Interaktionen zu beantworten oder die Mechanismen der Zelltherapie zu bestimmen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man menschlich hergestelltes Herzgewebe mit einer bekannten und kontrollierten Zellzusammensetzung herstellt.