Name: Bau von Defined Menschen Engineered Herzgewebe zur Untersuchung Mechanismen der Herzzelltherapie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung definierter humaner Herzgewebe mittels Oberflächenmarker-Sortierung und Multigewebe-Bioreaktor. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Mechanismen der Herzzelltherapie und die Entwicklung neuartiger therapeutischer Ansätze.

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Diese Arbeit wurde durch die NIH (1F30HL118923-01A1) zu TJC, NIH / NHLBI PEN Vertrag HHSN268201000045C auf KDC, das Forschungsstipendium Rat von Hong Kong TRS T13-706 / 11 unterstützt (KDC), NIH (R01 HL113499) zu BDG, die amerikanische heart Association (12PRE12060254) zu RJ und Research Grant Council of HKSAR (TBR, T13-706 / 11) zusätzliche Mittel zu RL wurde TJC von NIH DRB 5T32GM008553-18 zur Verfügung gestellt und als Praktikum auf NIDCR-Interdisziplinäre Ausbildung in Systeme und Entwicklungs Biologie und Geburtsfehler T32HD075735. Die Autoren möchten auch dankbar Arthur Autz an der Zahn Zentrum der City College of New York für die Unterstützung bei der Bearbeitung des Bioreaktors und Mamdouh Eldaly für die technische Unterstützung anerkennen. Wir danken auch Dr. Kenneth Boheler für die Beratung über Herz-Differenzierung und Dr. Joshua Hare für humanen mesenchymalen Stammzellen großzügig bereitstellt.

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Der Bau der definierten menschlichen engineered Herzgewebe (Hect) können bieten eine konsistente und zuverlässige Modell der menschlichen Kardiomyozyten-Funktion. Critically alle zellulären und extrazellulären Komponenten im System sind bekannt und können nach Wunsch manipuliert werden, wodurch die confounding Einfluss anderer Zelltypen unbekannten Entfernung von dem Differenzierungsprozess resultieren. Um einen schnellen Zellwachstum und hohe Ausbeute auszubalancieren, ist es bevorzugt, dass die Differenzierung beginnt...

Cardiac Tissue Engineering hat in den letzten zehn Jahren mit mehreren Gruppen Veröffentlichung der Ergebnisse der voll funktionsfähig, schlagen Gewebe aus beiden murine Kardiomyozyten 1-6 und in jüngster Zeit , die menschliche Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen 7-12 stark vorangetrieben . Das Herzgewebe Engineering - Bereich wird von zwei primären und im wesentlichen unabhängig Ziele angetrieben: 1) exogene Transplantate zu entwickeln , die in Ermangelung Herzen transplantiert werden kann , um die Funktion zu verbessern 4-6; und 2) In - vitro - Modelle zu entwickeln , für das Studium der Physiologie und Krankheit, oder als Screening - Tools für die therapeutische Entwicklung 2,7. Dreidimensionale (3-D) Zellkultur als Basis für das nächste Generation Screening-Tools zu entwickeln, wie die 3-D-Matrix eine natürliche Herzmikroumgebung als herkömmliche 2-D-Monolayer-Zellkultur widerspiegelt; in der Tat sind einige Aspekte der Zellbiologie grundverschieden in 2-D vs. 3-D Kulturen 13,14 </sup&gt;. Zusätzlich sind so konstruiert Herzgewebe von vollständig definierten Komponenten aufgebaut: einer extrazellulären Matrix und einer Zellpopulation. Für traditionelle engineered menschlichen Herzgewebe, während die extrazelluläre Matrix - Zusammensetzung ( in der Regel Fibrin 9 oder Kollagen 7,8,10) streng kontrolliert wird , wird die Eingangszelle Zusammensetzung weniger gut definiert, mit der gesamten Mischung von Zellen aus einer gerichteten Herzdifferenzierung entweder embryonale Stammzellen (ESC 7,9) oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPS 10,12) zu den Geweben aufgenommen werden. Abhängig von der spezifischen Zelllinie und die Effizienz der Differenzierung Protokoll verwendet, kann der resultierende Prozentsatz der Kardiomyozyten reichen von weniger als 25% auf über 90%, die spezifische cardiomyocyte Phänotyp (dh ventricular-, atrial- oder Schrittmacher-like) kann auch variieren, auch die nicht-Kardiomyozyten Fraktion 15,16 und verändern die Reife des differenzierten Herz m sehr heterogen seinyocytes 17. Aktuelle Herzgewebe Engineering - Arbeiten wurde versucht , die Eingangs Population von Zellen zu steuern, entweder mit einem Herz-Reporter humanen embryonalen Stammzelllinie 8 oder Zelloberflächenmarker 18 verwendet wird , um die Kardiomyozyten - Komponente der Differenzierung zu isolieren. Während zunächst ein Gewebe von nur Kardiomyozyten bestehen würde die ideal zu sein scheinen, ist dies in der Tat nicht der Fall; zusammengesetzt hECTs nicht nur aus Kardiomyozyten in funktionelle Gewebe zu verdichten, wobei einige Gruppen ein 3 zu finden: 1 - Verhältnis von Kardiomyozyten: Fibroblasten 8 die höchste Zuckungskraftmessungen erzeugen. verschiedene Zellselektionsmethoden, einschließlich Oberflächenmarker für lebende Zellsortierung durch Verwendung ist es möglich, hECTs mit definierten Zellpopulationen zu schaffen. Während der Marker nicht-kardialen Stromazellen seit einiger Zeit zur Verfügung haben, wie beispielsweise die putative Fibroblasten - Marker CD90 19,20, Oberflächenmarker von kardialen Myozyten waren schwierigerzu identifizieren. SIRPα gehörte zu den ersten Marker Herzoberfläche für den menschlichen Kardiomyozyten identifiziert 18 und wurde für die Herz-Linie sehr selektiv erwiesen. Vor kurzem haben wir festgestellt , dass zwei Sortieranlage für SIRPα + und CD90 - -Zellen nahezu reinen Kardiomyozyten mit der CD90 + -Population ergibt einen Fibroblasten-ähnlichen Phänotyp (Josowitz, nicht veröffentlichte Beobachtungen) aufweist. Auf der Basis dieser gesammelten Erkenntnisse, berichten hier schaffen wir hECTs unter Verwendung eines 3: 1 - Kombination von SIRPα + / CD90 - Kardiomyozyten und CD90 + Fibroblasten. Die Fähigkeit, eine vollständig definierte menschliche Herzgewebe zu konstruieren ist nicht nur für robuste Screening-Tools zu schaffen, sondern auch für die Entwicklung von Modellsystemen Schwellen zell- und Gen-basierten Herztherapien zu untersuchen. Insbesondere zahlreiche Zelltherapien für Herzversagen, unter Verwendung von Zelltypen , einschließlich mesenchymalen Stammzellen (MSC) 21 </sup&gt;, Herz-Stammzellen 22 und Knochenmark mononukleären Zellen 23-25, wurden in klinischen Studien getestet. Während viele der ersten Ergebnisse haben 21,23,25 waren vielversprechend, verringert sich die anfängliche Nutzen oft im Laufe der Zeit von 26 bis 29. Ein ähnlicher Trend wurde in murine engineered Herzgewebe berichtet worden, die durch MSC - Supplementierung einen signifikanten funktionellen Nutzen anzuzeigen, der Vorteil wird jedoch nicht während einer Langzeitkultur 1 aufrechterhalten. die suboptimale Leistung Basiswert ist unser begrenztes Wissen über die Mechanismen, Zelltherapien regeln. Ein tieferes Verständnis davon, wie therapeutischen Zellen ihre positiven Einfluss ausüben, sowie mögliche negative Auswirkungen von myocyte-nonmyocyte Wechselwirkungen, würde die Entwicklung verbesserter Therapien ermöglichen klinisch signifikante und anhaltende Vorteile, mit minimalen Nebenwirkungen bei Patienten mit Herzinsuffizienz führt. Hier beschreiben wir die Verwendung von definierten hECTs zu interrogate Mechanismen der zellbasierte Therapie. Die gesteuerte Gewebezusammensetzung ist wichtig, spezifische Faktoren zu identifizieren, Kardiomyozyten Leistung zu beeinträchtigen. Direkt hECTs mit dem therapeutischen Zelltyp von Interesse (zB MSCs) ergänzt werden , können die Auswirkungen auf die Kardiomyozyten - Leistung zeigen, wie wir in der Ratte ECTs 1 unter Beweis gestellt haben. Die folgenden Mehrschritt-Protokoll beginnt mit gerichtetem kardiale Stammzelldifferenzierung, gefolgt von der Herstellung des Mehr Gewebe-Bioreaktor, und mit einer Beschreibung der Gewebekonstruktion und funktionelle Analyse abzuschließen. Unsere Experimente ausgeführt, um die NIH-zugelassenen H7 mit humanen embryonalen Stammzellen (hES) Zeile. Allerdings haben die folgenden Protokolle auch eine zusätzliche hESC Linie und drei induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) Linien mit ähnlichen Ergebnissen getestet werden. Wir haben herausgefunden, dass die Effizienz in Kardiomyozytendifferenzierung und Erfolg in Hect Herstellungszelllinie abhängig sein kann, vor allem for hiPSC Linien von einzelnen Patienten abgeleitet. Durch Anschluss an dieses Protokoll, zwei 6-Well-Platten sind mit insgesamt 1,68 Millionen hESCs (140.000 Zellen pro Vertiefung) plattiert, die etwa 2,5 Millionen Myozyten nach Differenzierung für 20 Tage ergibt und Sortieren, genug sechs definierte Gewebe zu machen.

<table><tbody><tr><td>Cell Culture</td><td><>Company</td><td>Katalognummer</td><td>><Kommentare</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2411</td><td>Bereiten Sie eine Brühe von 2,5 mg/ml DMSO vor und filtrieren Sie</td></tr><tr><td>B27 mit Insulin</td><td>Life Technologies</td><td>17505055</td><td></td></tr><tr><td>B27 ohne Insulin</td><td>Life Technologies</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>Create 6 &mu; M Lagerbestand, dann aliquotieren und bei -20&nbsp; lagern; &deg;C.</td></tr><tr><td>Essential 8 Media</td><td>Life Technologies</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>H7 Humane embryonale Stammzellen</td><td>WiCell</td><td>WA07</td><td></td></tr><tr><td>hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Auftauen auf Eis bei 4 & Grad; C über Nacht, dann aliquot 150 &mu; l in separate Röhrchen und bei -20&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>IWR-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0161</td><td>10 mM Stamm erzeugen und aliquotieren. Bei -20 Grad lagern; C</td></tr><tr><td>Serum für Neugeborene</td><td>Life Technologies</td><td>16010159</td><td></td></tr><tr><td>nicht-enzymatisches Dissoziationsreagenz: Reagenz für sanfte Zelldissoziation</td><td>Stammzelltechnologien</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Im Kühlschrank aufbewahren</td></tr><tr><td>Y-27632 (ROCK-Inhibitor)</td><td>Stemgent</td><td>04-0012</td><td>Auf eine Stammkonzentration von 10 mM resuspendieren, aliquotieren und bei -20&nbsp; lagern &deg;C. Vermeiden Sie Frost-Tau-Zyklen.</td></tr><tr><td>Cell Sorting</td><td><>Company</td><td>Katalognummer</td><td><>Kommentare</strong</td></tr><tr><td>>4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid (DAPI)</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>CD90-FITC</td><td>BioLegend</td><td>328107</td><td></td></tr><tr><td>Reagenz für enzymatische Dissoziationen: Cell Detach Kit I (0,04 % Trypsin / 0,03 % EDTA, Trypsin-Neutralisationslösung und gepufferte Salzlösung von Hanks)</td><td>PromoCell</td><td>C-41200</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Atlanta Biologics</td><td>S11250</td><td></td></tr><tr><td>SIRP&alpha;-PE/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>323807</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Construction</td><td>Company</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td>0,25% Trypsin/0,1% EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-053-CI</td><td>Optional: Für die Entnahme von ergänzenden Zellen von Interesse</td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0275-100ML</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS Pakete</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen, Rind Typ I</td><td>Life Technologies</td><td>A10644-01</td><td>Keep on ice</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxan (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Sodium HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</strong</td></tr><tr><td>>1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0536757</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Polystyrol-Rundbodenröhrchen</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>Mit integriertem 35 μu; M Cell Sieb</td></tr><tr><td>50 ml Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte mit flachem Boden und mit Gewebekulturen behandelt</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Zellschaber, Einweg</td><td>Biologix</td><td>70-2180</td><td></td></tr><tr><td>Polysulfon</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytetrafluorethylen (Teflon)</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZ-61</td><td>Oder ähnliches, muss eine Halterung für die Hochgeschwindigkeitskamera haben, um</td></tr> das <tr><td>elektrische Schrittmachersystem</td><td>Astro-Med, Inc</td><td>Grass S88X Stimulator</td><td></td></tr><tr><td>High Speed zu befestigen Kamera</td><td>Pixelink</td><td>PL-B741U</td><td>Oder ähnlich, muss aber für eine genaue Datenerfassung 100 Bilder pro Sekunde erreichen</td></tr><tr><td>können Plattentemperaturregelung</td><td></td><td></td><td>Wird verwendet, um die Medientemperatur während der Datenerfassung aufrechtzuerhalten.</td></tr><tr><td>Custom Materials</td><td>Company</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>LabView Post-Tracking-Programm</td><td></td><td></td><td>auf Anfrage bei den Autoren erhältlich</td></tr></tbody></table>

bau von defined menschen engineered herzgewebe zur untersuchung mechanismen der herzzelltherapie

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Die Züchtung von humanem Herzgewebe kann die therapeutische Entdeckung grundlegend beeinflussen, indem neue speziesspezifische Screening-Systeme entwickelt werden, die die Biogenauigkeit des dreidimensionalen nativen menschlichen Myokards nachbilden, während sie gleichzeitig ein kontrolliertes Maß an biologischer Komplexität ermöglichen und eine zerstörungsfreie Längsüberwachung der kontraktilen Funktion des Gewebes ermöglichen. Ursprünglich wurde humantechnisch hergestelltes Herzgewebe (hECT) unter Verwendung der gesamten Zellpopulation hergestellt, die aus der gerichteten Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen gewonnen wurde, die typischerweise weniger als 50 % Kardiomyozyten ergaben. Um jedoch zuverlässige Vorhersagemodelle für das menschliche Myokard zu erstellen und die Mechanismen der heterozellulären Interaktion aufzuklären, ist es unerlässlich, die biologische Zusammensetzung in manipulierten Geweben genau zu kontrollieren. 
Um diese Einschränkung zu beheben, verwenden wir die Lebendzellsortierung für den kardialen Oberflächenmarker SIRPα und den Fibroblastenmarker CD90, um Gewebe zu erzeugen, die jeweils ein Verhältnis von 3:1 dieser Zelltypen enthalten, die dann miteinander vermischt und zu einer kollagenbasierten Matrixlösung hinzugefügt werden. Die resultierenden hEKTs sind somit sowohl in ihrer zellulären als auch in ihrer extrazellulären Matrixzusammensetzung vollständig definiert.
Hier beschreiben wir die Konstruktion definierter hECTs als Modellsystem zum Verständnis der Mechanismen von Zell-Zell-Interaktionen in Zelltherapien, am Beispiel von humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) aus dem Knochenmark, die derzeit in klinischen Studien am Menschen verwendet werden. Die definierte Gewebezusammensetzung ist unerlässlich, um zu verstehen, wie die hMSCs mit den endogenen kardialen Zelltypen interagieren können, um die Gewebefunktion zu verbessern. Beschrieben wird auch ein Bioreaktorsystem, das gleichzeitig sechs hEKTs parallel kultiviert, was eine effizientere Nutzung der Zellen nach der Sortierung ermöglicht.

Kardiomyozyten, eine leicht modifizierte Version der Boheler und Lian Differenzierung Methoden 30,31 verwendet zu erhalten. Es ist zwingend notwendig, dass die Differenzierung beginnt, während der log-Phase des Zellwachstums, aber auch, dass die Ausgangspopulation ausreichend konfluenten eine brauchbare Anzahl von Zellen nach dem Sortieren (ca. 75% ist optimal) zu erhalten. Typischerweise für H7 hESCs, in wesentlicher 8 Medien und 5% CO 2 -Inkubator pro Well einer 6-Well - Platte bei einer Dichte v...

Dieses Manuskript beschreibt die Erstellung von definiertem manipuliertem Herzgewebe unter Verwendung von Oberflächenmarker-Expression und Zellsortierung. Die definierten Gewebe können dann in einem Multigewebe-Bioreaktor verwendet werden, um Mechanismen der kardialen Zelltherapie zu untersuchen, um ein funktionsfähiges, aber dennoch kontrolliertes Modellsystem des menschlichen Herzens bereitzustellen.

Bau von Defined Menschen Engineered Herzgewebe zur Untersuchung Mechanismen der Herzzelltherapie

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, humanes engineeretes Herzgewebe mit einer definierten zellulären Zusammensetzung herzustellen. Diese Methode kann zentrale Herausforderungen im Bereich des Herzgewebe-Engineerings bewältigen, darunter die Kontrolle von Variabilität und Effizienz der kardialen Differenzierung sowie das Verständnis, wie spezifische Zelltypen die kontraktile Herzfunktion beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass das Endergebnis humanes engineeretes Herzgewebe mit kontrollierter und definierter Zusammensetzung ist.Wiederholungen dieser Technik weisen in Richtung einer Therapie für Herzerkrankungen, da definierte Gewebe eine neuartige, biologisch relevante und biomedizinische Testplattform bieten können, die in der Lage ist, therapeutische Maßnahmen zu bewerten. Obwohl diese Methode Einblicke in neuartige kardiale Therapeutika ermöglichen kann, lässt sich das humanes Gewebe umfassende kardiale Gewebesystem auch nutzen, um Mechanismen der kardialen Zelltherapie zu verstehen. Beginnen Sie mit Kulturen von aus humanen embryonalen Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und geben Sie ein Milliliter 0,04 %igem Trypsin-EDTA hinzu.Inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Während die Zellen inkubieren, geben Sie 12 Mikroliter ROCK-Inhibitor zu sechs Millilitern Trypsin-Neutralisationslösung. Entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und geben Sie je einen Milliliter der Neutralisationslösung in jedes Loch der sechslochigen Platte.Überführen Sie alle Zellen aus jedem Wells in ein einzelnes 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Waschen Sie alle sechs Wells mit einem Volumen von drei Milliliter PBS und kombinieren Sie diese Waschung mit den Zellen im Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um die Zellen zu pelletieren.Um die Zellen für die Sortierung lebender Zellen mittels FACS vorzubereiten, stellen Sie den Färbepuffer her, indem Sie fünf Milliliter FBS und 50 Mikroliter ROCK-Inhibitor zu 45 Milliliter PBS auf Eis hinzufügen. Entfernen Sie den Überstand von den pelletierten Zellen und resuspendieren Sie sie in 1,2 Milliliter Färbepuffer. Überführen Sie 200 Mikroliter der suspendierten Zellen in ein neues vorab gekühltes 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen auf Eis.Überführen Sie anschließend das verbleibende eine Milliliter der Zellsuspension in ein neues vorgekühltes 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen auf Eis und geben Sie zwei Mikroliter SIRP alpha-PE/Cy7- und vier Mikroliter CD90-FITC-Antikörper hinzu. Mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig mit einer Transferpipette und stellen Sie das Röhrchen auf Eis. Inkubieren Sie die beiden 50-Milliliter-Röhrchen, die die negative Kontrolle und die Probe enthalten, eine Stunde lang auf einem Schüttelrührer auf Eis bei vier Grad Celsius.Während die Zellen inkubiert werden, überführen Sie drei Milliliter Differenzierungsmedium 2 in jeweils zwei 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie dann drei Mikroliter ROCK-Inhibitor hinzu und lagern Sie diese FACS-Sammelröhrchen vor der Verwendung auf Eis. Anschließend pelletieren Sie die gefärbten Zellen bei 300 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Und waschen Sie sie zweimal mit 10 Milliliter eiskaltem PBS. Resuspendieren Sie das Probenpellet vorsichtig in ein bis drei Milliliter Färbe-Puffer, der DAPI enthält. Geben Sie 500 Mikroliter Färbe-Puffer ohne DAPI zum Pellet der Negativkontrolle hinzu.Filtern Sie beide Zellsuspensionen durch einen 40-Mikrometer-Zellsieb, um Zellklumpen zu entfernen, und überführen Sie sie anschließend in Polystyrol-FACS-Röhrchen auf Eis. Bringen Sie die Proben unverzüglich zum Zellsortierer. Beginnen Sie mit der negativen Färbekontrollprobe und legen Sie die Gating-Parameter fest.Dann, während der Analyse der Probenzellen, die Population der lebenden Zellen, die negativ für DAPI sind, auswählen. Sammeln Sie die FITC-positiven und die PE/Cy7-positiven Zellpopulationen jeweils unabhängig bei 20 PSI. Nach dem Kultivieren und erneuten Aggregieren der Zellen gemäß dem schriftlichen Protokoll die Zellkulturschalen aus dem Inkubator nehmen und das Medium in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen.Spülen Sie die Platten mit drei Milliliter PBS und überführen Sie die Waschflüssigkeit in denselben 50-Milliliter-Zentrifugenrohr. Geben Sie anschließend drei Milliliter 0,04 % Trypsin-EDTA zu den Platten hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Untersuchen Sie nach fünf Minuten die Platten unter dem Mikroskop auf Zellablösung. Nachdem alle Zellen sich gelöst haben, drei Milliliter Trypsin-Neutralisationslösung zu den Platten hinzufügen. Vorsichtig mischen und die Zellen in das ursprüngliche 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen. Die Platten mit fünf Millilitern PBS waschen und diese Waschung ebenfalls zum Röhrchen hinzufügen.Die Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für fünf Minuten bei Raumtemperatur pelletieren. Das Überstand entfernen und das Pellet in einem Milliliter neugeborenen Rinderserum oder NBS-Medium resuspendieren. Anschließend die Zellen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 × g für fünf Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand. Um die Herstellung der sechs modifizierten kardialen Gewebe zu beginnen, verdünnen Sie 60,0 µL der Kollagen-Stammlösung mit 5 mg/mL auf 3,125 mg/mL durch Zugabe von 1,5 µL einer einmolaren Natriumhydroxid-Lösung, 9,6 µL 10× PBS und 24,9 µL sterilem, ultrareinem Wasser. Dabei ist es entscheidend, die Bildung von Luftblasen in der Kollagenmischung zu vermeiden, da sich Luftblasen nur langsam aus der viskosen Lösung lösen und die Gewebebildung während der Gewebekompaktion stören können.Pipettieren Sie an der Seite des 15-Milliliter-Röhrchens 12,0 Mikroliter 10X MEM und 0,2 normale HEPES bei pH 9 hinzu, um die Kollagenmischung zu verdünnen. Geben Sie dann die Basalmembran-Matrix zur Kollagenmischung, um eine Endkonzentration von 0,9 Milligramm pro Milliliter zu erreichen, und mischen Sie vorsichtig. Lagern Sie diese endgültige Gewebemischung auf Eis.Überführen Sie anschließend die gesamte Gewebemischung auf das Zellpellet und geben Sie zusätzliche Zellen hinzu, wie im textlichen Protokoll angegeben. Füllen Sie das Röhrchen mit zellfreiem NBS-Medium auf ein Endvolumen von 150 Mikrolitern auf und mischen Sie vorsichtig. Pipettieren Sie vorsichtig jeweils 25 Mikroliter der Zellsuspension in jedes der sechs Löcher in der Basisplatte des Bioreaktors.Wiederholen Sie den Mischvorgang zwischen jedem Well, um eventuell abgesetzte Zellen erneut aufzuschwemmen. Pipettieren Sie jeweils nur ein Gewebe pro Well, um ein konsistentes Volumen und eine gleichbleibende Zellzahl pro Gewebe zu gewährleisten. Drücken Sie separat zwei Reihen aus Polydimethylsiloxan (PDMS) bestehende Kraftsensoren auf beiden Seiten des Polysulfon-Rahmens an, um sechs Paare gegenüberliegender Säulen zu bilden.Drehen Sie den Rahmen auf der Grundplatte um, sodass ein Paar Pfosten in jedes Gefäß mit der Zellsuspension eintaucht. Setzen Sie dann den Bioreaktor in eine 60-Millimeter-Schale ein und stellen Sie diese Schale ohne Deckel in eine 10-Zentimeter-Schale. Setzen Sie den Deckel auf die 10-Zentimeter-Schale und bringen Sie die gesamte Bioreaktor-Anordnung in den Zellkultur-Inkubator.Nach zwei Stunden der Inkubation die Bioreaktorbaugruppe entfernen und 14 Milliliter NBS-Medium hinzufügen, um die Basisplatte zu bedecken. Den Bioreaktor zurück in den Zellkulturschrank stellen und täglich die Hälfte des Mediums wechseln. Nach 48 Stunden die Basisplatte vorsichtig um jeweils einige Millimeter anheben.Bringen Sie dann den Bioreaktor mit dem Gewebe nach unten in das Medium zurück. Falls ein Gewebe beim Entfernen der Basisplatte von einem Pfosten abfällt, befestigen Sie es vorsichtig erneut am Pfosten. Die Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen führt zu einer gemischten Kultur aus hauptsächlich Kardiomyozyten und Fibroblasten, die sich zu Aggregaten organisieren und im gesamten Gefäß kräftig schlagende Netzwerke bilden.Die FACS-Analyse dieser Kulturen zeigte, dass dieses Differenzierungsverfahren eine Population ergibt, die mindestens 65 % SIRP-alpha-positive Zellen und 10 % CD90-positive Zellen enthält. Nach Entfernung der Basisplatte können die humanen, gewebetechnisch hergestellten Herzmuskeln, oder HECTs, innerhalb des Bioreaktors selbstständig assemblieren. Ausgereifte und verdichtete HECTs lenken die integrierten Kraftsensoren sichtbar mit einer durchschnittlichen Kraft von fünf bis 15 Mikronewton ab.Die Messung der Zuckungskraft zeigt, wie isolierte Variablen die kontraktile Kraft in diesen definierten, technisch hergestellten Geweben verändern. Hier wird beobachtet, dass die Zugabe von 10 % menschlichen mesenchymalen Stammzellen eine deutliche Steigerung der kontraktilen Kraft bei beiden Stimulationsfrequenzen, ein Hertz und zwei Hertz, bewirkt. Sobald die Methoden beherrscht sind, dauert die Differenzierung etwa 20 Tage, die Zellsortierung etwa fünf Stunden und die Gewebekonstruktion etwa drei Stunden.Weitere sieben Tage sind nach der Herstellung für eine angemessene Gewebebildung erforderlich. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Zellmarkierung und die Zugabe weiterer Zellen zum Gewebegemisch durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den Auswirkungen spezifischer Zell-Zell-Interaktionen zu beantworten oder die Mechanismen der Zelltherapie zu untersuchen. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man humanes, technisch erzeugtes Herzmuskelgewebe mit einer bekannten und kontrollierbaren zellulären Zusammensetzung herstellt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Die Erzeugung von ausgerichteten Myokardgewebe ist eine wesentliche Voraussetzung für die Anpassung der jüngsten Fortschritte in der Stammzellbiologie, um klinisch nützliche Zwecke. Hier beschreiben wir einen Mikrokontaktdruck Ansatz für die präzise Steuerung der Zelle Form und Funktion. Mit hoch gereinigte Populationen von embryonalen Stammzellen abgeleitete kardiale Vorläuferzellen, wir erzeugen dann anisotropen funktionale Herzmuskelgewebe.

Generation Ausgerichtet Functional Myokardgewebe Durch Mikrokontaktdrucken

Hier zeigen wir die Herstellung von humanen konstruierte Herzgewebe aus induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) abgeleitetes Kardiomyozyten. Wir stellen eine Methode Kontraktionskraft und beispielhafte Veränderung der Kontraktionsmuster durch den hERG-Kanal-Hemmer E-4031 zu analysieren. Dieses Verfahren zeigt hohe Robustheit und die Eignung für das Herz Wirkstoff-Screening.

Automatische Kontraktions Analyse menschlicher Engineered Herzgewebe für Herz Drug Safety Screening

Dieses Protokoll beschreibt eine net Schimmel basierende Methode um dreidimensionale Gerüst-freie kardialen Gewebe mit zufriedenstellenden Strukturintegrität und synchron schlagen Verhalten zu erstellen.

Eine Net Schimmel basierende Methode der dreidimensionalen Gerüst-freie Herzgewebe Schöpfung

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zum Schneiden und Kultivieren menschlicher Herzscheiben für präklinische Arzneimitteltests und beschreibt die Verwendung von optischen Kartierungen zur gleichzeitigen Aufzeichnung von Transmembranspannung und intrazellulären Calciumsignalen aus diesen Scheiben.

Präklinische Kardiale Elektrophysiologie Bewertung durch Dual Voltage und Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Das vorliegende Protokoll erzeugt netzförmige stämmige Herzgewebe, das kardiovaskuläre Zellen enthält, die aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden, um die Untersuchung der Zellimplantationstherapie für Herzkrankheiten zu ermöglichen.

Vorbereitung von Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues derived from Human iPS Cells for In Vivo Myokard repair

Hier beschreiben wir eine einfach zu bedienende Methodik zur Erzeugung von 3D-selbstorganisierten kardialen Mikrogewebe-Arrays, die aus vordifferenzierten humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten, Herzfibroblasten und Endothelzellen bestehen. Diese benutzerfreundliche und zellarme Technik zur Erzeugung kardialer Mikrogewebe kann für die Krankheitsmodellierung und frühe Stadien der Arzneimittelentwicklung implementiert werden.

Herstellung von 3D-Cardiac Microtissue Arrays unter Verwendung von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten, kardialen Fibroblasten und Endothelzellen

Dieses Protokoll zielt darauf ab, 3D-Herzsphäroide (CSs) zu fabrizieren, indem Zellen in hängenden Tropfen mitgebaut werden. Kollagen-eingebettete CS werden mit Doxorubicin (DOX, einem kardiotoxischen Mittel) in physiologischen Konzentrationen behandelt, um Herzinsuffizienz zu modellieren. In-vitro-Tests mit DOX-behandelten CS können verwendet werden, um neuartige Therapien für Herzinsuffizienz-Patienten zu identifizieren.

Herzsphäroide als in vitro bioengineered Herzgewebe zur Untersuchung der menschlichen Herzpathophysiologie

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Entwicklung eines dreidimensionalen (3D) mikrofluidischen Modells von hoch ausgerichtetem menschlichem Herzgewebe zu erklären und zu demonstrieren, das aus Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten besteht, die mit Herzfibroblasten (CFs) in einem biomimetischen, kollagenbasierten Hydrogel in Kokulturiert sind, für Anwendungen in der Kardgewebeentwicklung, im Arzneimittelscreening und in der Krankheitsmodellierung.

Entwicklung von 3D-organisiertem menschlichem Herzgewebe innerhalb einer mikrofluidischen Plattform

Hier wird eine Reihe von Protokollen für die Erzeugung und Kryokonservierung von kardialen Sphäroiden (CSs) aus humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten vorgestellt, die in einem multidimensionalen Hochdurchsatzformat kultiviert wurden. Dieses dreidimensionale Modell fungiert als robuste Plattform für die Modellierung von Krankheiten, Hochdurchsatz-Screenings und behält seine Funktionalität nach der Kryokonservierung bei.

Generierung, Hochdurchsatz-Screening und Biobanking von human-induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Herzsphäroiden

Dreidimensionale Herzgewebe, die mit aus Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten biotechnologisch hergestellt wurden, haben sich als vielversprechende Modelle für die Untersuchung von gesundem und krankem menschlichem Myokard in vitro erwiesen und gleichzeitig Schlüsselaspekte der nativen Herznische rekapituliert. Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Herstellung und Analyse von High-Content-Kardiomyozyten, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen erzeugt werden.

Entwicklung eines Bioreaktors zur Verbesserung der Datenerfassung und des Modelldurchsatzes von künstlich hergestelltem Herzgewebe

Es wird eine reproduzierbare Methode zur Erzeugung von 3D-Myokardgeweben vorgestellt, bei der MEW-Gerüste (Melt Electrospinning Writing), Polycaprolacton (PCL)-Gerüste und Fibrin-Hydrogele mit hiPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten und Fibroblasten kombiniert werden. Diese Technik bietet eine präzise Kontrolle über die Gerüstarchitektur und kann in präklinischen Arzneimitteltests und bei der Modellierung von Herzerkrankungen eingesetzt werden.

3D-Generierung von humanem Myokardgewebe mittels Schmelzelektrospinnen, Schreiben von Polycaprolacton-Gerüsten und hiPSC-abgeleiteten Herzzellen

Erfahren Sie die Herstellung definierter humaner Herzgewebe mittels Oberflächenmarker-Sortierung und Multigewebe-Bioreaktor. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Mechanismen der Herzzelltherapie und die Entwicklung neuartiger therapeutischer Ansätze.

Bau von Defined Menschen Engineered Herzgewebe zur Untersuchung Mechanismen der Herzzelltherapie

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