Abstimmung der Kontraktilität und des Verformungsmodus aktiver Aktin-basierter Anordnungen in vitro: Von zweidimensionalen aktiven Netzwerken bis hin zu Flüssigkristalltropfen

Diese Forschung konzentriert sich auf weiche biologische Materialien und zielt darauf ab, die zugrunde liegenden physikalischen Mechanismen zu erforschen, die Form und Organisation regulieren, sowie Materialien, die von biologischen Zellen inspiriert sind.

Biologische und In-vitro-Modellsysteme sind von Natur aus komplex mit vielen Fallstricken, und die Probenvorbereitung ist entscheidend für ihre Reproduzierbarkeit. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Reproduzierbarkeit in diesen Systemen zu verbessern.

Diese Ergebnisse ebnen den Weg, um Mechanismen zu erkennen, zu charakterisieren und die Funktion von physikalischen Kräften und Biomaterialien zu verstehen. Dies kann auf verschiedene Biopolymere und Organellen verallgemeinert werden.

[Erzähler] Bereiten Sie zunächst die zu ladende Probe vor, indem Sie fünf Mikroliter 10XF-Puffer in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben und ein Volumen deionisiertes destilliertes Wasser hinzufügen, so dass das endgültige Probenvolumen 50 Mikroliter beträgt, nachdem die restlichen Komponenten hinzugefügt wurden. Pipettieren Sie einen Mikroliter 25%iges Beta-Mercaptoethanol, einen Mikroliter 225 Milligramm pro Milliliter Glukose, einen Mikroliter einer Mischung aus Glukoseoxidase und 85.000 Einheiten pro Milliliter Katalysator in die Lösung. Fügen Sie dann einen Mikroliter 25 Millimolar ATP und 10 Mikroliter 2%, 15 Centipoise Methylcellulose hinzu und mischen Sie es gründlich durch Pipettieren. Um mit der Aktinpolymerisation zu beginnen, mischen Sie unmarkiertes Aktin mit markiertem Aktin und geben Sie die Aktinmischung in die vorbereitete F-Pufferlösung. Pipettieren Sie die Lösung auf und ab, um eine ordnungsgemäße Mischung zu gewährleisten. Lassen Sie das Aktin bei Raumtemperatur im Mikrozentrifugenröhrchen polymerisieren. Um eine Durchflusszelle vorzubereiten, legen Sie als Nächstes zwei Stücke doppelseitiges Klebeband parallel zueinander über die Breite des Objektträgers, um die Grenzen des Durchflusszellenkanals zu bilden. Positionieren Sie das Deckglas über dem Bandkanal und stellen Sie sicher, dass es senkrecht zum Objektträger steht. Drücken Sie auf den Bereich des Deckglases, der mit dem doppelseitigen Klebeband in Kontakt kommt, um eine gute Abdichtung zu erzielen und Lufteinschlüsse zu vermeiden. Schneiden Sie mit einer Rasierklinge überschüssiges Klebeband vom Objektträger und Deckglas ab, so dass sich das einzige sichtbare Klebeband im Probenkanal befindet. Um eine Zylinderprobenkammer für zwei Deplanerproben vorzubereiten, spülen Sie zunächst den Deckglas mit Ethanol, Wasser und Ethanol aus. Trocknen Sie es mit gefilterter Luft. Tragen Sie eine dünne Schicht fünfminütiges Epoxidharz auf, um den Glasklonzylinder auf dem Deckglas zu haften. Geben Sie 3,5 Mikroliter Öltensidlösung in ein transparentes oder helles Mikrozentrifugenröhrchen. Pipettieren Sie ohne Mischen fünf Mikroliter der Aktinlösung auf die Oberseite der Öltensidschicht. Schließen Sie die Tube. Halten Sie die Oberseite des Mikrozentrifugenröhrchens fest und schnippen Sie mit der unteren Kante, um einen ersten Schaum mit sichtbarer Emulsion zu bilden, und fahren Sie mit dem Schnippen fort, bis sich gleichmäßige Mikroemulsionen bilden. Mischen Sie vor dem Beladen der Durchflusszelle eine kleine Menge von fünf Minuten Epoxidharz. Um eine Durchflusszelle zu beladen, pipettieren Sie ein bis drei Mikroliter Öltensidlösung in den Probenkanal der Durchflusszelle, um einen kleinen Stopfen zu erzeugen, der den Kanal benetzt. Kippen Sie die Durchflusszelle, um einen Luftspalt zu entfernen, der sich durch den zurückweichenden Öltensidmeniskus bildet, bevor Sie die Probe hinzufügen. Pipettieren Sie die Emulsionssuspension der Probenlösung sofort in den Eingang der Durchflusszelle, um den Kanal zu füllen. Versiegeln Sie jede Seite des Durchflusszellenkanals mit fünf Minuten Epoxidharz. Um die Zylinderprobenkammer für Nicht-Emulsionsproben zu befüllen, pipettieren Sie fünf Mikroliter Öltensidlösung in den Boden der Glaszylinderkammer. Kippen und drehen Sie den Deckglas, um die Oberfläche und den unteren Zylinder mit der Tensidlösung zu beschichten. Entfernen Sie überschüssige Öltensidlösung mit einer Pipette, um eine dünne Schicht zu erhalten und gleichzeitig eine vollständige Verdunstung des Öls zu verhindern. Geben Sie die Probenlösung sofort in die Kammer. Decken Sie die Kammer mit einem kleinen Stück Polytetrafluorethylen oder PTFE-Band ab, um Verdunstung und Durchfluss zu verhindern. Montieren Sie die Probe auf dem Mikroskoptisch. Starten Sie die Zeitraffer-Bildgebung von Aktin mit einem 20x-, 40x-, 60x- oder 100x-Objektiv mit Öl- oder Wasserimmersion, um eine ausreichend hohe numerische Apertur für hochauflösende Bildgebung zu gewährleisten. Wenn Sie in einer Probenkammer polymerisieren, lassen Sie die Polymerisation etwa 30 Minuten lang oder bis keine sichtbare Filamentverlängerung oder Bewegung mehr auftritt. Fügen Sie der Probe einen Vernetzer hinzu und fügen Sie dann Myosin als vorpolymerisierte Filamente hinzu, indem Sie langsam etwa die Hälfte des Gesamtvolumens in die Probe pipettieren. Starten Sie abschließend das Zeitraffer-Imaging. Hier ist das repräsentative konfokale Fluoreszenzbild des verschränkten Aktin-Netzwerks zu sehen. Das verschränkte Aktin-Netzwerk ist gleichmäßig über die Oberfläche verteilt. Helle Flecken in diesem Bild stellen Filamentüberlappungen dar, während dunkle Bereiche auf ein minimales Vorhandensein von Aktin hinweisen. Thermische Fluktuationen führen zu lokalen Intensitätsänderungen und sichtbarer Biegung der Aktinfilamente. Die Zugabe von Myosin II bewirkt eine Biegung und Reorganisation des Aktinnetzwerks mit sichtbarer Akkumulation von Myosin puncta über lange Zeiträume. Die Netzwerkkontraktion hängt von der Myosinkonzentration und der ATP-Konzentration ab. In vernetzten Aktinnetzwerken führt die Myosin-induzierte Kontraktion zu einer koordinierten Bewegung über längere Längenskalen im Vergleich zu verschränkten Netzwerken.