Verwendung von Mikrofluidik und Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung der Montagedynamik von einzelnen Actin-Filamenten und -Bündeln

Wir kombinieren Fluoreszenzmikroskopie mit Mikrofluidik, um zu untersuchen, wie Aktin-bindende Proteine den Auf- und Abbau von Aktinfilamenten regulieren. Mit der Mikrofluidik sind wir in der Lage, Reaktionen an Dutzenden von einzelnen Aktinfilamenten gleichzeitig zu quantifizieren und gleichzeitig die biochemischen und mechanischen Bedingungen präzise zu kontrollieren. Denken Sie daran, dass Lösungen zuerst parallel injiziert werden, bis sie die Kammer erreichen, und dann Filamente nacheinander jeder Lösung ausgesetzt werden, indem die Druckeinstellung geändert wird.

Um mit der Herstellung der Polydimethylsiloxan- oder PDMS-Kammermontage zu beginnen, heizen Sie die Heizplatte auf 100 Grad Celsius vor. Setzen Sie eine gereinigte PDMS-Kammer und einen Glasdeckel in einer sauberen Petrischale drei bis fünf Minuten lang in einem tiefen UV-Reiniger ultraviolettem Licht aus. Wenn Sie fertig sind, positionieren Sie die PDMS-Kammer über dem Deckglas so, dass die beiden Oberflächen, die direkt UV ausgesetzt sind, in Kontakt gebracht werden.

Um Luftblasen zu entfernen, die an der PDMS-Abdeckungsschlupfschnittstelle eingeschlossen sind, drücken Sie vorsichtig mit einem Finger auf die Oberfläche der Kammer. Drücken Sie stark über Ecken und Seiten, um sicherzustellen, dass die Decke der Kammer nicht mit der Glasoberfläche in Berührung kommt. Stellen Sie die Kammer mit dem Glasboden zur heißen Platte bei 100 Grad Celsius für fünf Minuten.

Verwenden Sie die Kammer dann sofort oder bewahren Sie sie eine Woche lang in einer sauberen Petrischale auf. Um den Ein- und Auslassschlauch zu spülen, füllen Sie ein 2-Milliliter-Reservoirrohr mit 300 Mikrolitern F-Puffer, schrauben Sie es auf den Mikrofluidikhalter und stellen Sie den Druck auf 300 Millibar ein. Lassen Sie fünf bis acht Tropfen F-Puffer verschwenden, stellen Sie dann den Druck auf Null ein und wiederholen Sie den Vorgang für jeden Kanal.

Als nächstes stellen Sie den Druck für den Auslass auf dem Reservoirrohr vier bis 50 Millibar ein, sobald ein Tröpfchen aus der Schlauchspitze austritt, schließen Sie den Schlauch an den Auslass der PDMS-Kammer an. Wenn die Flüssigkeit die Kammer füllt und aus allen Einlässen kommt, stellen Sie den Ausgangsdruck auf 20 Millibar ein. Stellen Sie später den Druck für das Reservoirrohr auf 1 bis 50 Millibar ein.

Um das Einbringen von Luftblasen zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass ein Tröpfchen aus dem Schlauch und dem PDMS-Einlass kommt, bevor Sie den Schlauch an den Einlass anschließen. Stellen Sie den Druck des Einlasses auf 30 Millibar ein. Nachdem Sie die Einlässe zwei und drei wie gezeigt angeschlossen haben, stellen Sie den Druck aller Einlässe auf 20 Millibar und den Ausgangsdruck auf null Millibar ein.

Stellen Sie sicher, dass die Durchflussraten in den Einlässen ungefähr gleich sind. Stellen Sie beim Wechsel des Behälters alle Eingangsdrücke auf 12 Millibar und den Ausgangsdruck auf 5 Millibar ein. Um eine Lösung schnell zu injizieren, stellen Sie den Druck des entsprechenden Einlasses auf 150 Millibar ein und stellen Sie den Druck in den anderen Einlässen auf etwa 100 Millibar ein, so dass die resultierende Durchflussrate in den Einlässen 500 Nanoliter pro Minute beträgt.

Um die Lösung zu wechseln, füllen Sie 200 bis 300 Mikroliter der Lösung in ein neues Reservoirrohr und stellen Sie den Druck auf die Änderungseinstellung ein. Schrauben Sie dann das Reservoirrohr des Einlasses ab. Sobald sich an der Schlauchspitze ein kleiner Tröpfchen gebildet hat, schrauben Sie das neue Rohr mit der frischen Lösung ein und ändern Sie die Druckeinstellung auf hohen Durchfluss.

Abhängig von der mikrofluidischen Konfiguration und einer Kammergeometrie warten Sie drei bis fünf Minuten, bis die Lösung den Schlauch gefüllt und die Kammer erreicht hat. Dem Prozess kann gefolgt werden, indem die Zunahme der Fluoreszenz im Laufe der Zeit gemessen wird. Für die Oberflächenfunktionalisierung wechseln Sie die Lösung drei auf 200 Mikroliter 50 picomolare Spektrin-Aktin-Samen in F-Puffer und injizieren Sie die Lösung für zwei Minuten mit hohem Durchfluss drei.

Für die Oberflächenpassivierung wechseln Sie Rohr drei mit 300 Mikrolitern 5% BSA im F-Puffer, dann injizieren Sie für fünf Minuten bei hohem Durchfluss drei, gefolgt von fünf Minuten bei mittlerem Durchfluss drei, mit reduziertem Druck von sieben bis acht Millibar in den Kanälen eins und zwei, um einen Gegenstrom von 100 Nanolitern pro Minute zu erhalten. Die gesamte Kammerfläche wird BSA-passiviert. Wechseln Sie Rohr drei in F-Puffer, um den Kanal fünf Minuten lang bei hohem Durchfluss drei zu spülen.

Später wechseln Sie die Röhrchen ein bis drei mit einem mikromolaren Aktinprofilin, 0,15 mikromolaren Aktin bzw. F-Puffer, wie im Manuskript erläutert, und injizieren Sie frisch zubereitete Lösungen mit dem hohen Durchfluss, der alle für drei bis vier Minuten voreingestellt ist. Schalten Sie das Mikroskop ein und stellen Sie die Belichtungszeit der Kamera auf 100 bis 200 Millisekunden, den Anregungslaser auf 10 bis 20% Leistung und die interne Totalreflexionsfluoreszenz oder TIRF-Tiefe auf 200 bis 300 Nanometer ein, um die Bilder mit einem 60-fachen Objektiv aufzunehmen. Stellen Sie als Nächstes die Druckeinstellung für 10 Minuten auf Mid Flow eins ein, um die Filamentpolymerisation mit einer Rate von einem Frame alle 20 Sekunden aufzuzeichnen, gefolgt von Mid Flow Two für 15 Minuten für die Filamentalterung.

Erfassen Sie die Depolymerisation im Epifluoreszenzmodus bei einem Frame alle fünf Sekunden, nach ein bis zwei Frames, wechseln Sie zu Mid Flow drei, um Filamente aufzuzeichnen, die mit etwa 10 Untereinheiten pro Sekunde depolymerisiert werden. Um das Experiment zurückzusetzen, brechen Sie alle fluoreszierend markierten Filamente, indem Sie sie zwei Minuten lang kontinuierlich mit maximaler Leistung dem Laser aussetzen. Testen Sie verschiedene Bedingungen, indem Sie die Lösungen eins, zwei oder drei wechseln und sie drei bis vier Minuten lang bei hohem Durchfluss injizieren.

Das Ergebnis des grundlegenden Polymerisations-/Depolymerisationsexperiments wird hier vorgestellt. Die resultierenden Kymographen wurden verwendet, um die Polymerisations- und Depolymerisationsraten zu quantifizieren. Wenn die gezüchteten Aktinfilamente einer fluoreszierend markierten Cofilinlösung ausgesetzt wurden, wurden Cofilin-Cluster gekeimt und wuchsen zu den spitzen und mit Widerhaken versehenen Enden.

Wenn einzelne Filamente Faszin ausgesetzt werden, bilden sie Bündel, die heller erscheinen und nicht perfekt auf den Fluss ausgerichtet sind. Es ist sehr wichtig, beim Schlauchwechsel keine Luftblasen in das System einzubringen und darauf zu achten, dass die Behälterrohre nicht leer werden. Diese Technik war entscheidend, um Zugkräfte auf Dutzende von einzelnen Filamenten anzuwenden, die mechanische Empfindlichkeit von Formin und Cofilin sowie die ARP2/3-Abzweigung zu betrachten.