Entwicklung eines mikrofluidikbasierten Ansatzes zur Untersuchung der Mikrotubuli-Polymermechanik

Mikrotubuli sind Polymere des Zytoskeletts, die eine wesentliche Rolle bei der Zellteilung und dem intrazellulären Transport spielen. In dieser Studie verwenden wir Mikrofluidik, um die Mikrotubuli-Mechanik in vitro zu untersuchen. Diese Arbeit befasst sich mit zwei spezifischen Einschränkungen für die Untersuchung von Mikrotubuli in mikrofluidischen Geräten: dem Potenzial für Luftblasen, die Proteine denaturieren können, und der fehlenden Verwendung von Hochdurchsatz-Assays. Unser mikrofluidisches Gerät und Protokoll ermöglichen eine Reihe von Versuchsaufbauten mit robusteren Hochdurchsatz-Testmöglichkeiten als unsere bisherigen Durchflusszellen-Assays.

[Dozent] Zu Beginn reinigen Sie einen drei Zoll großen Siliziumwafer fünf Minuten lang unter Vakuum mit Sauerstoff oder sauberem Trockenluftplasma. Stellen Sie sicher, dass der Unterdruckdruck unter fünf mal zehn hoch minus fünf Torr liegt. Zentrieren Sie den sauberen Siliziumwafer auf dem Spin-Coder für die Fotolackabscheidung und legen Sie ein bis zwei Milliliter SPR 227.0 Fotolack auf die Mitte des Siliziumwafers. Schleudern Sie den Fotolack, um eine 13 Mikrometer dicke Schicht bei 1000 Umdrehungen pro Minute für 30 Sekunden zu erhalten. Unter Minimierung des Kontakts mit der beschichteten Oberfläche wird der Siliziumwafer auf eine auf 70 Grad Celsius eingestellte Heizplatte übertragen. Inkubieren Sie den Siliziumwafer auf der Heizplatte und erhöhen Sie die Temperatur alle drei bis fünf Minuten um 10 Grad Celsius, bis die Temperatur 115 Grad Celsius erreicht. Schalten Sie dann die Heizplatte aus und lassen Sie den Siliziumwafer abkühlen, bis seine Temperatur unter 65 Grad Celsius liegt. Übertragen Sie den abgekühlten Wafer mit einer Pinzette auf den Masken-Aligner. Laden Sie sowohl den Siliziumwafer als auch die entsprechende Fotomaske gemäß den hersteller- oder standortspezifischen Protokollen in den Aligner und setzen Sie den Wafer nun ultravioletter Strahlung mit einer Energie von etwa 400 Millijoule pro Quadratzentimeter aus. Berechnen Sie die erforderliche Expositionszeit anhand der Formel. Tauchen Sie den Wafer nach der Rehydrierung und Wärmebehandlung in den entsprechenden Entwickler. Spülen Sie dann beide Seiten des Wafers vorsichtig 30 Sekunden lang mit entionisiertem Wasser ab. Nachdem der entwickelte Wafer mit Stickstoffgas getrocknet wurde, wird er in einen Exsikkator überführt. Stellen Sie einen kleinen Aluminiumbehälter in den Exsikkator und geben Sie einen Tropfen Silan in den Aluminiumbehälter. Nach der Trocknung gießen Sie das gemischte und entgaste Polydimethylsiloxan in die Urform in einer Petrischale. Inkubieren Sie das Gericht über Nacht bei 65 Grad Celsius, damit PDMS vollständig aushärten kann. Verwenden Sie ein Skalpell oder eine Rasierklinge, um rechteckige PDMS-Stücke aus der Master-Schicht auszuschneiden. Stellen Sie sicher, dass jedes Stück über ausreichend Flankenraum verfügt, um einen ordnungsgemäßen Klebekontakt zu ermöglichen, und passen Sie auf einen 22 x 22 Millimeter großen Glasdeckglas. Platzieren Sie das PDMS auf einer Ersatz-PDMS-Opferschicht und vermeiden Sie harte Oberflächen. Machen Sie dann mit einem sauberen 1,5-Millimeter-Locher Einlass- und Auslasslöcher in jedes PDMS-Stück. Nehmen Sie nun einen 22 x 22 Millimeter großen Glasdecker und reinigen Sie ihn mit einem mit Isopropylalkohol getränkten Tuch. Reinigen Sie dann den Glasdeckel fünf Minuten lang unter Vakuum mit sauberem, trockenem Luftplasma mit Plasma. Wischen Sie sowohl den Glasdeckglas als auch die Funktionsseite des PDMS mit Isopropylalkohol-Tüchern ab, bevor Sie beide in den Plasmareiniger geben, und reinigen Sie sie gleichzeitig 30 Sekunden lang unter Vakuum mit sauberem, trockenem Luftplasma im Plasma. Kehren Sie das PDMS nach der Reinigung so um, dass die Feature-Seite nach unten zeigt. Platzieren Sie das PDMS auf dem Glasdeckglas und drücken Sie es leicht an, um die Verklebung zu fördern. Stabilisierte Mikrotubuli-Verlängerungen wurden durch fließende Pufferlösung senkrecht zu ihrer Wachstumsrichtung gebogen, was die Fähigkeit demonstriert, eine gerichtete Kraft innerhalb des Geräts auszuüben. Die oberflächennahe Strömungsgeschwindigkeit der Mikrotubuli wurde mit 92 Mikrometern pro Sekunde unter Verwendung von Simulation und analytischer Modellierung auf der Grundlage der Navier-Stokes-Gleichung berechnet. Computergestützte Simulationen zeigten die Etablierung stabiler Gradienten im gesamten Gerät, die experimentell durch einen Fluoreszenzfarbstoff bestätigt wurden, der vorhersagbare Konzentrationsmuster zeigte. Dual-markierte Mikrotubuli-Erweiterungen, bestätigte gradientenbasierte Partitionierung mit verschiedenen fluoreszierenden Proteinen, die in unterschiedlichen räumlichen Zonen entlang des Geräts dominieren.