Name: Entwicklung eines mikrofluidikbasierten Ansatzes zur Untersuchung der Mikrotubuli-Polymermechanik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Erfahren Sie, wie ein mikrofluidikbasierter Ansatz die Mechanik von Mikrotubuli in vitro untersucht. Diese Methode ermöglicht robuste Hochdurchsatz-Tests und vermeidet Probleme wie Luftblasenbildung bei der Analyse zytoskelettaler Dynamik.

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Die Mikrofluidik ermöglicht die präzise Steuerung winziger Flüssigkeitsvolumina, oft weniger als ein Mikroliter, durch das komplizierte Design und die Herstellung von Strömungskanälen 1,2. Der kleine Maßstab der mikrofluidischen Geräte führt zu einzigartigen technischen Phänomenen. Die Reynolds-Zahl - ein dimensionsloses Maß für das Verhältnis zwischen Trägheits- und viskosen Kräften in der Fluidströmung - ist nämlich klein, typischerweise in der Größenordnung von O(10) oder niedriger in der Mikrofluidik, was die Bedeutung viskoser Kräfte in mikrofluidischen Geräten unterstreicht. Darüber hinaus zeigt die Péclet-Zahl, die den konvektiven mit dem diffusiven Transport vergleicht, dass der konvektive Transport in der Mikrofluidik im Allgemeinen vernachlässigbar ist 3,4,5. Dieses diffusionsgetriebene, laminare Strömungsregime in der Mikrofluidik ist vorteilhaft, da es parallele Experimente auf einem einzigen Gerät unterstützt, indem es präzise Fluidgradienten beibehält.
Die Photolithographie ist nach wie vor die primäre Methode zur Herstellung mikrofluidischer Bauelemente 6,7,8. Kurz gesagt, beinhaltet dieser Prozess die Erstellung einer "Master"-Ätzschablone des mikrofluidischen Designs (Abbildung 1). Ein lichtempfindliches Substrat wird hergestellt, und eine Photomaske im mikrofluidischen Design belichtet selektiv Bereiche des Fotolacks mit ultravioletter Strahlung. Nachfolgende Ätzverfahren entwickeln das Substrat und erzeugen ein Relief des Designs. Polydimethylsiloxan (PDMS) wird häufig auf den Master gegossen und ausgehärtet. Das ausgehärtete PDMS, das die negativen Merkmale des Designs übernimmt, wird dann vom Master entfernt und mit einem Glasdeckglas verklebt. Dieser gesamte Herstellungsprozess dauert in der Regel 1-2 Tage, was schnelle Design-Iterationen und die Produktion mehrerer Geräte ermöglicht. Detaillierte Übersichten über weiche Lithographie und Mikrofabrikationsprozesse sind in anderen Referenzenverfügbar: 1,2,3,10,11,12,13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68185/68185fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Überblick über das traditionelle Photolithographieverfahren und das Mikrofabrikationsverfahren. (A) Traditionelles Fotolithographieverfahren und (B) Mikrofabrikationsverfahren. Abhängig von der Anwendung und den gewünschten Eigenschaften des Fotolacks kann ein negativer oder ein positiver Fotolack verwendet werden, obwohl sie das gleiche Design-Master ergeben. Eigenschaften wie die gewünschte Merkmalshöhe oder die Schmelztemperatur des Fotolacks helfen bei der Bestimmung des geeigneten Fotolacktyps. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Rogers (2022)14 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68185/68185fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Der Einsatz der Mikrofluidik hat die Möglichkeiten in vielen Forschungsbereichen erweitert, zuletzt in den Biowissenschaften. Aufgrund ihres geringen Maßstabs ermöglicht die Mikrofluidik die präzise Verwaltung begrenzter, wertvoller Ressourcen wie Zellen oder Proteine. Noch wichtiger ist die Abstimmbarkeit mikrofluidischer Systeme, um physiologische Bedingungen nachzuahmen, wie z. B. Änderungen der Substratsteifigkeit, die Kraftausübung auf eine Probe und sogar die Integration von elektrischem Strom. Darüber hinaus bietet der Einsatz von Mikrofluidik die Möglichkeit, mehrere Reagenzien parallel zu manipulieren und Systemdesigns schnell zu prototypisieren und iterativ zu verfeinern. Diese Funktionen ermöglichen die Miniaturisierung ganzer Laborabläufe auf einem einzigen Gerät, das allgemein als "Lab-on-a-Chip" bezeichnet wird1,6,9,15,16,17,18,19.
Eine der zellbiologischen Anwendungen der Mikrofluidik ist die Untersuchung von Mikrotubuli-Polymeren. Mikrotubuli sind ein wesentlicher Bestandteil des Zellskeletts und spielen eine wichtige Rolle bei Prozessen wie der Zellteilung und dem intrazellulären Frachttransport20,21. Als steifstes Element des Zytoskeletts weisen Mikrotubuli einen Elastizitätsmodul auf, der mit dem von Plexiglas vergleichbarist 22,23. Ihre robusten mechanischen Eigenschaften sind entscheidend für verschiedene zelluläre Funktionen, wie z. B. die Kontraktion von Kardiomyozyten, bei der sie sich während der systolischen und diastolischen Phase des Herzens zyklisch biegen und entspannen24. Mikrofluidische Geräte wurden bisher eingesetzt, um die Eigenschaften von Mikrotubuli und ihre Strukturen höherer Ordnung in vitro zu untersuchen. In der Tat wurde die Mikrofluidik verwendet, um die Polymerisationsdynamik von Mikrotubuli, Mikrotubuli-Mikrotubuli-Wechselwirkungen und die Auswirkungen von Mikrotubuli-assoziierten Proteinen auf die mechanischen Eigenschaften von Mikrotubuli zu untersuchen 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41.
Während die Einführung der Mikrofluidik in den Bereich der Mikrotubuli viele aufregende Entdeckungen hervorgebracht hat, gibt es noch Raum für Verbesserungen bei der Adaption dieser Geräte für die Mikrotubuli-Forschung. In dieser Arbeit befassen wir uns mit zwei spezifischen Einschränkungen, die bei der Untersuchung von Mikrotubuli in mikrofluidischen Geräten bestehen bleiben: das Potenzial für die Bildung von Luftblasen innerhalb des Geräts, das typischerweise durch manuelle Manipulation von mikrofluidischen Geräten entsteht, und die unzureichende Nutzung von Hochdurchsatz-Assays. Erstens können manuelle Manipulationen, wie z. B. das Verstopfen und Lösen von Schläuchen, zur Blasenbildung in den Kanälen führen. Die Bildung von Luftblasen in einer Durchflusszelle ist katastrophal, da Luftblasen Proteine denaturieren, Mikrotubuli-Polymere scheren und Zellkulturen beeinträchtigen können42,43. Darüber hinaus führen scharfe Ecken und schräge Winkel im Gerät zu einer ungleichmäßigen Oberflächenbenetzung, was die Möglichkeit von Lufteinschlüssen erhöht. Zahlreiche Techniken wurden entwickelt, um die Bildung, Persistenz und Auswirkungen von Luftblasen zu reduzieren. Die Verwendung von Methoden zur Blasenminderung ist jedoch nicht universell 42,43,44,45,46. Obwohl einer der Hauptvorteile der Mikrofluidik die Möglichkeit des Experimentierens mit hohem Durchsatz ist, wurde die Mikrofluidik bisher nicht zur Ausweitung der Mikrotubuli-Forschung eingesetzt. Mikrofluidische Geräte können so konzipiert werden, dass sie mehrere experimentelle Bedingungen parallel auf demselben Gerät testen. Zum Beispiel können Flüssigkeitsgradienten verwendet werden, um den Fluss verschiedener Mikrotubuli-assoziierter Proteine oder Wirkstoffe zu lenken und so ihre gezielte Abgabe an bestimmte Regionen partitionierter Mikrotubuli innerhalb desselben Geräts zu ermöglichen.
Hier haben wir iterativ ein mikrofluidisches Gerät entwickelt, das diese Einschränkungen behebt. Wir stellen das Schritt-für-Schritt-Protokoll der Herstellung des Geräts zur Verfügung und ermöglichen es so einem breiteren Publikum, die Mikrofluidik-Technologie in ihrer Mikrotubuli-Forschung einzusetzen. Dieses Gerätedesign verfügt über Blasenfangfunktionen und verwendet ein automatisiertes Durchflussregelungssystem, um manuelle Eingriffe zu reduzieren und gleichzeitig Lösungsgradienten im Gerät für Hochdurchsatzanalysen zu ermöglichen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Entwicklung dieses mikrofluidischen Designs die breitere Forschung und das Verständnis der Mikrotubuli-Mechanik erleichtern und gleichzeitig wertvolle Verbesserungen für experimentelle Designs im breiteren Bereich der Mikrotubuli-Forschung bieten kann.

<table><tbody><tr><td>0,6 mL Mikrozentrifugenröhrchen (klar)</td><td>Jede Marke</td><td></td> Typ <td>mit niedriger Retention wird bevorzugt</td></tr><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen (klar)</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Typ mit niedriger Retention wird bevorzugt</td></tr><tr><td>1,5 mm Standard-Biopsie-Stanze</td><td>Integra LifeSciences</td><td>33-31A-P/25</td><td></td></tr><tr><td>100x/1,49 TIRF-Objektiv mit numerischer Apertur</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm Glas Deckgläser</td><td>ThorLabs</td><td>CG15CH</td><td></td></tr><tr><td>3" einseitig polierte Siliziumwafer</td><td>Universitätswafer</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>4" Petrischale</td><td>Jede Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>450 & micro; L, Dünnwandiges, ultraklares Rohr mit offenem Oberteil</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>345843</td> Im Protokoll für Festkörperlaser 488, 561 und 640 nm als <td>"Luftröhre" bezeichnet</td></tr><tr><td>,</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A-95 Festwinkelrotor</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td></td>347595</tr><tr><td>Aceton</td><td>Jede Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Airfuge Air-Driven Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>347854</td><td>Im Protokoll als "airfuge" bezeichnet</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Microscale Protein Labeling Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A30006</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Beliebige Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor iXon Ultra EM-CCD</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor NEO sCMOS</td><td>Nikon AutoCAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Autodesk</td><td></td><td>Generische Versionen kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Rinderhirn unbeschriftetes Tubulin (gereinigt)</td><td>N/A</td><td></td><td>Hergestellt im Haus, kann aber gekauft werden</td></tr><tr><td>Kasein</td><td>MilliporeSigma</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>Katalase</td><td>MilliporeSigma</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Clean Dry Air (CDA) (Druckgas)</td><td>Jede Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Druckluftversorgung</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Anschluss an die Mikrofluidik Durchflussregler</td></tr><tr><td>COMSOL Multiphysics Software</td><td>COMSOL, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kundenspezifischer Tischadapter aus Messing</td><td>N/A</td><td></td><td>Made in house, um unsere 22 mm x 22 mm Deckgläser auf das Mikroskop zu montieren</td></tr><tr><td>Deionisiertes Wasser</td> Jede Marke Dessikator <td>Jede Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>MilliporeSigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>MilliporeSigma</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>Elveflow Smart Interface (ESI) Software</td><td>Elveflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flanschlose PFA-Verschraubungen mit ETFE &frac14; "-28 bis 1/16" Aderendhülsen mit Außendurchmesser&nbsp;</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>CIL-XP-245X</td><td>Wird verwendet, um die Schläuche von den Micrewtube-Quellfläschchen mit dem Durchflusssensor über das druckbeaufschlagte Reservoirgestell zu verbinden</td></tr><tr><td>Fluiwell 4-Kanal 2 mL Niederdruck</td><td>Fluigent</td><td>14002001</td><td>Wird verwendet, um das Durchflusskontrollsystem mit den Micrewtubes zu verbinden. Auch als "Druckbehälter-Rack"</td></tr> <tr><td>bezeichnetAbzug</td><td>Jede Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glukoseoxidase</td><td>MilliporeSigma</td><td>G6125</td><td></td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-405L</td><td></td></tr><tr><td>Guanosintriphosphat (GTP)</td><td>MilliporeSigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Heizplatte</td><td>Jede Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HS-625 Hochgeschwindigkeit Emissionsfilterrad</td><td>Finger Lakes Instrumentation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>N/A</td><td></td><td>Open Access</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Jede Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropylalkohol</td><td>Jede Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karl Süss MA-6 Masken-Aligner</td><td>SÜSS MicroTec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.05833</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB-Software</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEGAPOSIT SPR 220 7.0 Fotolack</td><td>Dow, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrofluidische Verschraubungen 6-40 auf 1/4"-28 Adapter-Kit</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>LVF-KFI-08</td><td>Wird verwendet, um die Schläuche von den Micrewtube-Quellfläschchen über das druckbeaufschlagte Reservoir-Rack (Fluiwell-Rack) mit dem Durchflusssensor zu verbindenMikrofluidische</td></tr> <tr><td>Fittings weibliches Luer-Lock-Adapter-Kit</td><td>Darwin</td><td>Microfluidics LVF-KFI-04</td><td>Wird verwendet, um die Spritze mit dem Schlauch</td></tr><tr><td>zu verbinden Mikrofluidischer Durchflussregler</td><td>Elveflow</td><td>OB1 MK3+</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofluidischer Durchflusssensor</td><td>Elveflow</td><td>MFS3</td><td>Dieser Durchflusssensor ist 0-80 &mu; L&nbsp;</td></tr><tr><td>MICROPOSIT MF-319 Entwickler</td><td>Dow, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Software</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stickstoff (Druckgas)</td><td></td>Objektivheizung jeder Marke <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tokai Hit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Einteilige fingerfeste 10-32 konische Verschraubung für 1/16" OD Schläuche&nbsp;</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>CIL-F-120X</td><td>Wird verwendet, um die Spritze mit dem Schlauch zu verbinden</td></tr><tr><td>Paclitaxol (Taxol)</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1097</td><td></td></tr><tr><td>Photolithographie-Masken</td><td>N/A</td><td></td><td>Hergestellt von einer externen Partei unter Verwendung unserer Designs</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>172615000</td><td></td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Plasma-Durchflussmesssystem</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-FMG</td><td>Integriert sich in den Plasmareiniger, um die Durchflusskontrolle von Druckgas zu ermöglichen</td></tr><tr><td>Kolbenpipette aus Kunststoff</td><td>Jede Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pluoronic F-127</td><td>MilliporeSigma</td><td>P2443</td><td>Wird im Protokoll als "Poloxomer 407" bezeichnet</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Forschungsprodukte International</td><td>P41000</td><td></td></tr><tr><td>Saint Gobain Performance Plastics&nbsp; Tube Tygon .020 ID</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-206-8921</td><td>Wird im Protokoll als "1,5 mm Schlauch" und "Schlauch" bezeichnet</td></tr><tr><td>Skalpell</td><td>Jede Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spin</td><td>Coater Cost Effective Equipment, LLC.</td><td>200x</td><td>Dieses Modell kann nicht mehr hergestellt werden</td></tr><tr><td>Standard-Pipetten- und Spitzensets</td><td>Jede Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard-Kunststoffspritze</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Wir haben eine 10 mL Luer-Slip-Spritze verwendet</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikonelastomer-Kit</td><td>Dow, Inc.</td><td></td><td>Im Protokoll als "PDMS" und "Härter" bezeichnet</td></tr><tr><td>Micrewtube mit Lippendichtung und flachem Schraubverschluss</td><td>Medline Industried, LP.</td><td>T339</td><td>Im Protokoll als "Quellfläschchen" bezeichnet. Wir verwendeten sowohl 0,5 mL als auch 1,5 mL Größen</td></tr><tr><td>TAMRA, SE; 5-(und-6)-Carboxytetramethylrhodamin, Succinimidylester</td><td>Invitrogen</td><td>C1171</td><td>Im Protokoll als "TTR" bezeichnet</td></tr><tr><td>Trichlor(1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoroctyl)-Silan</td><td>MilliporeSigma</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>Trion Phantom RIE ICP&nbsp;</td><td>Trion Technology, Inc.</td><td></td><td>Dieser Plasmareiniger wird nur in Schritt 1.1 des Protokolls verwendet. Stattdessen kann ein anderer Plasmareiniger verwendet werden, wie er für die PDMS-Verklebung verwendet wird. Wir bevorzugen einfach das viel niedrigere Vakuum, das mit diesem System für die Reinigung des Siliziumwafers erreicht werden</td></tr> kann <tr><td>TRITC Polyklonaler Antikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A6397</td><td>Wird im Protokoll als "Anti-Rhodamin-Antikörper" bezeichnet</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Jede Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vakuumpumpe</td><td>Jede Marke</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

entwicklung eines mikrofluidikbasierten ansatzes zur untersuchung der mikrotubuli-polymermechanik

Development of a Microfluidics-Based Approach for Investigating Microtubule Polymer Mechanics

Entwicklung eines mikrofluidikbasierten Ansatzes zur Untersuchung der Mikrotubuli-Polymermechanik

In this protocol, we describe the design and fabrication of a microfluidic device developed for the investigation of microtubule polymer mechanics. The ...

development-microfluidics-based-approach-for-investigating

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir präsentieren ein Verfahren zur Bildung eines Poly (Ethylenglycol) selbstorganisierte Monoschicht (PEG-SAM) auf einem Silizium-Substrat mit Gold-Mikroelektroden. Die PEG-SAM ist in einem einzigen Schritt gebildet und verhindert Biofouling auf Silizium-und Goldoberflächen. Die Elektrophorese wird dann für die Strukturierung von Biomolekülen bis in den Nanobereich eingesetzt.

Antifouling Selbstorganisierte Monoschichten auf Mikroelektroden für die Strukturierung von Biomolekülen

Ein Verfahren, um die Persistenzlänge oder Biegesteifigkeit von Biopolymeren messen beschrieben. Das Verfahren verwendet eine Kinesin-Mikrotubulus angetriebenen Gleitflug Assay experimentell die Persistenzlänge einzelner Mikrotubuli und ist anpassbar an Aktin-basierten Assays Gleiteigenschaften.

Biegesteifigkeit Maße von Biopolymeren mit Gliding Assays

Mikrotubuli sind Polymere von Natur aus instabil, und deren Umschaltung zwischen Wachstum und Verkürzung stochastisch und schwierig zu steuern. Hier beschreiben wir Protokolle mit segmentierten Mikrotubuli mit photoablatable stabilisierende Kappen. Depolymerisation von Mikrotubuli segmentiert mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung ausgelöst werden, wodurch die Unterstützung Analyse der Bewegungen mit den Mikrotubuli-Enden der Demontage.

Vorbereitung der segmentierte Mikrotubuli auf Anträge von der Demontage Microtubule Ends Driven Studieren

Hefe Angehende ist ein vorteilhaftes Modell die Dynamik der Mikrotubuli in vivo aufgrund seiner leistungsstarken Genetik und die Einfachheit der Mikrotubuli - Zytoskelett für das Studium. Das folgende Protokoll beschreibt, wie zu transformieren und Kultur Hefezellen, konfokale Mikroskopie Bilder erfassen und quantitativ die Dynamik der Mikrotubuli in lebenden Hefezellen analysieren.

Hochauflösende Bildgebung und Analyse einzelner Astral Dynamik der Mikrotubuli in Bäckerhefe

Hier stellen wir eine robuste und detaillierte Methode der Mikrotubuli-Dynamikanalyse in Zellen vor, die in der Prometaphase mit Live-Zell-Spinnscheibe konfokaler Mikroskopie und MATLAB-basierter Bildverarbeitung synchronisiert werden.

Messung der Mikrotubuli-Dynamik durch Spinnen der Disk-Mikroskopie in Monopolar-Mitotischen Spindeln

Hier wird ein TIRF-Mikroskopie-basierter  In-vitro-Rekonstitutionsassay vorgestellt, um gleichzeitig die Dynamik zweier Mikrotubulipopulationen zu quantifizieren und zu vergleichen. Es wird ein Verfahren beschrieben, um gleichzeitig die kollektive Aktivität mehrerer Mikrotubuli-assoziierter Proteine auf vernetzten Mikrotubulibündeln und einzelnen Mikrotubuli zu betrachten.

Simultane Visualisierung der Dynamik von vernetzten und einzelnen Mikrotubuli in vitro mittels TIRF-Mikroskopie

Wir stellen ein Protokoll zur Implementierung der Interferenzreflexionsmikroskopie und der Total-Interreflexions-Fluoreszenzmikroskopie für die gleichzeitige Abbildung von dynamischen Mikrotubuli und fluoreszenzmarkierten Mikrotubuli-assoziierten Proteinen vor.

Simultane Interferenzreflexion und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie zur Abbildung dynamischer Mikrotubuli und assoziierter Proteine

Hier stellen wir ein Protokoll zur Rekonstitution von Mikrotubulibündeln in vitro und zur direkten Quantifizierung der in ihnen ausgeübten Kräfte durch simultanes optisches Einfangen und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie vor. Dieser Assay ermöglicht die Messung der Kräfte und Verschiebungen, die von Proteinensembles in aktiven Mikrotubuli-Netzwerken erzeugt werden, auf Nanoskala-Ebene.

Direkte Messung von Kräften innerhalb rekonstituierter aktiver Mikrotubulibündel

Wir präsentieren Protokolle für einfache mikrofluidische Aktinfilament-Assays in Kombination mit der Fluoreszenzmikroskopie, die es ermöglichen, einzelne Aktinfilamente in Echtzeit genau zu überwachen und sie nacheinander verschiedenen Proteinlösungen auszusetzen.

Verwendung von Mikrofluidik und Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung der Montagedynamik von einzelnen Actin-Filamenten und -Bündeln

Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Bildung von Mikrotubuli-Baugruppen in Form von Tactoiden unter Verwendung von MAP65, einem pflanzlichen Mikrotubuli-Vernetzer, und PEG als Crowding-Agent vor.

Selbstorganisation von Mikrotubuli-Taktoiden

Dieses Protokoll ist ein Leitfaden für die Visualisierung von dynamischem Aktin und Mikrotubuli unter Verwendung eines in vitro TIRF-Mikroskopie-Assays ( Total Internal Fluorescence).

Visualisierung der Dynamik der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli in vitro durch Total-Internal-Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRF)

Erfahren Sie, wie ein mikrofluidikbasierter Ansatz die Mechanik von Mikrotubuli in vitro untersucht. Diese Methode ermöglicht robuste Hochdurchsatz-Tests und vermeidet Probleme wie Luftblasenbildung bei der Analyse zytoskelettaler Dynamik.

Entwicklung eines mikrofluidikbasierten Ansatzes zur Untersuchung der Mikrotubuli-Polymermechanik

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