Etablierung eines Co-Kultursystems aus patienteneigenen kolorektalen Tumororganoiden und tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TILs)

Ziel der Forschung ist es, tumorinfiltrierende Lymphozyten, Interaktionen mit Darmkrebs-Organoiden und das therapeutische Potenzial der TIL-basierten Therapie für personalisierte Darmkrebsbehandlungen zu untersuchen. Unser Protokoll vereinfacht die Prävention von tumorinfiltrierenden Lymphozyten aus Lymphozyten und ermöglicht deren Co-Kultivierung mit Darmkrebs-Organoiden, wodurch die unterlegene Wirksamkeit und die häufige Morbidität bei Patienten überwunden werden.

[Erzähler] Bereiten Sie zunächst die experimentellen Reagenzien und die Laborkleidung für den Gebrauch vor. Spülen Sie dann das primäre Gewebe des Darmkrebstumors dreimal mit fünf Millilitern PBS, gefolgt von einem Gewebewaschpuffer. Zerkleinern Sie das Gewebe mit einer Gewebeschere in kleine Fragmente. Übertragen Sie das zerkleinerte Gewebe in den CRC-Verdauungspuffer. Inkubieren Sie die Probe in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten, bis das Gewebe vollständig dissoziiert ist. Geben Sie dann ein gleiches Volumen Ad DMEM in die aufgeschlossene Probe, um die Reaktion zu neutralisieren. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 380 g fünf Minuten lang bei 25 Grad Celsius. Entsorgen Sie nun den Überstand aus der zentrifugierten Probe mit einer Pipette. Pipettieren Sie ein bis drei Milliliter vorgewärmten Erythrozyten-Lysepuffer in das Pellet und inkubieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 25 Grad Celsius. Fügen Sie ein gleiches Volumen an Ad DMEM hinzu, um die Lyse zu beenden. Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 380 g bei etwa 25 Grad Celsius. Nach dem Verwerfen des Überstands wird das Zellpellet in einem geeigneten Volumen Ad DMEM wieder suspendiert. Fügen Sie der Suspension Trypanblau hinzu, um lebensfähige Zellen zu quantifizieren und eine Einzelzellsuspension des Tumorgewebes zu erhalten.

Teilen Sie die einzellige Suspension des Tumorgewebes in zwei Teile. Verwenden Sie einen Teil für die Etablierung des vom Patienten abgeleiteten Organoidmodells und den anderen für die Kultivierung tumorinfiltrierender Lymphozyten. Nach der Zählung der Zellen werden 80.000 Zellen pro Vertiefung mit Matrigel im Verhältnis eins zu eins für die Organoidkultur gemischt. Suspendieren Sie dann die verbleibende Zellsuspension in vollständigem Medium in einer 24-Well-Platte. Sammeln Sie die tumorinfiltrierenden Lymphozyten in einem Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie die Well-Platte mit frischem Medium aus, um alle verbleibenden Zellen zu gewinnen. Übertragen Sie sie in das gleiche Zentrifugenröhrchen und die gleiche Zentrifuge. Nach dem Entsorgen des Überstands das Pellet mit zwei Millilitern PBS waschen und erneut zentrifugieren. Verwenden Sie als Nächstes CD3-positive magnetische Kügelchen, um CD3-positive T-Zellen zu sortieren und zu isolieren. Setzen Sie die Sortiersäule in den Magnetständer ein. Übertragen Sie dann die Zellsuspension in die Säule und lassen Sie die mit magnetischen Kügelchen markierten Zellen in der Säule verbleiben. Sobald die Sortierung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Sortiersäule vom Magneten. Fügen Sie dann Puffer hinzu, um die zurückgehaltenen positiven Zellen zu eluieren. Die eluierten Zellen werden in zwei Millilitern PBS resuspendiert und zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette. Suspendieren Sie die Zellen in einer 12-Well-Platte mit frischem EMEM-Medium in einer Konzentration von 1 Million Zellen pro Milliliter. CD3-Antikörper bis zu einer Endkonzentration von fünf Mikrogramm pro Milliliter zugeben. Fügen Sie dem Organoidmedium Interferon-Gamma hinzu, um die Antigenpräsentation zu verbessern. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent Kohlendioxid für 24 Stunden. Verdünnen Sie den Anti-CD28-Antikörper mit PBS auf eine Konzentration von zwei Mikrogramm pro Milliliter. Beschichten Sie jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit 50 Mikrolitern der Antikörperlösung. Anschließend die Platte mit Siegelfolie verschließen und inkubieren. Nach 24 Stunden verwenden Sie TrypLE, um die Organoide in einzelne Zellen zu dissoziieren und zu zählen. Waschen Sie dann die Zellen zweimal mit PBS. Sammeln Sie die gepaarten tumorinfiltrierenden Lymphozyten. Zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler oder Hämozytometer und waschen Sie sie zweimal mit PBS. Innokulieren Sie Organoide in jede Vertiefung mit 10.000 Zellen pro Vertiefung. Beimpfen Sie tumorinfiltrierende Lymphozyten mit 100.000 Zellen pro Well, um ein Effektor-Ziel-Verhältnis von 10 zu eins zu erreichen. Führen Sie die Co-Kultur in einem ergänzten RPMI 1640-Medium durch. Inkubieren Sie die Co-Kultur drei Tage lang und nehmen Sie Bilder zur Beobachtung und Dokumentation auf. Am Ende der Co-Kultur-Periode sammeln Sie die vom Patienten stammenden Organoide und tumorinfiltrierenden Lymphozyten in einem Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die gesammelten Zellen zweimal in PBS bei 300 g für jeweils fünf Minuten. Bereiten Sie dann den Antikörpercocktail vor, der CD3 FITC, CD4 APC-Cyanin7, CD8 APC, CD107 APE-Cyanin7, CD279 PE und 7-AAD enthält. Die gewaschenen Zellen werden in 100 Mikrolitern des Antikörpercocktails erneut suspendiert und 20 Minuten lang inkubiert. Fügen Sie einen Milliliter PBS hinzu, um die Zellen zu waschen. Zentrifugieren Sie dann das Röhrchen fünf Minuten lang bei 300 g. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette. Zum Schluss wird das Zellpellet in 500 Mikrolitern PBS resuspendiert, bevor eine durchflusszytometrische Analyse durchgeführt wird. Die von den Patienten stammenden Organoide zeigten eine sichtbare Expansion über einen Zeitraum von 12 Tagen, wobei am ersten Tag kleine Cluster beobachtet wurden, größere und zahlreichere Strukturen am sechsten Tag und gut definierte reife Organoide am 12. Tag. Organoide wiesen eine ähnliche histologische Architektur auf wie kolorektales Krebsgewebe, wie Hämatoxylin- und Eosin-Färbung zeigt. Die Immunfärbung zeigte eine Cytokeratin-7-Expression sowohl im Gewebe als auch in Organoiden, was die epitheliale Identität bestätigt, wobei Cytokeratin-20 in beiden Probentypen ebenfalls eine starke Expression zeigte. Ähnliche Expressionsmuster wurden auch für Ki-67, einen Proliferationsmarker, und Homöobox 2 vom kaudalen Typ, einen Marker für die intestinale Differenzierung, beobachtet. Tumorinfiltrierende Lymphozyten zeigten eine fortschreitende Expansion von einer spärlichen Verteilung am ersten Tag zu einer auffälligen Clusterbildung am 14. Tag und einer dichten Aggregation am 22. Tag. Immunfluoreszenzfärbungen zeigten starke CD45- und CD3-Signale in tumorinfiltrierenden Lymphozyten, die den Immunursprung der Zellen bestätigen. Das Fehlen von EpCAM-Färbungen in der tumorinfiltrierenden Lymphozytenpopulation bestätigte, dass die expandierten Zellen frei von epithelialen Tumorzellen waren.