Induktion gezielter milder Hyperthermie in murinen Tumormodellen durch photothermische Umwandlung von Nahinfrarotlicht durch intratumorale Gold-Nanostäbchen

Die zielgerichtete hyperthermische Therapie ist eine aufstrebende Modalität in der Krebsbehandlung, die darauf abzielt, die Tumortemperaturen selektiv zu erhöhen und gleichzeitig die Schädigung des umgebenden gesunden Gewebes zu minimieren. Diese Methode beschreibt einen hocheffizienten, ressourcenschonenden und reproduzierbaren Weg zur Induktion von Goldnanostäbchen-vermittelter Hyperthermie in soliden Tumoren. Die direkte intratumorale Injektion von Gold-Nanostäbchen, gefolgt von der Exposition gegenüber Nahinfrarotlicht, ermöglicht eine präzise, kontrollierte und hochgradig lokalisierte Erwärmung von Tumoren.

Der Erfolg dieses Protokolls hängt von einer effizienten Aktivierung des tiefen Gewebes von Gold-Nanostäbchen unter Verwendung der geeigneten Wellenlänge des Nahinfrarotlichts sowie einer genauen Echtzeitüberwachung der inneren Tumortemperatur während des gesamten Eingriffs ab. Beginnen Sie mit täglichen Tumormessungen ab dem siebten Tag, nach der Injektion von Krebszellen oder immer dann, wenn Tumore tastbar werden. Messen Sie vor Beginn des Eingriffs die Breite, Länge und Höhe des Tumors, um das Gesamttumorvolumen zu berechnen.

Ziel ist es, den Eingriff durchzuführen, sobald die Tumore ein ungefähres Volumen von 50 Kubikmillimetern erreicht haben. Für unser Modell wurde dieses Tumorvolumen zwischen dem 10. und 12. Tag nach der Injektion von Krebszellen erreicht. Verwenden Sie in einer sterilen biologischen Sicherheitswerkbank eine Ein-mil-Spritze mit einer 31-Gauge-Nadel, um das entsprechende Volumen an Goldnanostäbchen basierend auf jedem Tumorvolumen zu entnehmen.

Vor der Injektion von Gold-Nanostäbchen wird die Maus mit einem Nasenkonus betäubt, der 2 % Isofluran bei einer Flussrate von 0,8 Litern pro Minute liefert. Tragen Sie Augenschmiermittel auf beide Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern und mögliche Laserschäden zu minimieren. Rasieren Sie bei Bedarf überschüssiges Fell um den Tumor herum, um sicherzustellen, dass die Hautoberfläche freiliegt, und verwenden Sie Ethanol, um die Tumoroberfläche zu desinfizieren und Fell oder Ablagerungen abzuwischen.

Vor der Laserbelichtung werden Goldnanostäbchen intratumoral in einer Konzentration von einem Mikrogramm pro Kubikmillimeter Tumorvolumen injiziert. Falls erforderlich, teilen Sie die Injektion auf zwei intratumorale Stellen auf, um eine effiziente Verteilung der goldenen Nanostäbchen im Tumor zu gewährleisten. Achten Sie darauf, dass Sie nach der Injektion überschüssige goldene Nanostäbchen auf der Hautoberfläche abwischen.

Bei Mäusen der Kontrollgruppe ist eine intratumorale Injektion von sterilem PBS in dem äquivalenten Volumen zu verabreichen, das für die Behandlungsgruppen mit goldenem Nanostäbchen verwendet wird. Reinigen Sie die intratumorale Temperatursonde vor dem Einführen mit Ethanol. Führen Sie den Temperaturfühler vorsichtig in die Mitte der Tumormasse ein.

Tragen Sie eine gleichmäßige, etwa fünf Millimeter dicke Schicht Aloe Vera Gel auf die Tumoroberfläche auf, um Hautgeschwüre zu verhindern und das Risiko einer thermischen Schädigung während der Behandlung zu minimieren. Stellen Sie den Laser so ein, dass er direkt über der Mitte des Tumors ausgerichtet ist. Verwenden Sie die Bestrahlungsstärke-Lookup-Tabelle, um die beste Laserhöhe basierend auf dem erforderlichen Laserstrahldurchmesser zur Abdeckung der Tumoroberfläche zu bestimmen.

Schalten Sie den Laser und die thermoelektrische Kühlquelle ein. Schließen Sie dann das Lasersystem an die Stromquelle an. Schalten Sie die thermoelektrische Kühlquelle ein.

Das blaue LED-Licht leuchtet auf und nach 30 Sekunden stabilisiert sich die Temperatur bei 25 Grad Celsius. Passen Sie auf der Grundlage der Bestrahlungsstärke-Nachschlagetabelle die Laserstromabgabe an, um eine Zielbestrahlungsstärke von etwa einem Watt pro Quadratzentimeter zu erreichen. In unserem Experiment ergab eine Laserhöhe von 1,5 Zentimetern, ein Strahldurchmesser von 1,3 Zentimetern und ein Laserstrom von 1800 Milliampere einen Bestrahlungsstärkewert von 0,82 Watt pro Quadratzentimeter, der für unser Tumormodell optimiert wurde.

Stellen Sie ab diesem Zeitpunkt sicher, dass alle Personen im Laser-OP-Saal eine zertifizierte Laserschutzbrille für die verwendete Lichtwellenlänge tragen. Richten Sie eine Thermokamera neben der Laserplattform ein, die auf die Maus gerichtet ist, um die Hautoberflächentemperatur während des Laservorgangs zu überwachen. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung in der thermogekoppelten Datenprotokollierungssoftware und stellen Sie sicher, dass das interne Diagramm der Tumortemperatur in Echtzeit angezeigt wird.

Drehen Sie die Laser-Sicherheitstaste, um die Quellenausgabe zu aktivieren. Starten Sie die Laserverabreichung, indem Sie das Fußpedal nach unten drücken Zum Zeitpunkt des Laserstarts beginnt die innere Tumortemperatur zu steigen, wobei es etwa 15 Sekunden bis zwei Minuten dauert, bis der hyperthermische Zielbereich von 42 bis 48 Grad erreicht ist. Wenn sich die Temperatur des inneren Tumors 48 Grad nähert, nehmen Sie den Fuß vom Pedal und lassen Sie die Temperatur wieder sinken.

Dieser Temperaturabfall sollte in Echtzeit in der Temperatur-Zeit-Anzeigegrafik sichtbar werden. Sobald die innere Tumortemperatur auf etwa 43 Grad gesunken ist, aktivieren Sie die Laserverabreichung mit dem Fußpedal wieder. Die Temperatur sollte wieder zu steigen beginnen, ohne aus dem hyperthermischen Bereich zu fallen.

Setzen Sie dieses Ein- und Ausschalten des Lasers fort, um sicherzustellen, dass der Tumor im hyperthermischen Bereich bleibt. Das Diagramm der Temperatur-Zeit-Anzeige sollte beginnen, dieses On-Cycling-Muster des Lasers widerzuspiegeln. Überwachen Sie während der Aufrechterhaltung der Tumorhyperthermie kontinuierlich die Oberflächentemperatur der Haut, um sicherzustellen, dass sie unter 50 Grad Celsius bleibt.

Lassen Sie nach fünf Minuten Aufrechterhaltung der Hyperthermie das Fußpedal los, um die Laserverabreichung zu stoppen und die innere Tumortemperatur wieder auf etwa 37 Grad Celsius sinken zu lassen. Sobald der Tumor wieder eine normale Temperatur erreicht hat, entfernen Sie die Temperaturüberwachungssonde und wischen Sie überschüssiges Aloe Vera Gel auf der Tumoroberfläche ab. Entfernen Sie die Maus aus dem Nasenkonus-Anästhetikum und überwachen Sie die Erregung der Tiere, bevor Sie in den Käfig zurückkehren Stellen Sie den Käfig nach der Genesung teilweise auf ein Wärmekissen, wie hier gezeigt.

Stellen Sie sicher, dass die Mäuse wieder zu ihrem normalen Verhalten zurückgekehrt sind, bevor Sie sie in ihre Haltungseinrichtung zurückbringen. Diese Tabelle enthält Bestrahlungsstärkewerte in Watt pro Quadratzentimeter für verschiedene Einstellungen der Laserstromabgabe in Milliampere und Arbeitsabstände in Zentimetern. Diese Tabelle wird verwendet, um die geeignete Laserhöhe basierend auf dem erforderlichen Strahldurchmesser zu bestimmen, um die Tumoroberfläche abzudecken und eine Zielbestrahlungsstärke von etwa einem Watt pro Quadratzentimeter zu erreichen.

Grün hervorgehobene Werte in dieser Tabelle geben optimale Bestrahlungsstärken nahe einem Watt pro Quadratzentimeter an. Diese Abbildung zeigt repräsentative Temperaturprofile des inneren Tumors über die Zeit in Millisekunden, die von der internen Tumortemperatursonde während der Exposition des Tumors gegenüber Nahinfrarotlicht aufgezeichnet wurden. Abbildung A zeigt das On-Off-Laserzyklusmuster in einer mit Goldnanostäbchen injizierten Maus, die erforderlich ist, um die innere Tumortemperatur im hyperthermischen Bereich zu halten.

Es unterstreicht, wie wichtig es ist, die innere Tumortemperatur und den Zyklus der Laserverabreichung genau zu überwachen, um den hyperthermischen Bereich während des gesamten Eingriffs aufrechtzuerhalten. Abbildung B zeigt den durchschnittlichen Unterschied in der inneren Tumortemperatur zwischen injiziertem Gold-Nanarod und Kontroll- oder PBS-injizierten Mäusen während der fünfminütigen Exposition gegenüber Nahinfrarotlicht. Ohne die Injektion von Gold-Nanostäbchen erwärmen sich Tumore, die Nahinfrarotlicht ausgesetzt sind, nicht in einen milden hyperthermischen Bereich.

PBS-injizierte Tumoren erreichen ein Plateau von etwa 39 bis 40 Grad Celsius, im Gegensatz zu Gold-Nanostäbchen-injizierten Tumoren, die hyperthermische Temperaturen von 42 bis 48 Grad erreichen. Unsere durch Gold-Nanostäbchen vermittelte zielgerichtete hyperthermische Therapie induziert innerhalb von 48 bis 72 Stunden nach der Behandlung eine Schrumpfung des Tumorvolumens bei mehreren spiegelnden Krebsmodellen. Abbildung A zeigt die Messung des Tumorvolumens in 4T1, einem Brustkrebsmodell, das auf einer Gold-Nanostäbchen-vermittelten zielgerichteten Hyperthermietherapie folgt.

Abbildung B zeigt B16 F10, ein Melanommodell, und Abbildung C zeigt CT26, ein Darmkrebsmodell. Eine Verringerung oder Verlangsamung des Tumorvolumenwachstums innerhalb von 48 bis 72 Stunden nach der Behandlung ist ein Hinweis auf ein positives Ergebnis. Bei der Durchführung dieses Protokolls ist eine genaue Echtzeitüberwachung der inneren Tumortemperatur von entscheidender Bedeutung, um sicherzustellen, dass ein milder hyperthermischer Bereich erreicht wird und die Behandlung konsistent durchgeführt wird.

Im Anschluss an dieses Verfahren sollten tägliche Tumorvolumenmessungen durchgeführt werden, um Veränderungen des Tumorvolumens zu erfassen. Eine Tumorregression innerhalb von zwei bis drei Tagen ist ein positiver Indikator für den Behandlungserfolg.