Neutrophile Isolation Protocol

Protokoll zur Isolierung von Neutrophilen. Bei diesem Verfahren werden weiße Blutkörperchen aus einer Vollblutprobe, einer Zentrifuge und Fläschchen extrahiert. Vortex sir Nadel- und Spritzenspritzenfilter.

Milli pour brand MX gv 0,22 Mikrometer Materialien. Für die Trennung von Neutrophilen in Hank-Zauber- und Salzlösung sind zwei Arten von HBSS-Lösungen erforderlich. HBSS mit Calciumchlorid wird verwendet, um eine Lösung mit humanem Serumalbumin herzustellen.

HBSS ohne Calciumchlorid wird verwendet, um die Neutrophilen zu suspendieren und zu waschen. Bitte achten Sie bei diesem Verfahren besonders darauf, die geeignete HBSS-Lösung zu verwenden. Humanes Serumalbumin oder HSA ist ein Protein im Blutplasma, das den pH-Wert und den SMO-Druck aufrechterhält.

Verwenden Sie keinen Rinderserum-Amalgamatat-Lysepuffer für rote Blutkörperchen. Dies wird von Roche Diagnostics hergestellt, neutrophile Isolationsmedien NIM Cedar Line Labs Lymph Light Poly Trennmedien, die vor Licht geschützt und im Kühlschrank aufbewahrt werden, um beste Ergebnisse zu erzielen. Alle Reagenzien sollten zum Zeitpunkt der Anwendung Raumtemperatur haben.

Nehmen Sie die Reagenzien eine Stunde vor dem Experiment aus dem Kühlschrank. Bereiten Sie H-B-S-S-H-S-A-Lösung für die Neutrophilentrennung vor. HBSS mit Calciumchlorid in das Fläschchen pipettieren.

Ziehen Sie HSA in die Spritze. Vermeiden Sie das Einfangen von Luftblasen. Entfernen Sie die Spritzennadel und ersetzen Sie sie durch den Filter.

Injizieren Sie HSA durch den Filter in das HBSS-Fläschchen Vortex Two Mix, wenn Sie Ihre anderen Materialien bereit haben und bei Raumtemperatur etwa 15 Milliliter Vollblut aufnehmen. Daraus ergeben sich 10 bis 15 Milliliter von 10 bis acht Neutrophilen. Der Spender sollte 24 Stunden vor der Abgabe der Blutprobe keinen Alkohol oder rezeptfreie Medikamente konsumiert haben.

Diese können den Trennprozess stören. Vollblut kann mit EDTA-Citrat oder Heparin antikoaguliert werden, indem neun Teile Blut zu einem Teil K, drei EDTA-Natriumcitrat oder Heparin gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzugefügt werden. Die folgenden Schritte werden in diesem Verfahren beschrieben.

Trennen und entfernen Sie Plasma und Monozyten. Trennen und erwerben Sie eine Neutrophilenschicht, die rote Blutkörperchen frei lysiert, suspendiert die Neutrophilen bei der ersten Trennung. Erfassen Sie Neutrophile in der NIM-Schicht.

Sammeln Sie fünf Milliliter Isolationsmedium im Zentrifugenröhrchen. Wenn Sie das Isolationsmedium tiefer in das Röhrchen legen, kann es als Filter wirken, da die Zentrifuge das Blut vorsichtig durch das Röhrchen nach unten drückt. Schichten Sie fünf Milliliter Blut über den NIM, um eine saubere Trennung zu gewährleisten.

Seien Sie sehr vorsichtig, um das Mischen der Lösungen zu vermeiden. Führen Sie diesen Schritt langsam und vorsichtig und mit der Pipettenspitze nahe an der Oberfläche des Auflösungsmediums durch, um eine Vermischung der Zentrifuge zu verhindern. Die Lösung bei 500 RCF für 35 Minuten.

Bei 20 bis 25 Grad Celsius sollte sich das Blut in sechs verschiedene Banden aufteilen. Die sechs Banden sind Plasmamonozyten, Isolationsmedien, Neutrophile, weitere Isolationsmedien und das Pellet der roten Blutkörperchen am unteren Rand. Wenn diese sechs Banden nicht klar und deutlich sind, war der Trennvorgang nicht sauber und müsste wiederholt werden.

Häufige Ursachen für eine schlechte Trennung sind ein alter Spender von Isolationsmedien, der in den letzten 72 Stunden Alkohol konsumiert hat, oder ein Spender, der andere Medikamente wie Tylenol oder Aspirin konsumiert hat. Entfernen und entsorgen Sie vorsichtig die Plasmamonozyten und Isolationsmedien. Legen Sie diese Schichten in ein verschließbares Röhrchen und entsorgen Sie sie vorsichtig. Pipettieren Sie die Neutrophilenschicht und das gesamte Isolationsmedium unter den Neutrophilen in eine saubere Zentrifugenfeile, um so viele Neutrophile wie möglich zu gewinnen.

Oft ist es am einfachsten, auch einige der Isolationsmedien aus der darunter liegenden Schicht einzuschließen. Stören Sie die Palette nicht am Boden. Zweite Deklaration, verfeinern Sie die neutrophile Schicht.

Verdünnen Sie die neutrophile Lösung auf 10 Milliliter mit HBSS ohne Kalzium. Drehen Sie das Röhrchen einige Male um, um die Zentrifuge der Zellen aufzuhängen. Die Neutrophilenlösung.

350 RCF für 10 Minuten. Bei 20 bis 25 Grad Celsius sollte sich auf dem Boden des Röhrchens ein rotes Kügelchen befinden, das Neutrophile und verbleibende rote Blutkörperchen enthält. Entfernen Sie das Supra-Natin mit der Pipette.

Seien Sie vorsichtig, um das Pellet am Boden zu stören. Lyse der roten Blutkörperchen.

Die roten Blutkörperchen in der Probe müssen nun durch die Lyse zerstört werden. Um die restlichen roten Blutkörperchen zu lysieren, geben Sie zwei Milliliter Lysionspuffer für rote Blutkörperchen in das Röhrchen, um es wiederzubeleben. Hängen Sie das Pellet auf, wirbeln Sie das Fläschchen auf einer Stufe von drei bis vier auf.

Vermeiden Sie es, die Wirbeleinstellung über vier zu erhöhen, da dies dazu führen kann, dass die Neutrophilen aktiviert werden. Es kann notwendig sein, mehrere Sekunden lang zu wirbeln oder den Wirbel zu pulsieren, um den Gaumen aufzulösen. Die Lyselösung wird fünf Minuten lang bei 250 RCF zentrifugiert.

Verwenden Sie die Softstart-Option, um Schäden an der Probe zu minimieren. Entfernen Sie das Supra-Natin mit einer Pipette. Wiederholen Sie den Lysevorgang.

Falls erforderlich, Suspension von Neutrophilen freisetzen, 500 Mikroliter HBSS ohne Kalzium in jedes Röhrchen geben. Das Pellet in einer Einstellung von drei bis vier vortexen, auf 10 Milliliter mit HPSS ohne Kalziumzentrifuge verdünnen. Die Neutrophilen bei 250 RCF für fünf Minuten aspirieren die Schlinge und verwerfen sie.

Suspendieren Sie das Pellet erneut in 250 Mikrolitern HBSS mit HSA-Lösung, zweimal 10 bis sechs. In der Regel werden Neutrophile pro Milliliter gesammelt.