Name: Neutrophile Isolation Protocol (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-23T22:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Lernen Sie die Isolierung humaner Neutrophilen aus Vollblut mittels Dichtegradienten-Zentrifugation. Diese standardisierte Methode ermöglicht reproduzierbare Forschung zur Immunantwort und Entzündung.

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Die Finanzierung von NIH R01 HL56621.

Neutrophile Isolation Protocol <ol><li> Bringen Sie alle Reagenzien auf Raumtemperatur. </li><li> Sammeln Sie 5,0 ml der neutrophilen Isolation Medien in Zentrifugenröhrchen. Sorgfältig Schicht 5,0 ml Blut über die Trennung Medien. Führen Sie diesen Schritt langsam und vorsichtig, und mit der Pipettenspitze dicht an der Oberfläche der Medien zur Vermeidung der Vermischung des Blutes und der Medien. </li><li> Zentrifuge bei 500 RCF für 35 min bei 20-25 ° C. Das Blut sollte trennen in 6 verschiedenen Bands: Plasma, Monozyten, Isolation Medien, Neutrophilen, mehr Isolation Medien, und die roten Blutkörperchen Pellet (Abbildung 1). Wenn diese Bänder nicht klar sind, war die Trennung Prozess nicht sauber und muss wiederholt werden. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die oberen drei Schichten (Plasma, Monozyten und Isolation Medien) mit Hilfe einer Pipette. Entsorgen Sie diese Schichten. </li><li> Sorgfältig Pipette die Schicht von Neutrophilen und alle die Isolierung Medien unter der Neutrophilen. Legen Sie die Lösung in ein sauberes Zentrifugenröhrchen. </li><li> Verdünnen Sie die Neutrophilen-Lösung auf 10 ml mit HBSS ohne Ca 2 + / Mg 2 +. Drehen Sie die Röhre ein paar Mal, um die Zellen zu suspendieren. </li><li> Zentrifugieren Sie die Neutrophilen-Lösung bei 350 RCF für 10 Minuten. Ein rotes Pellet sollte am unteren Ende der Röhre vorhanden ist, mit Neutrophilen und Rest-roten Blutkörperchen (Erythrozyten). Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette vorsichtig, so dass die Pellets nicht gestört wird. </li><li> Um lysieren die restlichen Erythrozyten, 2 ml Red Cell Lysis Buffer, um das Rohr. Um das Pellet, Wirbel der Flasche bei einer Einstellung von 3-4. Erhöhen Sie die Vortex-Einstellung über 4, da dies kann dazu führen, die Neutrophilen zu aktivieren. Es kann notwendig sein, Wirbel für einige Sekunden oder &quot;Puls&quot; der Wirbel um das Pellet zu lösen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 250 RCF für 5 min. Entfernen Sie den Überstand mit Pipette. Wiederholen Sie die Lyse-Prozess, falls erforderlich. </li><li> Add 500 ul HBSS ohne Ca 2 + / Mg 2 + in jedes Röhrchen. Wieder Wirbel um das Pellet bei einer Einstellung von 3-4 resuspendieren. Verdünnen auf 10 ml mit HBSS ohne Ca 2 + / Mg 2 +. </li><li> Zentrifugieren bei 250 RCF für 5 min. Den Überstand aspirieren und verwerfen. </li><li> Das Pellet in 250 ul HBSS / HSA-Lösung (2% HSA). Zellen können dann gezählt und angepasst werden, um gewünschte Konzentration. </li></ol>

<ol><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+leucocytes+from+blood+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Separation of leucocytes from blood and bone marrow.</a> Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).</li>
<li>England, J. M., Rowan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assignment+of+values+to+fresh+blood+used+for+calibrating+automated+blood+cell+counters%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Lab.+Haemat%22%5BJournal%5D)">The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters.</a> Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).</li>
<li>Garcia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+leukocyte+extraction+methods+for+cytomegalovirus+antigenemia+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay.</a> J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).</li>
<li>Ferrante, A., Thong, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+conditions+for+simultaneous+purification+of+mononuclear+and+polymorphonuclear+leucocytes+from+human+peripheral+blood+by+the+Ficoll-Hypaque+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method.</a> J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).</li>
</ol>

Der Dichtegradient Trennverfahren wird verwendet, um menschliche Neutrophile aus Vollblut mit einer Mischung aus Natrium-metrizoate und Dextran 500 zu isolieren. Diese Methode basiert auf den mononukleären Leukozyten Trennverfahren durch Boyum (1968), die für die Neutrophilen Trennung von Ferrante und Thong (1980) wurde modifiziert, basiert. Nach der Entnahme aus einem Spender, kann Vollblut mit EDTA, Citrat oder Heparin antikoaguliert werden. Da sie kurzlebig sind, sollten Neutrophilen innerhalb von 2-4 Stunden nach der Entnahme ve...

<table><tbody><tr><td>Lymphozyten-Poly(R)</td><td>Reagenz</td><td>Cedarlane Labs</td><td></td><td>PolymorphprepTM kann als Alternative verwendet werden</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Pufferlösung ohne Calciumchlorid</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humanes Serumalbumin</td><td>Reagenz</td><td>ZLB Bioplasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen</td><td>Reagenz</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Gerät</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Mischer</td><td>Gerät</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur-Pipetten und Birnchen</td><td>Gerät</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PolymorphprepTM</td><td>Reagenz</td><td>Axis-Shield</td><td></td><td>Alternatives Reagenz zu Lymphozyten-Poly(R)</td></tr><tr><td>Spritzenfilter</td><td>Sonstiges</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td>Millex-GV, 0,22 &amp;#x03BC;m, PVDF, 33 mm, gammastrahlensterilisierbar</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Pufferlösung mit Calciumchlorid</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

neutrophile isolation protocol

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophile polymorphkernige Granulozyten (PMN) sind die häufigsten Leukozyten bei Menschen und unter den ersten Zellen, die auf dem Gelände der entzündlichen Immunantwort kommen. Aufgrund ihrer Schlüsselrolle bei Entzündungen sind neutrophile Funktionen wie Fortbewegung, die Produktion von Zytokinen, Phagozytose und Tumorzellen zu bekämpfen intensiv untersucht. Zur Charakterisierung der spezifischen Funktionen der neutrophilen Granulozyten, ist eine saubere, schnelle und zuverlässige Methode zur Trennung von anderen Blutzellen wünschenswert, in-vitro-Studien, zumal Neutrophilen kurzlebig sind und sollte innerhalb von 2-4 Stunden nach der Entnahme verwendet werden. Hier zeigen wir eine Standard-Dichtegradienten Trennverfahren für die menschliche Neutrophile aus dem Vollblut unter Verwendung kommerziell erhältlicher Trennung Medien, die eine Mischung aus Natrium-metrizoate und Dextran 500 ist zu isolieren. Das Verfahren besteht aus Schichten Vollblut über den Dichtegradienten-Medium, Zentrifugation, Trennung von neutrophilen Schicht und Lyse der restlichen Erythrozyten. Die Zellen werden dann gewaschen, gezählt und in Puffer resuspendiert, um gewünschte Konzentration. Wenn richtig ausgeführt, hat diese Methode wurde gezeigt, dass Proben von&gt; 95% Neutrophile mit&gt; 95% Lebensfähigkeit zu erhalten.

Neutrophile Granulozyten gehören zu den ersten Zellen, die auf dem Gelände der entzündlichen Immunantwort kommen, und ihre Funktionen und Mechanismen wurden ausführlich in vitro untersucht. Wir zeigen eine Standard-Dichtegradienten Trennverfahren für die menschliche Neutrophile aus dem Vollblut unter Verwendung kommerziell erhältlicher Trennmedien isolieren.

Neutrophile Isolation Protocol

Neutrophile polymorphkernige Granulozyten (PMN) sind die häufigsten Leukozyten beim Menschen und gehören zu den ersten Zellen, die an der Stelle einer entzündlichen ...

Protokoll zur Isolierung von Neutrophilen. Dieses Verfahren dient der Gewinnung von weißen Blutkörperchen aus einer Vollblutprobe mithilfe einer Zentrifuge und von Vials. Vortex sir Spritze und Spritzenfilter.Millipore-Filter der Marke MX gv 0,22 Mikrometer Materialien. Für die Neutrophilenseparation nach Hank ist eine Salzlösung erforderlich, die zwei Arten von HBSS-Lösungen benötigt. HBSS mit Calciumchlorid wird verwendet, um eine Lösung mit menschlichem Serumalbumin herzustellen.HBSS ohne Calciumchlorid wird zum Suspendieren und Waschen der Neutrophilen verwendet. Achten Sie darauf, in diesem Verfahren die geeignete HBSS-Lösung zu verwenden. Humanes Serumalbumin oder HSA ist ein Protein im Blutplasma, das den pH- und den osmotischen Druck aufrechterhält.Verwenden Sie kein bovines Serum-Amalgam-Roten-Blood-Zell-Lysepuffer. Dieser wird von Roche Diagnostics hergestellt, Neutrophilen-Isolationsmedium NIM Cedar Line Labs Lymph-Leicht-Poly-Trennmedium, vor Licht geschützt und zur Erzielung bester Ergebnisse im Kühlschrank aufbewahrt. Alle Reagenzien sollten zum Zeitpunkt der Verwendung Raumtemperatur haben.Entfernen Sie die Reagenzien eine Stunde vor dem Experiment aus dem Kühlschrank. Bereiten Sie die H-B-S-S-H-S-A-Lösung zur Neutrophilenseparation vor. Pipettieren Sie HBSS mit Calciumchlorid in ein Gefäß.Ziehen Sie HSA in die Spritze. Vermeiden Sie das Eindringen von Luftblasen. Entfernen Sie die Spritzennadel und ersetzen Sie sie durch den Filter.HSA durch einen Filter in ein HBSS-Fläschchen injizieren und kurz vortexen, um es zu mischen. Sobald die anderen Materialien bereitliegen und Raumtemperatur erreicht haben, etwa 15 Milliliter Vollblut gewinnen. Dies ergibt 10 bis 15 Milliliter mit einer Konzentration von 10⁸ Neutrophilen. Der Spender sollte in den 24 Stunden vor der Blutentnahme keinen Alkohol oder rezeptfreie Arzneimittel konsumiert haben.Diese können den Trennprozess stören. Vollblut kann mit EDTA-Zitrat oder Heparin antikoaguliert werden, indem neun Teile Blut mit einem Teil K3-EDTA-Natriumzitrat oder Heparin gemischt werden, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die folgenden Schritte werden in diesem Verfahren beschrieben.Plasma und Monozyten trennen und entfernen. Einen Neutrophilen-Pellet gewinnen, indem rote Blutkörperchen lysiert und die Neutrophilen in der ersten Trennung frei suspendiert werden. Neutrophile in der NIM-Schicht gewinnen.Sammeln Sie fünf Milliliter Isolationsmedium in einem Zentrifugenröhrchen. Wenn das Isolationsmedium weiter unten im Röhrchen platziert wird, wirkt es als Filter, da die Zentrifugation das Blut vorsichtig hindurchzwingt. Schichten Sie fünf Milliliter Blut vorsichtig über das NIM, um eine saubere Trennung zu erzielen.Seien Sie sehr vorsichtig, um eine Vermischung der Lösungen zu vermeiden. Führen Sie diesen Schritt langsam und sorgfältig durch, wobei die Pipettenspitze nahe an der Oberfläche des Auflösemediums gehalten werden sollte, um eine Vermischung während der Zentrifugation zu verhindern. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 500 RCF für 35 Minuten.Bei 20 bis 25 Grad Celsius sollte sich das Blut in sechs deutliche Bänder aufteilen. Die sechs Bänder sind Plasma, Monozyten, Isolationsmedium, Neutrophile, weiteres Isolationsmedium und das Erythrozyten-Pellet am Boden. Wenn diese sechs Bänder nicht klar und deutlich sichtbar sind, war der Trennungsprozess nicht sauber und müsste wiederholt werden.Zu den häufigen Ursachen für eine schlechte Trennung gehören veraltete Isolationsmedien, Spender, die in den letzten 72 Stunden Alkohol konsumiert haben, oder Spender, die andere Medikamente wie Tylenol oder Aspirin eingenommen haben. Vorsichtig das Plasma, die Monozyten und das Isolationsmedium entfernen und verwerfen. Diese Schichten in ein verschließbares Röhrchen geben und sorgfältig die Schicht der Neutrophilen sowie das gesamte darunterliegende Isolationsmedium in eine saubere Zentrifugenröhrchen pipettieren, um möglichst viele Neutrophile zu gewinnen.Es ist oft am einfachsten, etwas vom Isolationsmedium aus der darunterliegenden Schicht mitaufzunehmen. Stören Sie das Pellet am Boden nicht. Zweite Abnahme, Neutrophilen-Schicht reinigen.Verdünnen Sie die Neutrophilen-Lösung mit HBSS ohne Calcium auf 10 Milliliter. Invertieren Sie das Röhrchen mehrmals, um die Zellen zu suspendieren, und zentrifugieren Sie die Neutrophilen-Lösung.350 × g für 10 Minuten. Bei 20 bis 25 Grad Celsius sollte ein rotes Pellet am Boden des Röhrchens vorhanden sein, das Neutrophile und verbleibende rote Blutkörperchen enthält. Entfernen Sie den Überstand mit der Pipette.Seien Sie vorsichtig, um das Pellet am Boden nicht zu stören. Lyse der roten Blutkörperchen.Die roten Blutkörperchen in der Probe müssen nun durch Lyse zerstört werden. Um die verbleibenden roten Blutkörperchen zu lysieren, geben Sie zwei Milliliter Puffer zur Lyse roter Zellen in das Röhrchen, um die Probe erneut aufzuschwemmen. Suspendieren Sie das Pellet, indem Sie das Gefäß bei einer Einstellung von drei bis vier verwirbeln.Vermeiden Sie, die Wirbelstärke auf mehr als vier zu erhöhen, da dies die Aktivierung der Neutrophilen verursachen kann. Es kann erforderlich sein, mehrere Sekunden zu wirbeln oder den Wirbel kurzzeitig einzuschalten, um das Pellet aufzulösen. Zentrifugieren Sie die Lysepufferlösung bei 250 RCF für fünf Minuten. Verwenden Sie die Sanftanlauf-Funktion, um Schäden an der Probe zu minimieren. Entfernen Sie das Überstand mit einer Pipette. Wiederholen Sie den Lysevorgang.Falls erforderlich, suspendieren Sie die Neutrophilen, indem Sie 500 Mikroliter HBSS ohne Calcium zu jedem Röhrchen hinzufügen. Vortexen Sie das Pellet auf einer Stufe von drei bis vier, verdünnen Sie es mit HPSS ohne Calcium auf 10 Milliliter und zentrifugieren Sie die Neutrophilen bei 250 RCF für fünf Minuten. Aspirieren und verwerfen Sie den Überstand.Suspendieren Sie das Pellet zweimal in 250 Mikrolitern HBSS mit HSA-Lösung; typischerweise werden zwei mal zehn hoch sechs Neutrophile pro Milliliter gesammelt.

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt einen in vitro Assay zur Untersuchung der Interaktion zwischen Neutrophilen und Biofilmen. Die im Biofilm eingebetteten pathogenen Bakterien und isolierten Neutrophilen wurden mit Fluoreszenzmarkierungen markiert und die Immunantwort der Neutrophilen und die Umgehung der Immunantwort durch die Bakterien mit einem Fluoreszenzmikroskop bewertet.

Ein In-vitro-Assay zur Untersuchung der Interaktion zwischen Neutrophilen und Biofilm

Dieses Video zeigt die Induktion und Visualisierung von extrazellulären Neutrophilen-Fallen oder NETs in vormarkierten Neutrophilen unter Verwendung von Patientenserum, das zytoplasmatische Antikörper gegen Neutrophile enthält. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung eines undurchlässigen DNA-Farbstoffs und der Fluoreszenzmikroskopie die Visualisierung von NETs.

Induktion und Visualisierung von extrazellulären Fallen von Neutrophilen in vormarkierten Neutrophilen

Im folgenden Protokoll beschreiben wir eine sehr einfache Möglichkeit, Neutrophil Extracellular Traps (NETs) aus humanem Vollblut unter Verwendung leicht verfügbarer Reagenzien zu isolieren. Dann zeigt, wie die isolierten Netze können in einem in vitro-Adhäsionstest mit Krebszellen verwendet werden.

Vereinfachte Menschen Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolierung und Handhabung

Neutrophile spielen nicht nur eine wichtige Rolle bei der Abwehr des Wirts gegen eindringende Mikroorganismen, sondern sind auch an der Immunüberwachung von Tumorzellen beteiligt. Hier beschreiben wir Techniken im Zusammenhang mit der Isolierung von Neutrophilen mit Anti-Tumor-Eigenschaften und Methoden zur Überwachung der Funktion von Anti-Tumor-Neutrophilen in vitro und in vivo.

Isolierung und Charakterisierung von Neutrophilen mit Anti-Tumor-Eigenschaften

Neutrophile sind die am häufigsten vorkommende Art von weißen Blutkörperchen. Die Isolierung von Neutrophilen aus menschlichem Blut durch die Dichtegradiententrennungsmethode und die Differenzierung von humanen promyelozytären (HL60) Zellen entlang des granulozytären Weges werden hier beschrieben; ihre Rolle bei der Empfindlichkeit von Lymphomzellen gegenüber Anti-Lymphom-Wirkstoffen zu testen.

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Wir beschreiben hier ein Verfahren zum Erhalt und eine neu charakterisierte Subpopulation von Neutrophilen stammRiesenFressZellen zu identifizieren. Diese Zellen entwickeln sich in Kultur aus frischem menschlichem Blut Neutrophilen und werden durch Phagozytose, Autophagie, ungeheuer groß, und längere Lebensdauer aus. Diese Methode ist wesentlich zur Weiterentwicklung dieses einzigartigen Neutrophilen stamm Subpopulation untersuchen.

Entwicklung und Identifizierung eines neuen Subpopulation von humanen neutrophilen abgeleiteten Riesen Phagozyten In Vitro

Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung von neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) und zum Betrieb von NETQUANT vor, einer vollautomatischen Softwareoption zur Quantifizierung von NETs in Immunfluoreszenzbildern.

Automatisierte bildbasierte Quantifizierung von neutrophilen extrazellulären Fallen mit NETQUANT

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von Neutrophilen aus Vollblut, Buffy Coats oder Leukapheresemembranen, um eine gute Ausbeute, hohe Reinheit und minimale Zellaktivierung zu erreichen. Wir verwenden Gradientenreinigung, Sedimentation der roten Blutkörperchen (RBC) und RBC-Lyse, um ein hochwertiges / reines Neutrophilenpräparat zu erhalten.

Isolierung von menschlichen Neutrophilen aus Vollblut- und Buffycoats

Dieses definierte Protokoll beschreibt einen Echtzeit-Hochdurchsatz-Mikroskopie-Ansatz zur Visualisierung und Quantifizierung der Freisetzung von extrazellulären Traps (NET) bei humanen Neutrophilen in vitro. Die reproduzierbare Methode ermöglicht die Untersuchung der Eigenschaften und Kinetik der NET-Freisetzung nach Stimulation mit unterschiedlichen NETosis-Induktoren und ermöglicht die Beurteilung der Pharmakologie von NETosis-Antagonisten.

Echtzeit-Hochdurchsatz-Mikroskopische Quantifizierung der Freisetzung extrazellulärer Fallen bei humanen Neutrophilen und Bewertung der Pharmakologie von Antagonisten

Hier bieten wir einen zuverlässigen Ansatz für die Isolierung von Neutrophilen niedriger und normaler Dichte aus Vollblut mittels magnetischer Isolierung (negative Selektion) und diskontinuierlichem Dichtegradientenmedium. Es gewährleistet die unberührte Isolierung hochreiner Zellen (≥93%) und ermöglicht eine genaue nachgelagerte Analyse von Neutrophilen-Subpopulationen, die für das Verständnis ihrer Rolle bei Gesundheit und Krankheit entscheidend ist.

Die Isolierung und Charakterisierung von Neutrophilen niedriger und normaler Dichte aus Vollblut

Neutrophile niedriger Dichte (LDN) nehmen bei mehreren Krankheiten signifikant zu. LDN werden in der Regel durch Zellsortierung isoliert. Wir stellen eine praktische Methode vor, um reines und lebensfähiges LDN zu erhalten. Nach der Dichtegradientenzentrifugation von peripherem Blut werden die Zellen mit magnetischen Mikrokügelchen inkubiert und dann LDN durch magnetische Säulen getrennt.

Schnelle magnetische Mikrobead-Methode zur effizienten Aufreinigung von Neutrophilen niedriger Dichte

Lernen Sie die Isolierung humaner Neutrophilen aus Vollblut mittels Dichtegradienten-Zentrifugation. Diese standardisierte Methode ermöglicht reproduzierbare Forschung zur Immunantwort und Entzündung.

Neutrophile Isolation Protocol

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