Morphometrische Formanalysen: Die Analyse-Software-Werkzeugkaste zur Quantifizierung kraniofacialer Form bei Zebrafischen
February 27th, 2026
Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Quantifizierung der Kraniofacialform von Knorpelform mithilfe freier Software (tpsDigs2, MorphoJ und PAST), um Veränderungen der Gesichtsstruktur bei Zebrafischlarven zu messen.
Unsere Forschung verwendet morphometrische Software, um zu quantifizieren, ob Ethanol und BMP7a interagieren und subtile kraniofaceale Defekte bei Zebrafischen verursachen. Lineare Maße übersehen subtile Veränderungen. Mit dieser Methode verwenden wir Landmarken, um Formänderungen zu quantifizieren und gleichzeitig Größenunterschiede zu kontrollieren.
Um zu beginnen, öffne die tpsDigs2-Software. Klicken Sie auf Eingabequelle, dann Datei, und wählen Sie die gespeicherte TPS-Notizblockdatei aus. Klicken Sie auf Optionen, um die Option Bildwerkzeuge zu visualisieren.
Stellen Sie die Referenzlänge auf 100 Mikrometer ein und drücken Sie auf die Set-Skala. Klicken Sie auf OK, um die Skalierungsparameter zu bestätigen, und verlassen Sie dann das Fenster für Bildwerkzeuge. Klicken Sie dann auf das Zielsymbol und platzieren Sie das erste Orientierungszeichen an der Mittellinie zwischen den Meckel-Knorpeln.
Platziere die zweiten Orientierungspunkte an den bilateralen Gelenken zwischen Meckel- und Palatoquadrat-Knorpel. Platzieren Sie das dritte Wahrzeichen an der Mittellinie zwischen den ceratohyalen Knorpeln und das vierte Landmark an den bilateralen Gelenken zwischen Palatoquadrat- und ceratohyalen Knorpel. Dann werden die fünften Orientierungspunkte am distalen Ende der hyomandibulären Knorpel platziert, wobei die Orientierungspunkte für jedes Bild in derselben Reihenfolge platziert werden.
Nachdem Sie Orientierungspunkte platziert haben, klicken Sie auf Datei, um das Dropdown-Menü zu öffnen. Wähle Daten speichern und dann Überschreiben, um die aktualisierte Datei zu speichern. Verlasse die tpsDigs2-Software.
Starte die MorphoJ-Software. Klicken Sie auf Datei, wählen Sie Neuen Datensatz erstellen und weisen Sie dem Datensatz einen Namen zu. Klicken Sie auf TPS und wählen Sie die Notepad-Datei mit den neu hinzugefügten Datenpunkten aus.
Erstellen Sie dann den Datensatz. Klicken Sie im Projektbaum auf den Datensatz. Wählen Sie die Vorläufe aus, dann passen neue Procrustes an.
Wählen Sie "Nach Hauptachsen ausrichten" und klicken Sie auf "Procrustes Fit ausführen". Unter Vorläufen wählen Sie Kovarianzmatrix generieren, um Prokruste-Koordinaten zu erhalten. Führe die Funktion aus, wenn du aufgefordert wirst.
Wählen Sie nun Wireframe erstellen oder bearbeiten und die Punkte auf den Bildern verknüpfen. Klicken Sie auf verknüpfte Punkte und akzeptieren Sie oder erstellen Sie das Bild, dann bearbeiten Sie die Klassifikatoren bei Bedarf. Öffne ein Tabellenkalkulationsprogramm, während du MorphoJ offen hältst.
Geben Sie Klassifikatorinformationen wie GENOTYPE, TREATMENT und GENOTYPE TREATMENT ein. Speichern Sie dann die Datei als CSV-Datei. In MorphoJ klicken Sie auf Datei und wählen Sie Klassifikatorvariablen importieren, um die CSV-Datei zu importieren. Kehren Sie zum Projektbaum zurück und klicken Sie auf den Datensatz.
Unter Vorläufer wählen Sie Bearbeitende Klassifikatoren, um zu bestätigen, dass alle Bilder enthalten sind. Im Projektbaum wählen Sie CovMatrix aus und klicken Sie oben auf der Seite auf Variation. Wählen Sie die Principal Component Analysis, um die Principal Component Scores zu berechnen.
Klicken Sie auf PC-Werte, um das generierte Diagramm anzuzeigen. Rechtsklick auf den Graphen und wähle Confidence Ellipsis, um den gewünschten Klassifikator hinzuzufügen. Wählen Sie Farbdatenpunkte aus, weisen Sie Farben zu und klicken Sie auf OK, um Änderungen anzuwenden.
Unter Vorläufen wählen Sie unten auf dem Bildschirm Einstellungen für das Formdiagramm einsetzen. Wählen Sie Wireframe Graphs und passen Sie die Farben der Zielform, der Startform und der Zahlen an. Wähle die Variante aus, dann procrustes ANOVA.
Exportiere die PROCRUSTES ANOVA-Ergebnisse in die zuvor erstellte Tabellendatei. Wählen Sie in MorphoJ den ursprünglichen Datensatz im Project Tree aus. Klicken Sie auf Vergleich, dann auf Kanonische Variatenanalyse.
Wählen Sie die Klassifikatorvariablen GENOTYPE TREATMENT aus und führen Sie die Funktion aus. Um die Ergebnisse zu exportieren, klicken Sie auf den Reiter Ergebnisse und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Ergebnisseite. Wähle Exportieren in Datei und speichere die Ergebnisse.
Im Projektbaum wählen Sie die Kanonische Variatenanalyse und dann die Bewertung. Klicken Sie auf Datei, wählen Sie Datensatz exportieren, wählen Sie den Datentyp und GENOTYP BEHANDLUNG. Speichere die CVA-Ergebnisse als TXT-Datei.
Um die Datei für die PAST-Software vorzubereiten, öffnen Sie die gespeicherten CVA-Ergebnisse in einem Texteditor. Ersetze die Begriffs-ID in der oberen linken Ecke durch Label und speichere die bearbeitete Datei. Öffne die PAST-Software und klicke auf Datei, dann öffne sie, um die bearbeitete CVA-Punktedatei auszuwählen.
Im Importfenster. Wählen Sie Namen, Daten für Zeile und Spalte sowie Tab als Trennzeichen aus und klicken Sie dann auf Import. Unter dem Reiter Anzeigen wählen Sie Spaltenattribute aus.
Im Dropdown-Menü neben Typ weist Gruppe der ersten Spalte mit Klassifikatorvariablen zu. Heben Sie die Hauptkomponente oder die kanonischen Variatdatenspalten hervor. Wählen Sie Multivariate, dann Tests und wählen Sie Multivariate Normalität, um den Normalitätstest separat für Hauptkomponenten- und kanonische Variatendaten durchzuführen.
Klicken Sie auf die graue leere Zelle oben links über Typ, um den gesamten Datensatz auszuwählen. Wähle Multivariate, dann Tests und wähle multivariate Analyse der Varianten, um die Analyse durchzuführen. Exportiere die MANOVA-Ergebnisse in die zuvor erstellte Tabellenkalkulationsdatei.
Bilder des Viscerocraniums wurden für jede Larve in jedem Genotyp und jeder Behandlungsgruppe aufgenommen. Knorpel des Viscerocraniums wurde in einem repräsentativen Bild beschriftet, und auf jedem Bild wurden Landmarken platziert, um markierte Datensätze zu erzeugen. Hauptkomponente 1 machte etwa 34 % der gesamten Formvariation aus, Hauptkomponente 2 20 % der gesamten Formvariation.
Jede Hauptkomponente zeigte eine spezifische Variation in der viscerokranien Form im Vergleich zur durchschnittlichen Form aller viscerokranie. Die Hauptkomponentenanalyse zeigte überlappende Mittelwerte zwischen Genotyp- und Behandlungsgruppen ohne deutliche Clusterbildung. Ethanol-behandelte Wildtyplarven wiesen aufgrund der geringen Stichprobengröße eine hohe 95%ige Konfidenzellilipse des Mittelwerts auf.
Die kanonische Variate 1 stellte eine subtile Verkürzung oder Verlängerung des ceratohyalen Gelenks im magentafarbenen Drahtrahmen im Vergleich zum durchschnittlichen schwarzen Drahtrahmen dar. Kanonische Variate 2 zeigte eine mediale Verschiebung nur auf einer Seite des Viscerocraniums an den Gelenken zwischen Meckel-Palatoquadrat und Palatoquadrat-Ceratohyal. Ethanol-behandelte Wildtyplarven wiesen eine große 95%ige Konfidenzellilipse des Mittelwerts auf, die alle anderen Gruppen überlappte.
Die multivariate Analyse der Varianten zeigte einen signifikanten Gesamteffekt von Genotyp und Behandlung. Die größte Herausforderung ist die größte Herausforderung, die regelmäßig zu montieren. Geneigte Larve kann zu ungenauen Messungen führen und die Ergebnisse verändern.
Dieses Protokoll passt sich an verschiedene anatomische Strukturen an, analysiert 3D-Daten, erzeugt lineare Maße und hilft bei der Bestimmung experimenteller Stichprobengrößen. Zukünftige Studien werden weitere Genotyp-Ethanol-Sensitivitäten untersuchen, die Stichprobengrößen erweitern und diesen vielseitigen Werkzeugkasten auf verschiedene anatomische Strukturen anwenden.
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Overview
This article presents a detailed morphometric protocol for analyzing subtle craniofacial shape changes in zebrafish larvae following ethanol exposure, with a focus on gene-ethanol interactions. The approach leverages landmark-based geometric morphometrics and multivariate statistical analyses to quantify and compare facial skeletal variation, addressing challenges in assessing fetal alcohol spectrum disorders (FASD) phenotypes.
Key Study Components
Area of Science
- Developmental biology
- Genetics
- Morphometrics
- Toxicology
Background
- FASD encompasses a range of physical, cognitive, and behavioral disabilities caused by prenatal ethanol exposure.
- Facial skeletal abnormalities are a hallmark of FASD, but their analysis is complicated by genetic variability and subtle shape changes.
- Zebrafish are an effective model due to genetic similarity to humans, external fertilization, conserved craniofacial structures, and transparent larvae.
- Traditional linear measurements may miss subtle or complex shape changes, necessitating advanced morphometric approaches.
Purpose of Study
- To quantify subtle craniofacial defects resulting from ethanol and bmp7a gene interactions in zebrafish.
- To develop and demonstrate a reproducible workflow for landmark-based morphometric analysis of craniofacial shape.
- To enable pairwise and multivariate comparisons of facial morphology across genotypes and treatments.
Methods Used
- Landmark placement on viscerocranial cartilage images using tpsDigs2 software.
- Procrustes alignment, principal component analysis (PCA), and canonical variate analysis (CVA) using MorphoJ.
- Multivariate normality and MANOVA tests using PAST software.
- Statistical visualization and export of results for further analysis.
Main Results
- Principal component 1 and 2 accounted for 34% and 20% of total shape variation, respectively.
- PCA plots showed overlapping means among genotype and treatment groups, with no distinct clustering.
- Canonical variate analysis revealed subtle, localized shape changes in the viscerocranium, such as shortening/lengthening of the ceratohyal joint and medial shifts at specific cartilage joints.
- MANOVA indicated a significant overall effect of genotype and treatment on craniofacial shape.
Conclusions
- The morphometric protocol enables detection of subtle craniofacial shape changes that linear measures may miss.
- Consistent sample mounting is critical to avoid measurement artifacts.
- This workflow is adaptable to other anatomical structures and can be extended to 3D data and larger sample sizes in future studies.
Frequently Asked Questions
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:24
Adding Landmarks to Zebrafish Larvae Viscerocranium Images Using tpsDigs2 Software
1:48
Using MorphoJ to Analyze Cranofacial Shape by Procrustes ANOVA
4:26
Canonical Variate Analysis of the Dataset and MANOVA in PAST Software
6:43
Results
8:30
Conclusion
