Ein analytisches Werkzeug, das zelluläre Morphologie Änderungen von Dreidimensionale Fluorescence Images Quantifiziert

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine automatisierte Methode zur Analyse und Quantifizierung von Veränderungen in der Morphologie einer undefinierten Formzelle bereitzustellen, die aus dreidimensionalen konfokalen Fluoreszenzbildern entnommen wurde. Dies wird erreicht, indem zuerst das chemische Stimulationsexperiment durchgeführt wird, bei dem Zellen einbezogen werden, die mit Agonistenzellen behandelt werden, die mit Antagonisten behandelt werden, gefolgt von Agonisten und Zellen ohne Behandlung. Anschließend werden die Zellen für die Immunfluoreszenzanalyse vorbereitet.

Der zweite Schritt besteht darin, multispektrale dreidimensionale Fluoreszenzbilder zu erfassen. Als nächstes wird die dreidimensionale morphometrische Analyse mit ameris neuroscience, ameris XT und MATLAB-Computersoftware durchgeführt. Die phänotypischen Veränderungen einzelner Zellen, die durch dreidimensionale morphometrische Analyse sichtbar gemacht werden, werden dann in einem letzten Schritt analysiert und quantifiziert.

Letztendlich wird diese Softwareplattform verwendet, um Veränderungen der Zellform nach der Rezeptoraktivierung zu quantifizieren, was ein zusätzliches Werkzeug für die Wirkstoffforschung darstellt. Im Allgemeinen verfügen Forscher über eine Standardexpertise in biologischen Systemen und sind möglicherweise nicht mit der Computeranwendung vertraut. In diesem Protokoll im I 60 Modul, schließen Sie die Lücke zwischen der Visualisierung und der Computersprache Vor dem Start dieses Verfahrens.

Transfizieren Sie humane embryonale Nierenzellen mit Hämagglutinin, das als Corticotropin-Releasinging-Faktor-Rezeptor zwei oder CRF R zwei markiert ist, wie im schriftlichen Protokoll angegeben. CFR two ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor oder GPCR. Am Tag danach wird die Flammenabdeckung verrutscht und in eine Sechs-Well-Platte gelegt.

Geben Sie 10 Milliliter PBS in eine Durchstechflasche mit fünf Milligramm lyophilisiertem Polylysin und mischen Sie. Verdünnen Sie dann fünf Milliliter gelöstes Polylysin in 500 Millilitern PBS und geben Sie je zwei Milliliter der Mischung auf die Deckgläser. Lassen Sie die Platte mit den Deckgläsern 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Deckgläser nach 20 Minuten, indem Sie zwei Milliliter PBS hinzufügen und dann entfernen, wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal.

Nach der Ausgabe von zwei Millilitern DMEM mit 10%FBS-Medien geben Sie zwei bis fünf Tropfen Zellen auf die Deckgläser. Die Zellen sollten in der notwendigen Konzentration sein, um eine 60%ige Co-Flüssigkeit zu erreichen. Am nächsten Tag.

Inkubieren Sie die Zellen am nächsten Tag über Nacht bei 37 Grad Celsius. Vergewissern Sie sich, dass die Zellen für die Agonistenbehandlung zu 60 % konfluent sind. Stimulieren Sie die benannten Zellen, indem Sie das Medium durch zwei Milliliter Medium ersetzen, das mit dem beiden endogenen Liganden Corticotropin Releasing Factor CRF R in einer Konzentration von einem Mikromolar ergänzt wird.

Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator, damit die Zellen mit einem Antagonisten vorbehandelt werden können. Das Medium wird durch zwei Milliliter Medium ersetzt, das mit dem selektiven CFR-Zwei-Antagonisten Anti-Salvaging 30 in einer Konzentration von einem Mikromolar ergänzt wird. Inkubieren Sie die Zellen in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator für 30 Minuten.

Nach der Behandlung mit Antagonisten. Stimulieren Sie die Zellen mit dem Agonisten CRF und inkubieren Sie ihn 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius für unbehandelte Zellen. Ersetzen Sie das Medium nach der Behandlung durch zwei Milliliter frisches Medium.

Ersetzen Sie das Medium in jeder Vertiefung durch zwei Milliliter frisches Medium und fügen Sie nach einer 60-minütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius ein bis tausend verdünntes Anti-HHA hinzu. Aspirieren Sie das Medium und fügen Sie jeweils zwei Milliliter Fixiermittel hinzu. Inkubieren Sie die Platte nach dem Ansaugen des Fixiermittels 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die Zellen dreimal mit Tris-Puffersalzlösung. Kain. Geben Sie 100 Mikroliter Blutlösung auf jede Abdeckung, lassen Sie sie gleiten und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie dann die vorhandene Blotto-Lösung aus den Vertiefungen und geben Sie 100 Mikroliter frischen Sekundärantikörper-Cocktail auf jeden Deckglas, nachdem Sie 45 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert und viermal mit TBSC gewaschen wurden, indem Sie die Lösung vorsichtig von der Seitenwand der Vertiefung hinzufügen und entfernen, während sie sich noch in der endgültigen Waschlösung befindet.

Nehmen Sie jeden Deckglas mit einer Nadel und einer gebogenen Pinzette auf. Legen Sie die Eindeckzellen mit der Vorderseite nach unten auf einen Objektträger mit einem Tropfen Vector Shield Montagemedium mit Dappy Fix, Nagellack und lassen Sie es 15 bis 20 Minuten trocknen. Alexa, 4 88 Nanometer konjugierter Muse-Antikörper wird verwendet, um CFR zwei zu visualisieren, und DAPI wird verwendet, um das mitotische Kernstadium zu visualisieren, um mit der Montage der Fixzellen auf einem Fluoreszenzmikroskop zu beginnen, um die experimentelle Subjektivität zu begrenzen und die experimentellen Bedingungen unbekannt zu halten, bis die Bilder aufgenommen und analysiert wurden, um Bilder zu erfassen.

Ein Plan Acro Mat Öl, DIC-Objektiv mit 63-facher Vergrößerung und 1,4 numerischer Apertur wurde in Kombination mit dem zeis LSM five 10 Meta-Konfokalmikroskop verwendet, das mit einem kohärenten integrierten Zwei-Photonen-Lasersystem verbunden ist. Während des Datenerfassungsprozesses werden die Zellen sowohl durch Mehrkanal- als auch durch c-Partitionierung unterteilt, um Daten von der Kernmembran zu den äußeren extrazellulären Rezeptorenden aufzunehmen. Verarbeiten Sie die Fluoreszenzdaten mit amris, was die Visualisierung und Segmentierung eines 3D-Mikroskopie-Datensatzes ermöglicht. Befolgen Sie zunächst den von Amaris entwickelten Algorithmus und verwenden Sie das Oberflächen-Rendering, um die NU-Kernmembran darzustellen.

Amaris bestimmt, ob es mehr als einen Kern in der Region of Interest (ROI) gibt. Verwenden Sie als Nächstes den Spoterstellungsalgorithmus, um die beiden CFR-Erweiterungspunkte zu lokalisieren. Kompensiert Hintergrundrauschen und unregelmäßige Intensität des komplexen Netzwerks amorph geformter Zellen, um die Einbeziehung jeder Einheit der Fluoreszenzdetektion von CFR zwei zu maximieren, und stellt den Spotdurchmesser auf 0,2 Mikrometer ein, was die kleinste Einheit im Bild ist.

Dies ermöglicht die Extrapolation eindeutiger Informationen in Form einer gemessenen Intensität. Integrieren Sie mithilfe eines Gaußschen Filters die Spot-Filterung in den automatisierten Erstellungsprozess des Spots. Um Datenkation zu vermeiden, konvertieren Sie das Dataset von einem Acht-Bit-Festkomma in einen 32-Bit-Gleitkommawert.

Wählen Sie die erstellte Oberfläche aus, und bestimmen Sie die genaue räumliche Position jedes Punktes außerhalb der Kernoberfläche, indem Sie eine Entfernungstransformation mit der Kernmembran als Referenzpunkt durchführen. Tauschen Sie die Voxelintensitätsdaten aus, um Koordinatendaten mit dem ameris XT-Modul zu erkennen, das mit MATLAB verbunden ist. Wählen Sie die Punkte aus und wählen Sie die Statistik, die in statistischem Typ codiert ist.

Wählen Sie das Intensitätszentrum aus, das im neu erstellten Kanal gemeldet wird. Laden Sie die gewünschte Farbe für die Anzeige und legen Sie den Farbkartenbereich für die Analyse fest. Die numerischen Daten können auf der Registerkarte "Statistik" visualisiert und mit dem GraphPad-Prisma nach Excel exportiert werden.

Quantifizieren Sie die resultierenden Daten und präsentieren Sie sie in grafischer Form für die statistische Analyse. Führen Sie Vergleiche zwischen Gruppen mit bidirektionalen Inova- und Bonferroni-Daten durch, die nach dem Test als Mittelwert plus oder minus Standardabweichung dargestellt werden. Um die Leistungsfähigkeit dieses Ansatzes zu demonstrieren, werden die zellulären Veränderungen, die sich aus der Interaktion von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und dem Corticotropin-Releasing-Faktor-Rezeptor zwei mit seinem endogenen Liganden CRF ergeben, untersucht.

In transfizierten HT K 2 93 Zellen wurden fusionierte Bilder mit Alexa 4 88 konjugierten, Anti-Maus-, Sekundärantikörpern und DPI visualisiert, um die Zellkerne sichtbar zu machen. Die Ergebnisse zeigen, dass sich die beiden Rezeptoren von CRF R in der Plasmamembran befinden und aus endlichen Bereichen der Membran der Zellen projizieren. Mit Hilfe der konventionellen 2D-Analyse ist es nur möglich, diese Untergruppe der extrazellulären CRF R-Rezeptoren zu detektieren, wenn die Rezeptoradhäsionspunkte auf den Glasabdeckungen analysiert werden.

Folglich gehen alle anderen Informationen, die aus ZS-gestapelten MULTISPECTRAL-Daten abgeleitet wurden, verloren. Das Ergebnis wählte keinen Unterschied zwischen keiner Behandlung und Agonist. Während sich die Rezeptoradhäsionspunkte dramatisch unterscheiden, wenn die Zellen mit CRF behandelt werden, sind die extrazellulären Rezeptoren stark reduziert, wie die Verringerung des Abstands der Spots von der Plasmamembran zeigt.

Sie werden auch von primär begrenzten Orten in eine Reihe diskreter Orte umverteilt. Die Wirkung von CRF auf die Verteilung der Rezeptormembran wird durch eine Vorbehandlung mit den CR zwei spezifischen Antagonisten verhindert. 30 30.

Unter diesen Bedingungen verändern sich die beiden CRFR-Verlängerungen durch die CRF-Behandlung nicht. Die distale Verteilung der Flecken, die in farbcodierten Intervallen von fünf Mikrometern aufgetragen sind, wird verwendet, um den Abstand der Voxel von der Kernmembran zu visualisieren. Keine Behandlung und die Vorbehandlung mit Antagonisten vor der Agonistenbehandlung zeigten keinen signifikanten Unterschied in der GPCR-Kontraktion.

Die Behandlung der Zellen mit dem Agonisten CRF reduziert schrittweise die Anzahl der CFR-2-haltigen Voxel im Vergleich zu keiner Behandlung oder im Vergleich zu Zellen. Nach seiner Entwicklung mit Antagonist As vorbehandelt. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Quantifizierung der Bildgebungstechnik den Weg, um zahlreiche phänotypische Veränderungen einzelner Zellen zu erforschen und zu charakterisieren, was diesen zellbasierten Assay zu einem zusätzlichen Werkzeug zur Erstellung von Einzelzellprofilen für den Wirkstoffforschungsprozess machte.