Ein analytisches Werkzeug, das zelluläre Morphologie Änderungen von Dreidimensionale Fluorescence Images Quantifiziert

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine automatisierte Methode zur Analyse und Quantifizierung von morphologischen Veränderungen einer Zelle mit unbestimmter Form bereitzustellen, die aus dreidimensionalen konfokalen Fluoreszenzbildern stammt. Dies wird erreicht, indem zunächst ein chemisches Stimulationsexperiment durchgeführt wird, das Zellen umfasst, die mit einem Agonisten behandelt wurden, Zellen, die mit einem Antagonisten und anschließend mit einem Agonisten behandelt wurden, sowie Zellen ohne Behandlung. Anschließend werden die Zellen für die Immunfluoreszenzanalyse vorbereitet.

Der zweite Schritt besteht darin, multispektrale dreidimensionale Fluoreszenzbilder aufzunehmen. Anschließend wird eine dreidimensionale morphometrische Analyse mit der Computer-Software ameris neuroscience, ameris XT und MATLAB durchgeführt. Die auf diese Weise sichtbargemachten phänotypischen Einzelzellveränderungen werden dann im letzten Schritt analysiert und quantifiziert.

Schließlich wird diese Softwareplattform verwendet, um Formveränderungen der Zellen nach Aktivierung von Rezeptoren zu quantifizieren und bietet damit ein zusätzliches Werkzeug für die Arzneimittelforschung. Im Allgemeinen verfügen Forscher über standardmäßige Kenntnisse in biologischen Systemen, sind jedoch möglicherweise nicht mit Computeranwendungen vertraut. In diesem Protokoll im I 60-Modul wird vor Beginn dieses Verfahrens die Lücke zwischen der Visualisierung und der Computersprache geschlossen.

Transfizieren Sie humane embryonale Nierenzellen mit einem Hämagglutinin-markierten Corticotropin-freisetzenden-Faktor-Rezeptor Typ zwei oder CRF-R-Typ-zwei, wie im schriftlichen Protokoll angegeben. CRF-Typ-zwei ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor oder GPCR. Am Tag nach der Transfektion flammen Sie Deckgläser ab und geben sie in eine 6-Loch-Platte.

Geben Sie 10 Milliliter PBS zu einem Gefäß mit fünf Milligramm lyophilisiertem Polylysin hinzu und mischen Sie es. Verdünnen Sie anschließend 5 Milliliter des gelösten Polylysin in 500 Milliliter PBS und geben Sie 2 Milliliter der Mischung auf jede Deckglasabdeckung. Lassen Sie die Platte mit den Deckgläsern 20 Minuten bei Raumtemperatur. Nach 20 Minuten waschen Sie die Deckgläser, indem Sie jeweils 2 Milliliter PBS hinzufügen und anschließend entfernen; wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal.

Nach der Zugabe von zwei Millilitern DMEM mit 10 % FBS-Medium geben Sie zwei bis fünf Tropfen Zellen auf die Deckgläser. Die Zellen sollten in der erforderlichen Konzentration vorliegen, um eine Konfluenz von 60 % zu erreichen. Am nächsten Tag.

Inkubieren Sie die Zellen am folgenden Tag über Nacht bei 37 Grad Celsius. Überprüfen Sie, ob die Zellen zu 60 % konfluent sind, um eine Behandlung mit dem Agonisten durchzuführen. Stimulieren Sie die vorgesehenen Zellen, indem Sie das Medium durch zwei Milliliter Medium ersetzen, das mit dem endogenen Liganden des CRF-R2, dem corticotropinreleasing Faktor, in einer Konzentration von einem Mikromolar ergänzt wurde.

Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius warmen Inkubator, damit die Zellen mit dem Antagonisten vorbehandelt werden können. Ersetzen Sie das Medium durch zwei Milliliter Medium, das mit dem selektiven CFR-2-Antagonisten Anti-Salvaging-30 in einer Konzentration von einem Mikromolar ergänzt wurde. Inkubieren Sie die Zellen weitere 30 Minuten in einem 37 Grad Celsius warmen Inkubator.

Nach der Antagonistenbehandlung. Stimulieren Sie die Zellen mit dem Agonisten CRF und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius für unbehandelte Zellen. Ersetzen Sie das Medium nach der Behandlung durch zwei Milliliter frisches Medium.

Ersetzen Sie das Medium in jeder Vertiefung durch zwei Milliliter frisches Medium und geben Sie Anti-HHA im Verdünnungsverhältnis 1:1000 hinzu, nach einer 60-minütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius. Aspirieren Sie das Medium und geben Sie zwei Milliliter Fixansatzmittel in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platte nach dem Absaugen des Fixansatzmittels 20 Minuten bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die Zellen dreimal mit Tris-gepuffertem Salzlösung. Fügen Sie 100 Mikroliter Blutlösung auf jede Deckglasprobe hinzu und inkubieren Sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Danach aspirieren Sie die vorhandene Blotto-Lösung aus den Vertiefungen und geben 100 Mikroliter frische sekundäre Antikörper-Cocktail-Lösung auf jedes Deckglas. Nach einer 45-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln waschen Sie viermal mit TBSC, indem Sie die Lösung vorsichtig an der Seitenwand der Vertiefung hinzufügen und entfernen, während sich die Probe noch in der letzten Waschlösung befindet.

Nehmen Sie jede Deckglas mit einer Nadel und einer gebogenen Pinzette auf. Legen Sie das Deckglas mit den Zellen nach unten auf einen Objektträger mit einem Tropfen Vektor-Shield-Montagemedium mit Dappy-Fix, fixieren Sie es mit Nagellack und lassen Sie es 15 bis 20 Minuten trocknen. Ein Alexa-488-Nanometer-Konjugat-Muse-Antikörper wird verwendet, um CFR zwei sichtbar zu machen, und DAPI dient zur Visualisierung der Kerne im mitotischen Stadium. Bringen Sie die fixierten Zellen zur Begrenzung der experimentellen Subjektivität auf einem Fluoreszenzmikroskop zur Bildaufnahme an, wobei die experimentellen Bedingungen bis zur Bildaufnahme und -analyse unbekannt bleiben sollen.

Ein Plan-Achromat-Öl-Objektiv mit 63-facher Vergrößerung und einer numerischen Apertur von 1,4 wurde in Kombination mit dem Zeiss LSM 510 Meta-Konfokalmikroskop verwendet, das an ein kohärentes integriertes Zwei-Photonen-Lasersystem angeschlossen ist. Während des Datenerfassungsprozesses kompartimentieren Sie die Zellen sowohl mittels Mehrkanal- als auch mittels c-Partitionierung, um Daten vom nuklearen Membranbereich bis hin zu den äußeren extrazellulären Rezeptorextremitäten einzubeziehen. Verarbeiten Sie die Fluoreszenzdaten mit Amaris, wodurch die Visualisierung und Segmentierung eines 3D-Mikroskopiedatensatzes ermöglicht wird. Verwenden Sie nach dem von Amaris entworfenen Algorithmus zunächst die Oberflächenrekonstruktion, um die nukleare Membran darzustellen.

Amaris wird bestimmen, ob sich mehr als ein Kern in der Region von Interesse (ROI) befindet. Anschließend verwenden Sie den Algorithmus zur Erzeugung von Spots, um die CFR-2-Extensionsspots zu lokalisieren. Um Hintergrundrauschen und unregelmäßige Intensität des komplexen Netzwerks aus amorph geformten Zellen auszugleichen und die Erfassung jeder Einheit der Fluoreszenzdetektion von CFR-2 zu maximieren, stellen Sie den Spotdurchmesser auf 0,2 µm ein, was der kleinsten Einheit innerhalb des Bildes entspricht.

Dies ermöglicht die Extrapolation von unterschiedlichen Informationen in Form einer gemessenen Intensität. Unter Verwendung eines Gauß-Filters integrieren Sie die Spot-Filterung in den automatisierten Erstellungsprozess der Spots. Um Datenkation zu vermeiden, konvertieren Sie den Datensatz von 8-Bit-Festkomma- auf 32-Bit-Gleitkommadarstellung.

Wählen Sie die erstellte Oberfläche aus und bestimmen Sie die exakte räumliche Position jedes Punktes außerhalb der nuklearen Oberfläche, indem Sie eine Distanztransformation unter Verwendung der Kernmembran als Bezugspunkt durchführen. Wandeln Sie die Voxelintensitätsdaten in Spot-Koordinatendaten um, indem Sie das mit MATLAB verbundene Ameris-XT-Modul verwenden. Wählen Sie die Spots aus und wählen Sie den in der statistischen Art codierten Wert aus.

Wählen Sie das Intensitätszentrum aus, das im neu erstellten Kanal gemeldet wird. Laden Sie die gewünschte Farbe zur Anzeige und stellen Sie den Farbskala-Bereich für die Analyse ein. Die numerischen Daten können im Statistik-Tab angezeigt und mithilfe von GraphPad Prism in Excel exportiert werden.

Quantifizieren Sie die resultierenden Daten und stellen Sie sie grafisch zur statistischen Analyse dar. Führen Sie Vergleiche zwischen Gruppen mithilfe einer zweifaktoriellen Inova und dem Bonferroni-Post-Test durch, und geben Sie die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung an. Um die Leistungsfähigkeit dieses Ansatzes zu demonstrieren, werden die zellulären Veränderungen dargestellt, die aus der Wechselwirkung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und dem Corticotropin-freisetzenden Faktor-Rezeptor 2 mit seinem endogenen Liganden CRF resultieren.

In transfizierten HT K 2 93 Zellen wurden fusionierte Bilder quantifiziert, die mithilfe eines mit Alexa 4 88 konjugierten sekundären Antimaus-Antikörpers und DPI zur Visualisierung der Zellkerne dargestellt werden. Die Ergebnisse zeigen, dass sich die CRF R zwei Rezeptoren in der Plasmamembran befinden und von begrenzten Bereichen der Zellmembran ausgehen. Mithilfe einer herkömmlichen 2D-Analyse ist es nur möglich, diesen Teilbestand an extrazellulären CRF R zwei Rezeptoren nachzuweisen, wenn die Adhäsionsstellen der Rezeptoren auf den Glasdeckeln analysiert werden.

Daher gehen alle weiteren Informationen, die aus ZS-gestapelten MULTISPEKTRAL-Daten abgeleitet werden, verloren. Das Ergebnis zeigte keinen Unterschied zwischen keiner Behandlung und der Behandlung mit einem Agonisten. Während die Rezeptoradhäsionsstellen sich dramatisch unterscheiden, wenn die Zellen mit CRF behandelt werden, sind die extrazellulären Rezeptoren stark reduziert, wie die Abnahme des Abstands der Flecken zur Plasmamembran zeigt.

Sie werden außerdem von hauptsächlich begrenzten Orten in eine Reihe diskreter Lokalisationen umverteilt. Die Wirkung von CRF auf die Verteilung der Rezeptoren in der Membran wird durch eine Vorbehandlung mit den spezifischen Antagonisten von CR2 verhindert. 30 30.

Unter diesen Bedingungen verändern sich die CRFR-Zwei-Enden nicht durch die CRF-Behandlung. Die distale Verteilung von Punkten, die in fünf Mikrometer-Spektrum farbkodierten Intervallen dargestellt sind, wird verwendet, um den Abstand der Voxel von der Kernmembran zu visualisieren. Keine Behandlung und Vorbehandlung mit Antagonist vor der Behandlung mit Agonist zeigten keinen signifikanten Unterschied in der GPCR-Kontraktion.

Die Behandlung der Zellen mit dem Agonisten CRF verringert schrittweise die Anzahl der Voxeln, die CFR zwei enthalten, im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle oder zu Zellen, die mit dem Antagonisten As vorbehandelt wurden, nach dessen Entwicklung. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der quantitativen Bildgebungstechnik, zahlreiche phänotypische Einzelzellveränderungen zu erforschen und zu charakterisieren, wodurch dieser zellbasierte Assay zu einem zusätzlichen Werkzeug für das Einzelzell-Profilings im Arzneimittelentdeckungsprozess wurde.