Visualisierung von Craniofacial Entwicklung in den sox10: kaede transgener Zebrafische Zeile mit Zeitraffer-konfokale Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, eine Live-Zeitrafferaufzeichnung der Migration von Neuralleistenzellen zu erstellen, um die Bildung der sich entwickelnden kranialen Gesichtsstrukturen zu zeigen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein anästhesierter transgener SOX 10 KD-Zebrafisch in Agarose montiert wird, um die Bewegung während des Experiments zu minimieren. Als nächstes wird unter einem konfokalen Mikroskop eine UV-Photoaktivierung durchgeführt, um KD in Neuralleistenzellen von grün nach rot umzuwandeln.

Dann konzentrieren Sie sich auf die fotokonvertierten Neuralleistenzellen. Es wird ein Zack der sich entwickelnden Struktur generiert, bevor ein Zeitraffervideo aufgenommen wird. Es werden Ergebnisse erzielt, die die Entwicklung von kranialen Neuralleistenzellen zum primären Gaumen des Zebrafisches in einem transgenen SOX 10 KD-Zebrafischembryo zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. der statischen Bildgebung, besteht darin, dass komplexe Entwicklungsprozesse wie die Zellmigration in Echtzeit visualisiert werden können. Dadurch werden die Ergebnisse für die wissenschaftliche Gemeinschaft besser zugänglich. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen der Entwicklungsbiologie zu beantworten, z. B. wie sich aus Neurokammzellen abgeleitete Strukturen bilden und wie PTO-Gene ihre Entwicklung beeinflussen.

Zur Vorbereitung der sich auflösenden Embryonen wird E mit einem 125-Milliliter-Kolben mit Wasser E drei mit der Aeros-Mikrowelle mit niedrigem Schmelzpunkt vermischt, um die Lösung aufzulösen. Fügen Sie dann Trica hinzu und legen Sie den Kolben in ein 50 Grad Celsius heißes Wasserbad, um die Krawatten 60 Stunden nach der Befruchtung hell fluoreszierend fluoreszierend zu halten und zu verschachteln. Übertragen Sie sie dann jeweils auf einen Kammerobjektträger mit Seidenpapier.

Saugen Sie das überschüssige E drei Wasser auf und verwenden Sie dann die Agarro-Lösung, um den Embryo zu bedecken. Verwenden Sie eine Mikroladerspitze, um den Embryo perfekt dorsal zu positionieren und sicherzustellen, dass die Embryonen vollständig in Agarro eingetaucht sind. Nachdem die Agarro ausgehärtet sind, verwenden Sie E drei 0,015 % Trica, um den Kammerschieber zu füllen und die Fotokonvertierung durchzuführen.

Beginnen Sie mit einem 20-fachen Luftimmersionsobjektiv, um sich auf den Embryo zu konzentrieren. Drücken Sie dann die Lichttaste L 100 am Mikroskop und wählen Sie die Kanäle in der Software aus. Öffnen Sie die Symbole.

Zeigen Sie die Erfassungsregler A one settings an und klicken Sie auf die konfokale Setup-Schaltfläche. Klicken Sie anschließend auf Auto und wählen Sie DPI 4, 88 und 561.9 für die Kanäle 1, 2 bzw. 3, bevor Sie das Fenster wieder schließen. Schalten Sie dann die Kanäle eins und drei aus, bevor Sie auf die Schaltfläche "Interlock entfernen" klicken und die Scan-Taste ab einem Bild pro Sekunde und HV 200 drücken.

Beginne, dich auf interessante Zellen zu konzentrieren. Allmähliches Erhöhen der Bilder pro Sekunde auf eins pro 32 und Reduzieren der Spannung auf 100 bis 120, abhängig vom Hintergrundrauschen. Wenn der Embryo scharf gestellt ist, greifen Sie den grünen Rand am rechten Bildschirmrand und verkleinern Sie ihn so, dass er in den Bereich passt, der fotografisch konvertiert werden soll, bevor Sie mit der rechten Maustaste klicken.

Ändern Sie die Bilder pro Sekunde auf eins und den HV auf 200 und drücken Sie Scan. Ein vergrößertes Bild des Fotokonvertierungsbereichs ist nun sichtbar. Nächstes Foto.

Konvertieren Sie Zellen, indem Sie Kanal eins für fünf bis 60 Sekunden einschalten, bis das grüne KD-Signal fast nicht mehr vorhanden ist. Schalten Sie dann den Papay-Kanal aus. Aktivieren Sie die Kanäle zwei und drei, um zum ursprünglichen Zoom zurückzukehren.

Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Zoom-Fenster und wählen Sie Zurück zur Originalgröße, um zu überprüfen, ob die gewünschten Zellen ordnungsgemäß in Fotos konvertiert wurden. Legen Sie die Grenzen des Zack fest, indem Sie das Symbol "Capture Z Series" in der Menüleiste auswählen. Passen Sie die Nachschlagetabellen oder UTs an, um einen Zeitraffer einzurichten.

Wählen Sie das Kontrollkästchen Eine einfache GUI aus und aktivieren Sie die folgenden Einstellungen. Eines pro 32 Bilder pro Sekunde. Größe 1024 und durchschnittlich vier oder acht x je nach Anzahl der Z-Stacks, die in einer Schleife genommen werden müssen.

Gehen Sie als Nächstes zu Ansicht der Erfassungssteuerungen der ND-Sequenz und legen Sie den Zeitrahmen fest. Klicken Sie dann auf "Kontinuierlich" und dann auf "Zack". Legen Sie die Ränder fest, wie zuvor gezeigt.

Starten Sie den Film, geben Sie E drei 0,015%ige Trica-Lösung in die Kammer, gleiten Sie den ganzen Tag über und füllen Sie die Kammer vollständig für die Bildgebung über Nacht. Wenn die Bildgebung abgeschlossen ist, erstellen Sie ein Video in hoher Qualität aus der Bildgebungsdatei, indem Sie auf Projektion mit maximaler Intensität anzeigen klicken. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf das Bild und erstellen Sie ein neues Dokument.

Löschen Sie nicht benötigte Rahmen und passen Sie die Größe an. In diesem Film, der Palato Genesis im Zebrafisch zeigt, wird die transgene SOX 10 K-Linie verwendet, um die Zellen der kranialen Neuralleiste bei ihrer Entwicklung zur Bildung des primären Gaumens zu verfolgen. Die vordersten Zellen des sich bildenden Gaumens werden 60 Stunden nach der Befruchtung von grün nach rot photokonvertiert.

Wenn sich die paarigen Trabekel getroffen haben, um den primären Gaumen zu bilden, werden diese Zellen bis zu ihrem endgültigen Bestimmungsort verfolgt. Dieser Film zeigt eine gestörte Gaumenentwicklung, die zur Bildung einer orofazialen Spalte führt, einem Morino-vermittelten Knockdown des Flecks. Als Beispiel wird ein Gen verwendet, das an schrägen Gesichtsspalten beteiligt ist.

Bei 60 HPF zeigt sich bei der einseitigen Photokonversion der vordersten Siebbeinplattenzellen ein Versagenserguss zwischen der medianen und der lateralen Siebbeinplattenzelle. Dieser Defekt ähnelt der Pathogenese der Entwicklung einer schrägen Gesichtsspalte beim Menschen, bei der ein Versagenserguss zwischen dem lateralen Nasenfortsatz und der Oberkieferprominenz auftritt. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie den Weg, um die Entwicklung von Neurokammzellen im Zebrafisch zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie diese Methode verwenden können, um Ihren Entwicklungsprozess von Interesse zu erfassen.