Name: Visualisierung von Craniofacial Entwicklung in den sox10: kaede transgener Zebrafische Zeile mit Zeitraffer-konfokale Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Lernen Sie die Zeitraffer-Mikroskopie zur Visualisierung der Neuralleisten-Zellmigration in Danio rerio Embryonen. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Beobachtung kraniofazialer Entwicklungsprozesse.

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Die Autoren danken für die freundliche Robert Kelsh teilen die Zebrafisch-Promotor sox10 Reagenz.

1. Embryo-Sammlung für Photokonversion <ol><li> Kaede transgenen Zebrafisch zwischen 5 und 18.00 Uhr am Abend: Bis mindestens zehn Paar sox10 ein. </li><li> Am nächsten Morgen, Trennwände ziehen und sammeln Eier gegen Mittag. Übertragen Sie sie auf Petrischalen und sie in 28,5 ° C Inkubator. </li><li> Mit rund 24 Stunden nach der Befruchtung, reinigen Sie die Petrischalen durch die Beseitigung von toten Embryonen. Überprüfen Sie das Entwicklungsstadium der Embryonen 13 mit Lichtfeld-Mikroskopie und jede Fluoreszenzmikroskop mit enhanced green fluorescent protein (EGFP)-Filter. Kaede wird durch diesen Filter sichtbar sein. </li><li> Wenn Embryonen erreichen 60 hpf Transfer fünf hell fluoreszierende Embryonen in einem separaten Petrischale und dechorionate sie gegebenenfalls. </li></ol> 2. Montage der Embryo für Photokonversion <ol><li> Montieren Sie den Embryo mit einem normalen Fluoreszenz-Mikroskop. Montage von Embryonen auf konfokalen Mikroskop ist sehr anspruchsvoll. </li><li> Verwenden Standard E3 Wasser oder frisch zubereiten E3 mit dem folgenden Rezept: Fügen Sie den folgenden pro einem Liter destilliertem Wasser dH 2 O, Folgendes zu 1x E3L machen: 0,292 g 5,0 mM NaCl 0,013 g KCl 0,17 mm 0,044 g CaCl 2 0,33 mm (Trockenmittel, 96%, ACS Reagens) 0,081 g 0,33 mM MgSO 4 (wasserfrei) Optional: mit 200 ul von 0,05% Methylenblau auf 1X E3 als Fungizid und umrühren. Medium hält bei Raumtemperatur für 1 Woche. </li><li> Verwenden Sie Standard-Tricaine oder bereiten Tricaine mit folgender Rezeptur: Für 5 L von 0,2% Tricaine die folgenden Zutaten mischen: 45 ml Tris-Cl (pH 9,5 1M) 5 LH 2 O 10 g Tricaine </li><li> Vorbereiten &quot;Film-Saft&quot; (50 ml E3, 0,015% Tricaine Lösung), durch Zugabe von 3,75 ml 0,2% auf 46,25 ml Tricaine E3. </li><li> Agarose vorbereiten, indem man 46,25 ml E3 Wasser mit 46,35 mg niedrigen Schmelzpunkt (LMP) Agarose in einem 50 ml Glaskolben und lösen Feststoffpartikel durch die Mikrowelle. Dann fügen3,73 ml 0,2% Tricaine an Agarose und legte Glaskolben mit Agarose in 50 ° C im Wasserbad bis zur Nutzung. </li></ol> 3. Vorbereitung und Montage der Embryo <ol><li> Anesthetize Embryonen mit E3/0.015% Tricaine Lösung in Schritt 1.1.2 und Transfer Embryo Kammer Bogen aus. </li><li> Genießen Sie alle überschüssige E3 mit Papiergewebe und der Put-Agarose auf Embryo. </li><li> Position Embryo perfekt dorsal mit Microloader Tipps. Stellen Sie sicher, die ganze Embryo nicht auf dem Agarose schweben, aber schieben Sie den ganzen Körper nach unten. Dann gießen E3/0.015% Tricaine Lösung über Agarose eingebettet Embryo bis Kammer ist vollständig mit Flüssigkeit gefüllt. </li></ol> 4. Anpassen der Software-Einstellungen auf Konfokalmikroskop <ol><li> Verwenden 20X Lufteint Ziel (numerische Apertur 0,75; Pinholegröße 20) zur Fokussierung des Embryos. Drücken Sie dann die L100 Licht-Taste am Mikroskop und wählen Sie Kanäle in der Software. Öffnen Sie die Icons sehen / Erwerb controls/A1settings und click die konfokale Setup-Taste. Nächstes klicken Sie auf &quot;Auto&quot; und wählen Sie folgende Kanäle vor dem Schließen des Fensters wieder: K1: DAPI-Kanal 403,4 nm (Wellenlängen können zwischen 350 bis 410 nm verwendet werden) Ch2: 488,0 nm Ch3: 561,9 nm </li></ol> 5. Photo <ol><li> Schalten Sie Kanal 1 und 3, und schalten Sie Ch2, bevor Sie auf den Entfernen-Taste Verriegelung und Scannen. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf Zellen von Interesse für Photo, was ist am besten, indem Sie mit 1frame/sec und Hochspannung (HV) 200 und dann hinauf in den Frames / sec und die Senkung der HV entsprechend bis zur 1/32 Frames / s und HV rund getan 100-120, abhängig von dem Hintergrundrauschen. </li><li> Wenn der Embryo im Fokus ist, sehen Sie auf der rechten Bildschirmrand, greifen die grünen Rand und verkleinert so den Bereich von Interesse für Photo und klicken Sie rechts mit der Maus passt. Kleiner ist besser, weil die Photo ist irreversibel. </li><li> Drehen Sie Bilder / s auf 1 und HV 200 und schlugscannen. Ein Bild gezoomt in der Fläche der Photo ist jetzt sichtbar. </li><li> Photoconvert Zellen durch Drehen auf Kanal 1 (403,4 nm). Aussetzen des photoconverting Laser überall 5-60 Sekunden, abhängig von der Größe des Bereichs, bis die grüne kaede wie durch die GFP-Kanal gesehen ist fast nicht vorhanden. </li><li> Wenn das grüne Signal kaede fast abwesend, schalten K1 aus. Schalten Ch2 und 3 auf. Dann klicken Sie rechts auf die Fenster auf A1 Scanbereich Feld ein und klicken &quot;Rückkehr zur Originalgröße&quot;, um zu überprüfen, ob gewünschten Zellen wurden photokonvertiertem. </li></ol> 6. Einen Z-Stapel <ol><li> Finden Sie das Symbol &quot;Capture Z-Serie&quot; in der Menüleiste und stellen Sie Ober-und Untergrenzen der Z-Stapel, bevor Sie es. Stellen LUTs. </li></ol> 7. Software-Einstellungen Time-lapse <ol><li> Zum A1Simple GUI-Box und kreuzen Sie folgende Einstellungen vor: 1/32 Bilder / s Größe 1024 durchschnittlich 4 oder 8X abhängig von der Anzahl von Z-Stapeln, die in einer Schleife gezogen werden muss </li><li> Gehen Sie zu:view / Erwerb Kontrollen / ND Sequenzerfassung und Zeitrahmen festgelegt (8-30min), klicken Sie auf kontinuierliche und klicken Sie auf Z-Stapel. Legen Grenzen getestet, wie vor und Film starten. </li><li> Halten Sie das Hinzufügen E3/0.015% Tricaine Lösungskammer Folie den ganzen Tag. In der Nacht, füllen Sie Kammer vollständig. Das wird bis zum nächsten Morgen dauern. </li><li> Am nächsten Morgen füllen E3/0.015% Tricaine Lösung und prüfen, ob Embryo noch lebt. Verlust der Fluoreszenz zeigt Tod. Weiter Minen und prüft, den ganzen Tag. </li><li> Wenn die Struktur bilden abgeschlossen, oder der Embryo gestorben ist, beenden Sie den Film. </li></ol> 8. Post-Produktion Verarbeitung <ol><li> Klicken Sie auf &quot;Show Maximum Intensity Projection&quot; in der Werkzeugleiste, klicken Sie dann rechts auf das Bild und schaffen neues Dokument. Das Video ist jetzt in der bestmöglichen Qualität sichtbar. Gehen Sie auf Bilder, die nicht benötigt werden, zu löschen und stellen LUTs. Schließlich Speichern unter. Avi. Dieses Format wird gut für Windows handelt. Für Mac-Download-Software to konvertieren. mov oder. wmv. </li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+at+Birth+of+Cleft+Lip+With+or+Without+Cleft+Palate%3A+Data+From+the+International+Perinatal+Database+of+Typical+Oral+Clefts+%28IPDTOC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cleft+Palate+Craniofac.+J%22%5BJournal%5D)">Prevalence at Birth of Cleft Lip With or Without Cleft Palate: Data From the International Perinatal Database of Typical Oral Clefts (IPDTOC).</a> Cleft Palate Craniofac. J. 48 (1), 66-81 (2011).</li>
<li>Dixon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleft+lip+and+palate%3A+understanding+genetic+and+environmental+influences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (3), 167-178 (2011).</li>
<li>Mangold, E., Ludwig, K. U., Nothen, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakthroughs+in+the+genetics+of+orofacial+clefting%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Breakthroughs in the genetics of orofacial clefting.</a> Trends Mol. Med. 17 (12), 725-733 (2011).</li>
<li>Kimmel, C. B., Miller, C. T., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+and+morphogenesis+of+the+zebrafish+larval+head+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Specification and morphogenesis of the zebrafish larval head skeleton.</a> Dev. Biol. 233 (2), 239-257 (2001).</li>
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<li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1993).</li>
<li>Kawakami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish-secreted+matrix+protein+you%2Fscube2+is+implicated+in+long-range+regulation+of+hedgehog+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The zebrafish-secreted matrix protein you/scube2 is implicated in long-range regulation of hedgehog signaling.</a> Curr. Biol. 15 (5), 480-488 (2005).</li>
<li>Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+tracking+using+photoconvertible+proteins+during+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell tracking using photoconvertible proteins during zebrafish development.</a> J. Vis. Exp. (67), e4350(2012).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Hier wird ein neues Verfahren zur Darstellung von kraniofazialen Entwicklung im Zebrafischmodell dargestellt. Die sox10: kaede transgenen Zebrafischlinie wurde erfolgreich verwendet, um die Migrationsmuster der CNCC im Detail zu beschreiben ist als Modellorganismus 5 verwendet. Frühere Studien haben Brutto Sehenswürdigkeiten wie das Auge verwendet werden, um die Zielzellen und haben sich auf kaede mRNA Injektion, Photo Assays oder Käfig Fluorescein Dextran für Photo 10, 11, 1...

Gesichtsspalten stellen die häufigsten kraniofazialen Fehlbildungen, mit 1/700-1, 000 betroffenen Lieferungen ein. Störung der frühen embryonalen kraniofazialen Entwicklung kann zur Bildung von Lippen-Kiefer-Gaumen-(CL / P) führen. Während Ursachen für syndromale Spalt weitgehend gezeigt wurde, müssen die genetischen und epigenetischen Grundlagen der nicht-syndromale Formen der orofazialen Spaltbildung noch aufgedeckt 2-4 werden. Um die Ätiologie und Pathogenese dieser Fehlbildungen zu verstehen, ist es notwendig, die Entwicklung der kraniofazialen Strukturen auf zellulärer Basis aufzuklären. In allen Wirbeltierarten Schädel Neuralleistenzellen (CNCC) wandern aus dem dorsalen Neuralrohr, die Kiemenbögen, die zur Bildung von orofazialen Strukturen beitragen füllen. Störung der frühen embryonalen Neuralleiste Entwicklung ist auf die Bildung von Gesichtsschädelfehlbildungen einschließlich CL / P 5-7 führen. In Ad-dition, strukturelle Ähnlichkeiten zwischen Zebrafisch-und Säugetier kraniofazialen Entwicklung (CNCCs befinden sich in homologen Regionen) wird das Gen regulatorische Netzwerk hoch konserviert. Es wurde auch gezeigt, dass CNCCs entwickeln in der gleichen Weise zwischen amniote Arten und Zebrafisch 8, so dass das Zebrafisch eine leistungsfähige Organismus für das Studium der Entwicklungs-und genetischen Grundlagen von CL / P. Es hat viele Vorteile, wie geringe Größe, schnelle und Ex-utero embryonalen Entwicklung und hohe Zuchtraten. Darüber hinaus ist der Embryo optisch transparent, so dass es für die Beobachtung von komplexen Entwicklungsschritte unter dem Mikroskop 9. Es ist ein ideales Tiermodell für die Untersuchung von Migration und Differenzierung von Hirn Neuralleistenzellen. Kaede transgenen Modell 5: Aufbauend auf zuvor veröffentlichte Arbeit 8, 10, 11, die Migrationsmuster der CNCC wurde ausführlich über die sox10 beschrieben. Kaede ist ein Foto-Cabrio-Protein, das turns von grün auf rot nach Foto-Aktivierung und macht es möglich, CNCCs genau verfolgen. Während dieser Umwandlung das Peptidrückgrat gespalten, was darauf hindeutet, dass die Umwandlung ist stabil, was bedeutet, können die Zellen an ihren endgültigen Bestimmungsort 12 verfolgt werden. Transgene Linien mit kaede unter der Transkriptionskontrolle sox10 beschriftet zeigte, dass die amniote Gaumen und das Siebbein Platte des Zebrafisch sind homolog durch Fusion von bilateralen Kiefer Protuberanzen (MXP) mit der Prominenz frontonasalen (FNP) gebildet wird und dass das Y-förmige Naht ist analog Fusion zwischen Arten. Unter anderen Anwendungen, die sox10: kaede transgenen Zebrafisch-Modell wurde verwendet, um Videos von Zebrafisch-Embryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien zu erzeugen, um die Bildung von normalen und abnormalen kraniofazialen Strukturen zeigen. Photo bestimmter Gruppen von Zellen ist es möglich, ihre Entwicklung zu verfolgen. Mit dieser Methode ein Ansatz, um die Live-Darstellung der Entwicklung craniofac erstellenial Strukturen im Zebrafisch eingeführt wird, macht es einfach, dieses komplexe Entwicklungsprozess visuell demonstrieren. Kaede transgenen Zebrafisch als Beispiel: Dieses Protokoll wird auf die gemeinsame Nutzung der Erfahrungen der Erzeugung diese Videos mit der normalen Entwicklung des Siebbein Platte in Sox10 ab. Dieses Protokoll kann weiter zu machen Zeitraffer-Videos von jeder Struktur von Hirn Neuralleistenzellen in Zebrafisch-Regelung angewendet.

<table><tbody><tr><td>Sox10:kaede transgene Zebrafischlinie </td><td>MGH</td><td></td><td>Erhältlich über das Liao-Labor</td></tr><tr><td>Petrischalen 100x15 mm</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen 35 mmx10 mm</td><td>BD Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15517022</td><td></td></tr><tr><td>Lab Tek 2 Chamber SlideSystem </td><td>LabTek</td><td>154453</td><td></td></tr><tr><td>Microloaders 200/pk</td><td>Fisher</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R Si Confocal Ti Serie</td><td>Nikon</td><td>Nein Katalognummer</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements Software AR3.2 64-bit</td><td>Nikon</td><td>Nein Katalognummer</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisierung von craniofacial entwicklung in den sox10: kaede transgener zebrafische zeile mit zeitraffer-konfokale mikroskopie

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Wirbel palatogenesis ist ein hoch choreographierte und komplexen Entwicklungsprozess, der Migration von Schädel Neuralleiste (CNC)-Zellen, Konvergenz und Erweiterung des Gesichts Protuberanzen und Reifung des kraniofazialen Skeletts beinhaltet. Kaede transgenen Zebrafischlinie generiert wurde: Um den Beitrag der Schädel Neuralleiste auf bestimmte Regionen des Zebrafisches Gaumen sox10 studieren. Sox10-Linie bietet Beschränkung der kaede Reporterprotein zu der Neuralleiste, wodurch die Zellmarkierung eine genauere Verfahren als traditionelle Farbstoff oder Reporter-mRNA-Injektion. Kaede ist ein Foto-Cabrio-Protein, das von grün auf rot schaltet sich nach Foto-Aktivierung und macht es möglich, Zellen genau zu folgen. Die sox10: kaede transgene Linie wurde verwendet, um Abstammung Analyse durchführen, um CNC-Zellpopulationen, die Anlass zu Oberkiefer-Unterkiefer gegenüber Elementen und veranschaulichen Homologie von Gesichts Protuberanzen zu amniotes abzugrenzen. Dieses Protokoll beschreibt den Schritts, eine Live-Zeitraffer-Video eines sox10 generieren: kaede Zebrafischembryo. Entwicklung des Siebbein Platte wird als praktisches Beispiel dienen. Dieses Protokoll kann zur Erstellung einer Zeitraffer-Aufnahme eines konfokalen kaede oder ähnliche photoconvertible Reporterprotein in transgenen Zebrafisch angewendet werden. Weiterhin kann es verwendet werden, um nicht nur normal, sondern auch abnorme Entwicklung der kraniofazialen Strukturen in den Zebrafisch-Mutanten zu erfassen.

In der sox10: kaede transgene Linie, Zug-und Postmigrations CNCCs fluoreszierend grün markiert. Die CNCC Zellen mit grün fluoreszierenden kaede beschriftet rekapitulieren sox10 endogene mRNA-Expression 5. Unter anderen Anwendungen wurde dieses Tiermodell verwendet, um die Entwicklung von CNCC abhängig kraniofazialen Strukturen besser sichtbar zu machen. Normale Entwicklung der spezifischen Strukturen und auch pathologische Entwicklung der kraniofazialen Fehlbildungen, insbesondere...

Visualisierung von experimentellen Daten ist zu einem wichtigen Element in Präsentation der Ergebnisse für die wissenschaftliche Gemeinschaft. Generation von Live-Zeitraffer-Aufnahme von wachsenden Embryos trägt zu einer besseren Präsentation und Verständnis für komplexe Entwicklungsprozesse. Dieses Protokoll ist eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Zellmarkierung über der Photo kaede Protein im Zebrafisch.

Visualisierung von Craniofacial Entwicklung in den sox10: kaede transgener Zebrafische Zeile mit Zeitraffer-konfokale Mikroskopie

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine Live-Zeitrafferaufnahme der Migration neuraler Crest-Zellen anzufertigen, um die Bildung sich entwickelnder kraniofazialer Strukturen zu veranschaulichen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein anästhesierter transgener SOX10-KD-Zebrafisch in Agarose fixiert wird, um Bewegungen während des gesamten Experiments zu minimieren. Anschließend erfolgt unter einem konfokalen Mikroskop eine UV-Photoaktivierung, um das KD in den neuralen Crest-Zellen von grün auf rot umzuwandeln.Dann wird der Fokus auf die photoconvertierten Neuralleistenzellen gelegt. Ein Zack wird der sich entwickelnden Struktur erzeugt, bevor ein Zeitraffervideo aufgezeichnet wird. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen die Entwicklung kranialer Neuralleistenzellen zum primären Gaumen im Zebrafisch in einem transgenen SOX 10 KD-Zebrafischembryo.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der statischen Bildgebung, liegt darin, dass komplexe Entwicklungsprozesse wie die Zellmigration in Echtzeit visualisiert werden können. Dadurch werden die Ergebnisse für die wissenschaftliche Gemeinschaft besser zugänglich. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Entwicklungsbiologie zu beantworten, beispielsweise wie aus Neuralleistenzellen stammende Strukturen entstehen und wie PTO-Gene ihre Entwicklung beeinflussen.Um die Einbettung von Embryonen vorzubereiten, mischen Sie E3-Wasser mit niedrigschmelzendem Agarose im Mikrowellengerät in einem 125-Milliliter-Kolben, um die Lösung aufzulösen. Fügen Sie anschließend Tricain hinzu und stellen Sie den Kolben in ein Wasserbad mit 50 °C, um die Lösung warm zu halten. Verwenden Sie stark fluoreszierende transgene Soxine KD-Zebrafische-Embryonen 60 Stunden nach der Befruchtung. Überführen Sie diese dann einzeln mit Hilfe von Filterpapier in eine Kammerobjektträger.Entfernen Sie das überschüssige E3-Wasser und bedecken Sie dann das Embryo mit der Agarose-Lösung. Positionieren Sie das Embryo mit einer Mikrolader-Spitze exakt dorsal, wobei sichergestellt werden muss, dass die Embryonen vollständig in Agarose eingebettet sind. Nachdem die Agarose erstarrt ist, füllen Sie die Kammerobjektträger mit E3-0,015 % Trica, um die Photoumwandlung durchzuführen.Beginnen Sie mit einem 20x-Luft-Immersionobjektiv, um auf das Embryo zu fokussieren. Drücken Sie dann die Lichttaste L 100 am Mikroskop und wählen Sie die Kanäle in der Software aus. Öffnen Sie die Symbole.Erwerben Sie die Ansichtssteuerungen auf der einen Seite und klicken Sie auf die Schaltfläche „Konfokal-Einrichtung“. Klicken Sie anschließend auf „Automatisch“ und wählen Sie DPI 4 88 und 561,9 für die Kanäle 1, 2, 3 in dieser Reihenfolge aus, bevor Sie das Fenster erneut schließen. Schalten Sie danach die Kanäle eins und drei aus, klicken Sie auf die Schaltfläche zur Entfernung der Verriegelung und drücken Sie die Scan-Taste, wobei Sie mit einem Bild pro Sekunde und HV 200 beginnen.Blicken Sie auf die gewünschten Zellen. Erhöhen Sie nach und nach die Bilder pro Sekunde auf eins pro 32 und verringern Sie die Spannung je nach Hintergrundrauschen auf 100 bis 120. Sobald der Embryo scharf gestellt ist, greifen Sie mit der Maus den grünen Rand am rechten Bildschirmrand, ziehen Sie ihn zusammen, um den Bereich anzupassen, der vor dem Rechtsklick fotokonvertiert werden soll.Ändern Sie die Bilder pro Sekunde auf eins und die HV auf 200 und drücken Sie auf scannen. Ein vergrößertes Bild des Photo-Umwandlungsbereichs ist nun sichtbar. Nächstes Foto.Wandeln Sie die Zellen um, indem Sie Kanal eins für einen Zeitraum zwischen fünf und 60 Sekunden einschalten, bis das grüne KD-Signal nahezu verschwunden ist. Schalten Sie dann den dappy-Kanal aus. Schalten Sie die Kanäle zwei und drei ein, um zur ursprünglichen Zoomstufe zurückzukehren.Rechtsklicken Sie auf das Vergrößerungsfenster und wählen Sie „Zurück zur ursprünglichen Größe“, um zu überprüfen, ob die gewünschten Zellen ausreichend fotokonvertiert wurden. Legen Sie die Grenzen des Zack fest, indem Sie im Menü das Symbol „Z-Serie erfassen“ auswählen. Passen Sie die Nachschlagetabellen oder uts an, um eine Zeitrafferaufnahme einzurichten.Wählen Sie das A eine einfache GUI-Box und aktivieren Sie die folgenden Einstellungen. Einmal pro 32 Bilder pro Sekunde. Größe 1024 und Durchschnitt vier oder acht x, abhängig von der Anzahl der Z-Stapel, die in einer Schleife aufgenommen werden müssen.Als Nächstes wechseln Sie zur Ansicht „Aufnahme-Steuerung“ und richten Sie die ND-Sequenzaufnahme sowie den Zeitrahmen ein. Klicken Sie dann auf „kontinuierlich“ und anschließend auf „Zack“. Legen Sie die Grenzen wie zuvor gezeigt fest.Starten Sie den Film, geben Sie eine E3-Lösung mit 0,015 % Tricain in die Kammer, bewegen Sie die Probe während des Tages und füllen Sie die Kammer vollständig für die Übernacht-Bildgebung. Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, erstellen Sie ein hochwertiges Video aus der Bilddatei, indem Sie auf „Maximale Intensitätsprojektion anzeigen“ klicken. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf das Bild und erstellen Sie ein neues Dokument.Entfernen Sie unnötige Einzelbilder und passen Sie die LUTs an. In diesem Film zur Palatogenese beim Zebrafisch wird die SOX10-K-Transgenlinie verwendet, um die kranialen Neuralleistenzellen zu verfolgen, während sie sich zur primären Gaumenscheidewand entwickeln. Die vordersten Zellen des sich bildenden Gaumens werden 60 Stunden nach der Befruchtung durch Lichtumwandlung von grün auf rot umgeschaltet.Wenn sich die gepaarten Trabekeln vereinigt haben, um das primäre Gaumendach zu bilden, werden diese Zellen weiter verfolgt, bis sie ihr endgültiges Ziel erreichen. Dieser Film zeigt eine gestörte Gaumentwicklung, die zur Bildung einer orofazialen Spalte führt, vermittelt durch Knockdown von speck. Ein Beispiel ist das Gen lb A, das an der Entstehung einer schrägen Gesichtsspaltung beteiligt ist.Bei 60 HPF zeigt die einseitige photochemische Umwandlung der am weitesten anterior gelegenen Zellen der Ethmoidplatte eine fehlgeschlagene Verschmelzung zwischen den medianen und den lateralen Zellen der Ethmoidplatte. Dieser Defekt ähnelt der Pathogenese der Entwicklung eines schrägen Gesichtsspaltes beim Menschen, bei dem eine fehlgeschlagene Verschmelzung zwischen dem lateralen Nasenfortsatz und dem maxillären Fortsatz auftritt. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie den Weg, um die Entwicklung von Neuralleistzellen bei Zebrafischen zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie diese Methode verwenden können, um Ihren gewünschten Entwicklungsprozess aufzuzeichnen.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Analyse Craniofacial Morphogenese in Zebrafisch Mit 4D konfokale Mikroskopie

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Die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie ist ein hervorragendes Werkzeug für die Abbildung der Embryonalentwicklung. Es ermöglicht die Aufnahme von langen Zeitrafferfilmen von lebenden Embryonen unter nahezu physiologischen Bedingungen. Wir demonstrieren seine Anwendung für die Bildgebung der Entwicklung von Zebrafischaugen über weite räumliche und zeitliche Skalen und stellen eine Pipeline für die Fusion und Dekonvolution von Multiview-Datensätzen vor.

Mit Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie Bild Zebrabärbling Augenentwicklung

Hier präsentieren wir eine vielseitige Einbettungsmethode, die die Langzeit-Zeitraffer-Bildgebung der hinteren Körperentwicklung von lebenden Zebrafischembryonen ermöglicht, ohne die normale Entwicklung zu stören.

Eine vielseitige Montagemethode für Langzeit Imaging von Zebrabärblingentwicklung

Eine Kombination der erweiterten optischen Techniken der Laser-scanning-Mikroskopie mit langen Wellenlänge Multi-Photonen Fluoreszenzanregung wurde implementiert, um hochauflösende, dreidimensionale, Echtzeit-Bildgebung der Neuralleiste Migration mit Tg (Sox10:EGFP) und Tg (Foxd3:GFP) Zebrafish Embryos zu erfassen.

Multi-Photonen-Time Lapse Imaging Entwicklung in Echtzeit zu visualisieren: Visualisierung der Migration Neuralleisten-Zellen in den Zebrafish Embryos

Hier präsentieren wir eine standardisierte Reihe von Protokollen, die überlegene okuläre Sulcus zu beobachten eine kürzlich identifiziert, evolutionär konservierte Struktur in den Augen der Wirbeltiere. Verwendung von Zebrafischlarven zeigen wir Techniken notwendig, Faktoren zu identifizieren, die auf die Gründung und Schließung der überlegenen okuläre Sulcus beitragen.

Visualisierung von der okulären Sulcus Superior in der Embryogenese Danio rerio

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Montage zerbrechlicher Zebrafischembryonen für eine längere konfokale Zeitraffermikroskopie. Diese kostengünstige Methode ist einfach mit normalen Glasbodenmikroskopie-Geschirr für die Bildgebung auf jedem invertierten Mikroskop durchzuführen. Die Montage erfolgt in Agaroseschichten in unterschiedlichen Konzentrationen.

Eine geschichtete Montagemethode für die verlängerte Zeitraffer-Konfokalmikroskopie ganzer Zebrafisch-Embryonen

In vivo Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die zellulären Mechanismen zugrunde liegenden Entwicklung des Nervensystems zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine Technik zur Verwendung von Zeitraffer-Konfokalmikroskopie, um eine große Anzahl von mehrfarbigen Brainbow-markierten Zellen in Echtzeit innerhalb des sich entwickelnden Zebrafischnervensystems zu visualisieren.

Visualisierung des sich entwickelnden Gehirns bei lebenden Zebrafischen mit Brainbow und Zeitraffer-Konfokalbildnis

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur In-toto-Markierung und mehrdimensionalen Bildgebung der frühen Augenentwicklung von Zebrafischen. Wir beschreiben die Markierung, Einbettung und vierdimensionale (4D) Bildgebung mit hilfe der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie und Überlegungen zur Optimierung der Erfassung von Datensätzen zur Sezierung von Mechanismen der optischen Cup-Morphogenese.

4-dimensionale Bildgebung der Zebrafisch-Optikbecher-Morphogenese

Hier wird ein Protokoll für die Zeitrafferbildgebung der Augenmorphogenese mit einem handelsüblichen Lightsheet-Mikroskop und einer Bildverarbeitungs-Workstation zur Analyse der resultierenden Daten bereitgestellt. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren für die Anästhesie des Embryos, die Einbettung in Agarose mit niedriger Schmelztemperatur, die Suspension in der Bildgebungskammer, die Einrichtung der Bildgebungsparameter und schließlich die Analyse der Bilddaten mithilfe von...

Visualisierung der Augenmorphogenese mittels Lightsheet-Mikroskopie mittels rx3:GFP Transgener Zebrafische

Lernen Sie die Zeitraffer-Mikroskopie zur Visualisierung der Neuralleisten-Zellmigration in Danio rerio Embryonen. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Beobachtung kraniofazialer Entwicklungsprozesse.

Visualisierung von Craniofacial Entwicklung in den sox10: kaede transgener Zebrafische Zeile mit Zeitraffer-konfokale Mikroskopie (Video) | JoVE Journal

Visualisierung von Craniofacial Entwicklung in den sox10: kaede transgener Zebrafische Zeile mit Zeitraffer-konfokale Mikroskopie

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