Phasenkontrast und Differential Interferenz Kontrast (DIC) Mikroskopie
August 6th, 2008
Dieses Protokoll zeigt die Grundlagen und praktische Anwendungen der Phase und Differential Interferenz Kontrast (DIC) Mikroskopie
Die Lichtmikroskopie ist eines der, wenn nicht sogar das leistungsfähigste Werkzeug auf dem Gebiet der biomedizinischen Forschung. Abhängig von Ihrer Anwendung sind unterschiedliche Beleuchtungsarten für die Probenbetrachtung wünschenswert. In diesem Video werden zwei optische Modi der Durchlichtbeleuchtung demonstriert: Phasenkontrast und DIC oder differentielle Interferenzkontrastmikroskopie.
Hallo, ich bin Victoria San Frolic von der Kerneinrichtung für optische Bildgebung am Health Science Center der University of Texas in San Antonio. Heute zeige ich Ihnen, wie Sie Proben mit Hilfe des Phasenkontrasts und der differentiellen Interferenzkontrastmikroskopie richtig betrachten. Also lasst uns loslegen.
Die Standard-Hellfeldmikroskopie ist nicht geeignet, um transparente und farblose Proben zu betrachten. Die Phasenkontrastmikroskopie wird häufig verwendet, um Kontrastmittel für transparente, nicht lichtabsorbierende biologische Proben zu erzeugen. Die Technik wurde 1942 von Zürich entdeckt, der für seine Leistung den Nobelpreis erhielt.
Das Phasenkontrastmikroskop ist ein Hellfeld-Lichtmikroskop mit speziellen Phasenkontrastobjektiven, die eine Phasenplatte oder einen Phasenring und einen Kondensorring anstelle einer Membran enthalten. Der Ringraum befindet sich in der Regel im Kondensatorrevolver, und die Größe des Ringraums muss für verschiedene Ziele gewählt werden. Wählen Sie nach dem Einrichten der Kohler-Beleuchtung das richtige Phasenobjektiv aus und drehen Sie dann den entsprechenden Phasenring in Position im Kondensor.
Sobald der Phasenring und der Kondensatorring richtig ausgerichtet sind, so dass sie konzentrisch und überlappend sind, können wir die Probe betrachten und den Fokus richtig einstellen. Lassen Sie uns also zeigen, wie der Phasenkontrast durch das Mikroskop aussieht. Hier ist ein Blick auf eine Scheibe Rattenleber.
Unter Phasenkontrast. Diese Methode verbessert das Erscheinungsbild von biologischem Material, indem der Kontrast von verschiedenen Grautönen zu Schwarz- und Weißtönen verändert wird. Sie werden jedoch feststellen, dass die Exemplare von einem Halo umgeben sind, der die feine Struktur verdeckt.
Dieser Halo ist ein Artefakt der Beleuchtung durch den Phasenring. Wenn wir auf Hellfeld umschalten, werden Sie feststellen, dass dieses Exemplar sehr schwer zu betrachten ist. Wenn wir zurück zum Phasenkontrast wechseln, können wir deutlich die Struktur und Form der Zellen in der Rattenleber erkennen Gewebe Seit seiner Einführung in den späten 1960er Jahren.
Die differentielle Interferenzkontrast- oder DIC-Mikroskopie ist in der biomedizinischen Forschung beliebt, da sie hochauflösende Bilder von feinen Strukturen erzeugt, indem sie die kontrastierenden Grenzflächen verstärkt, das erzeugte Bild ist von einem sehr dünnen optischen Abschnitt. Die Fähigkeit des DIC, optische Schnitte zu erzeugen, hat es zu einem nützlichen Modus der Durchlichtbeleuchtung für die konfokale Mikroskopie eines Unternehmens gemacht. Das DIC-Mikroskop ist ein Hellfeld-Lichtmikroskop mit den folgenden Elementen, einem Polarisator zwischen der Lichtquelle und dem Kondensor.
Ein DIC-Strahlteilerprisma in der Kondensatortorte, ein DIC-Strahlkombinationsprisma direkt hinter dem Objektiv und ein Analysator im Unendlichkeitsraum vor den beiden Mischungen. Um die beste Leistung der DIC-Optik zu erzielen, ist es wichtig, das Lichtmikroskop zuerst auf die Kohler-Beleuchtung auszurichten und dann die DIC-Elemente im Strahlengang zu platzieren. Das Licht von der Quelle durchläuft einen Polarisator und wird dann durch das erste Prisma gespalten.
Diese gepaarten Balken bewegen sich nahe beieinander. Wenn beide Paare in der Probe durch das gleiche Material gegangen sind, dann kollidieren sie nicht miteinander, wenn sie durch das zweite Prisma rekombiniert werden, und erscheinen daher grau. An einer Kante einer Struktur verläuft jedoch ein Balken der Birne durch ein anderes Material als sein Partner und wird verändert.
Wenn diese Strahlen durch das zweite Prisma rekombiniert werden, interferieren sie entweder konstruktiv und erzeugen einen hellen Fleck oder destruktiv einen dunklen Fleck. Hier ist ein Blick auf Kieselalgen unter DIC-Kontrast. Sie werden feststellen, dass feine Details der Kieselalgenstruktur gut sichtbar sind.
Wird jedoch die DIC-Optik entfernt, verschwinden diese Details. Der Kontrast über das Exemplar ist auf der einen Seite hell und auf der anderen dunkler. Das erweckt den Eindruck von Topographie, ist aber in Wirklichkeit eine Illusion.
Die Richtung des Schattenwurfeffekts kann umgekehrt werden, indem der Polarisator um einen Kreuzungspunkt auf den entgegengesetzten Kontrast gedreht wird. Wir haben gerade die optischen Modi Phasenkontrast und DIC besprochen. Zur Erinnerung: Die Eliminierung des Phasenkontrasts verbessert die kontrastierenden Proben von Schwarz zu Weiß und ist nützlich für die Betrachtung von Exemplaren, die sowohl farblos als auch transparent sind.
DIC erzeugt auch Kontrast in der Probe. Dies geschieht durch die Erstellung eines hochauflösenden Bildes eines dünnen optischen Schnitts. Das war's also.
Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrer Mikroskopie.
Übersicht
Dieses Protokoll hebt die Prinzipien und praktischen Anwendungen der Phasen- und Differentialinterferenzkontrastmikroskopie (DIC) hervor. Diese Techniken verbessern die Visualisierung transparenter und farbloser biologischer Proben und machen sie zu wesentlichen Werkzeugen in der biomedizinischen Forschung.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Biomedizinische Forschung
- Mikroskopietechniken
- Optische Bildgebung
Hintergrund
- Lichtmikroskopie ist entscheidend für die Betrachtung biologischer Proben.
- Phasenkontrastmikroskopie verbessert den Kontrast für transparente Proben.
- DIC-Mikroskopie liefert hochauflösende Bilder feiner Strukturen.
- Beide Techniken sind für eine effektive Probenanalyse unerlässlich.
Zweck der Studie
- Demonstration der Verwendung von Phasenkontrast- und DIC-Mikroskopie.
- Erklärung der Einrichtung und Ausrichtung von Mikroskopietechniken.
- Hervorhebung der Vorteile dieser Methoden bei der Beobachtung biologischer Materialien.
Verwendete Methoden
- Einrichtung der Kohler-Beleuchtung für optimale Lichtverteilung.
- Verwendung von Phasenkontrastobjektiven und Annuli.
- Implementierung von DIC-Optiken einschließlich Polarisatoren und Strahlteilerprismen.
- Vergleich der Probensichtbarkeit unter verschiedenen Mikroskopietechniken.
Hauptergebnisse
- Phasenkontrastmikroskopie zeigt zelluläre Strukturen in transparenten Proben.
- DIC-Mikroskopie verbessert feine Details und bietet einen topographischen Effekt.
- Beide Techniken verbessern die Klarheit biologischer Proben erheblich.
- Artefakte wie Halos im Phasenkontrast werden notiert und erklärt.
Schlussfolgerungen
- Phasenkontrast ist effektiv für die Betrachtung farbloser und transparenter Proben.
- DIC-Mikroskopie bietet hochauflösende Bildgebung feiner Strukturen.
- Beide Methoden sind wertvoll für die Weiterentwicklung der Forschung in den Biowissenschaften.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Phase contrast and DIC microscopy enable visualization of transparent, non-light-absorbing biological specimens, supporting early discovery workflows where label-free imaging is required. These techniques provide mechanistic de-risking by revealing structural details and functional morphology in live cells and tissues without fixation or staining. Their integration into discovery pipelines improves target validation confidence by allowing direct observation of phenotypic responses and cellular architecture under near-physiological conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables label-free observation of transparent specimens such as live cells and tissue sections to assess morphological changes linked to target modulation.
- Operational Value: Supports rapid screening of cellular phenotypes without the need for fluorescent tags or chemical fixation, reducing assay preparation time.
- Predictive Value: Enhances confidence in target hypotheses by allowing direct visualization of structural and functional phenotypes in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides high-contrast, label-free imaging suitable for developing phenotypic assays where transparency obscures detail in brightfield.
- Operational Value: Enables standardization of imaging conditions through Koehler illumination and precise alignment of phase plates or DIC prisms, improving reproducibility across runs.
- Scalability: Compatible with multi-well plate formats when integrated into automated microscopy systems, supporting medium-throughput screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical stages by enabling consistent imaging of primary cells, explants, and embryo models across workflows.
- Mechanistic De-risking: Reveals fine structural details at tissue interfaces, helping clarify mechanisms of action in complex biological systems.
- Disease-Relevant Systems: Applicable to thick specimens including tissue sections, eggs, and embryos, supporting evaluation in physiologically complex models.
Pipeline & Workflow Integration
Phase contrast and DIC microscopy function as enabling technologies in the discovery continuum, supporting hypothesis testing in early biology, assay readiness in screening, and morphological analysis in translational research.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by allowing direct observation of cellular responses to perturbations in transparent, unstained specimens.
- Screening: Supports assay development through reproducible, high-contrast imaging of label-free specimens, reducing variability in phenotypic readouts.
- Analytics: Generates quantitative intensity and contrast measurements at structural interfaces, enabling objective comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Ensures continuity by providing consistent visualization of primary tissues and explants from discovery through preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable imaging capability across departments, reducing redundancy in microscopy resource allocation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by revealing fine structural details and topological features in live, unstained specimens.
- Operational Value: Promotes standardization through defined alignment procedures for phase annuli and DIC optics, enhancing day-to-day reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by increasing confidence in phenotypic observations, thereby reducing late-stage attrition due to unexpected biological complexity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on direct, label-free phenotypic evidence from disease-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, including Koehler illumination and precise centering of phase plates or DIC prisms.
- Dependent on specialized hardware: phase contrast objectives with phase rings, condenser annuli, polarizers, beam-splitting and beam-combining prisms, and analyzers.
- Necessitates cross-team standardization of illumination and alignment protocols to ensure consistent results across users and sites.
- Adaptation considerations include refractive index matching and specimen thickness, which affect DIC sectioning quality and phase contrast halo artifacts.
- Practical limitations include halo artifacts in phase contrast that may obscure fine structure, and the directional shadow effect in DIC, which is an optical illusion not representing true topography.
