Name: Simultane Multicolor-Imaging biologischer Strukturen mit Fluoreszenzphotoaktivierung Lokalisationsmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-09T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 51 s
Description: Erfahren Sie die Fluoreszenzphotoaktivierungs-Lokalisationsmikroskopie (FPALM) zur hochaufgelösten Bildgebung mehrerer Proteinspezies in Zellen. Diese Methode ermöglicht Nanometer-präzise Lokalisation in fixierten und lebenden Zellen.

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Die Autoren danken Philip Andresen, Matthew Parent und Sean Carter für die Computerprogrammierung, technische Unterstützung und nützliche Gespräche sowie Pat Byard für die administrative Unterstützung. Diese Arbeit wurde finanziert durch den NIH Career Award K25-AI65459, NIH R15 GM094713, NSF MRI CHE-0722759, das Maine Technology Institute MTAF 1106 und 2061 und den Maine Economic Improvement Fund.

<ol><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+Opt.+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic Opt. reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Sci. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biological+structures+with+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Nat. Protoc. 4, 291-308 (2009).</li>
<li>Gould, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+molecular+positions+and+anisotropies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of molecular positions and anisotropies.</a> Nat. Methods. 5, 1027-1030 (2008).</li>
<li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat Meth. 5, 527-529 (2008).</li>
<li>Kanchanawong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+architecture+of+integrin-based+cell+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat%22%5BJournal%5D)">Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions.</a> Nat. 468, 580-584 (2010).</li>
<li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3125-3130 (2009).</li>
<li>Huang, B., Wang, W. Q., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+Opt.+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic Opt. reconstruction microscopy.</a> Sci. 319, 810-813 (2008).</li>
<li>Hess, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clustered+distribution+of+hemagglutinin+resolved+at+40+nm+in+living+cell+membranes+discriminates+between+raft+theories%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamic clustered distribution of hemagglutinin resolved at 40 nm in living cell membranes discriminates between raft theories.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17370-17375 (2007).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nat. Methods. 5, 417-423 (2008).</li>
<li>Sengupta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+protein+heterogeneity+in+the+plasma+membrane+using+PALM+and+pair+correlation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis.</a> Nat. Methods. 8, 969-975 (2011).</li>
<li>Shroff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+superresolution+imaging+of+genetically+expressed+probes+within+individual+adhesion+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dual-color superresolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20308-20313 (2007).</li>
<li>Bock, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+far-field+fluorescence+nanoscopy+based+on+photoswitchable+emitters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+B%22%5BJournal%5D)">Two-color far-field fluorescence nanoscopy based on photoswitchable emitters.</a> Appl. Phys. B. 88, 161-165 (2007).</li>
<li>Bossi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+far-field+fluorescence+nanoscopy+through+isolated+detection+of+distinct+molecular+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Multicolor far-field fluorescence nanoscopy through isolated detection of distinct molecular species.</a> Nano Lett. 8, 2463-2468 (2008).</li>
<li>Gunewardene, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+Imaging+of+Multiple+Fluorescent+Proteins+with+Highly+Overlapping+Emission+Spectra+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Superresolution Imaging of Multiple Fluorescent Proteins with Highly Overlapping Emission Spectra in Living Cells.</a> Biophys. J. 101, 1522-1528 (2011).</li>
<li>Wilmes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple-Color+Super-Resolution+Imaging+of+Live+Cells%3A+Resolving+Submicroscopic+Receptor+Organization+in+the+Plasma+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Triple-Color Super-Resolution Imaging of Live Cells: Resolving Submicroscopic Receptor Organization in the Plasma Membrane.</a> Angewandte Chemie Int. Ed. 51, 4868-4871 (2012).</li>
<li>Gudheti, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+mediates+the+nanoscale+membrane+organization+of+the+clustered+membrane+protein+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Actin mediates the nanoscale membrane organization of the clustered membrane protein influenza hemagglutinin.</a> Biophys. J. , (2013).</li>
<li>Tanaka, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+molecules+mobile+even+after+chemical+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Membrane molecules mobile even after chemical fixation.</a> Nat. Methods. 7, 865-866 (2010).</li>
<li>Beisker, W., Dolbeare, F., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+immunocytochemical+procedure+for+high-sensitivity+detection+of+incorporated+bromodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">An improved immunocytochemical procedure for high-sensitivity detection of incorporated bromodeoxyuridine.</a> Cytometry. 8, 235-239 (1987).</li>
<li>Koehler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Method+of+Illumination+for+Photomicrographical+Purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">New Method of Illumination for Photomicrographical Purposes.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 Forthcoming.</li>
<li>Self, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+of+Spherical+Gaussian+Beams%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Focusing of Spherical Gaussian Beams.</a> Appl. Opt. 22, 658-661 (1983).</li>
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<li>Kim, D., Curthoys, N. M., Parent, M., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleed-through+correction+for+rendering+and+correlation+analysis+in+multi-colour+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt%22%5BJournal%5D)">Bleed-through correction for rendering and correlation analysis in multi-colour localization microscopy.</a> J. Opt. , (2013).</li>
</ol>

S.T.H. und M.J.M. halten Patente in der hochauflösenden Mikroskopie. S.T.H. ist Mitglied des wissenschaftlichen Beirats von Vutara, Inc.

Die lokalisierungsbasierte hochauflösende Bildgebung bietet viele leistungsstarke Funktionen für die biologische Bildgebung. Der Weg von einzelnen optischen Komponenten, die auf dem Tisch platziert werden, zu einem funktionsfähigen Superauflösungsmikroskop, das in der Lage ist, mehrere fluoreszierende Spezies in einer biologischen Probe gleichzeitig abzubilden, stellt eine Reihe von Herausforderungen dar. Einige Aspekte der Ausrichtung sind kritischer als andere; Im Folgenden bemühen wir uns, potenziellen Benutzern, die ...

Während zelluläre Strukturen auf einer Vielzahl von räumlichen Skalen existieren, ist die Fluoreszenzbildgebung der zellulären Organisation auf Längenskalen kleiner als ~250 nm in der konventionellen Mikroskopie aufgrund der physikalischen Einschränkung der Beugungsgrenze eingeschränkt. Diese Grenze wurde mit dem Aufkommen der Fluoreszenz-Photoaktivierungslokalisierungsmikroskopie (FPALM1) und ähnlicher Technikenüberwunden 2,3, die eine große Anzahl einzelner Moleküle mit einer Genauigkeit von ~10 nm lokalisieren können, um Bilder mit einer Auflösung von einigen Dutzend Nanometern zu erzeugen. FPALM basiert auf der Verwendung optischer Kontrolle, um Untergruppen von Molekülen zu aktivieren und zu inaktivieren (für eine vollständige Beschreibung von FPALM und Anweisungen zur Implementierung dieses Bildgebungssystems siehe Gould et al.4). Diese Technik ermöglicht es, die räumlichen Verteilungen ganzer Populationen einzelner Moleküle zu kartieren und so biologische Strukturen über Längenskalen von mehreren zehn Nanometern bis zu mehreren zehn Mikrometern aufzuklären. Die lokalisationsbasierte Superauflösungsmikroskopie (im Folgenden als Lokalisationsmikroskopie bezeichnet) wurde inzwischen an eine Reihe biologischer Fragestellungen angepasst, wobei technologische Entwicklungen beispielsweise die Abbildung einzelner molekularer Orientierungen mit Polarisations-FPALM oder P-FPALM5, die Fluoreszenzbildgebung einzelner Moleküle in drei Dimensionen mit Biplane FPALM6 oder anderen Techniken ermöglichen7-9und die hochauflösende Fluoreszenzbildgebung einzelner Moleküle in lebenden Zellen10-12. Die Lokalisationsmikroskopie wurde auch auf die Bildgebung mehrerer Spezies in fixierten Zellen angewendet13-16. Kürzlich wurden drei Proteinspezies gleichzeitig mit FPALM sowohl in fixierten als auch in lebenden Zellen abgebildet17. Die Lokalisationsmikroskopie kann Proben abbilden, die auf verschiedene Weise markiert wurden: Beispiele hierfür sind Proteine, die mit PAFP- oder PSFP-Fusionsmarkierungen exprimiert werden, Antikörper oder Moleküle, die mit eingeschlossenen organischen Farbstoffen markiert sind, oder herkömmliche organische Farbstoffe. Während die Verwendung herkömmlicher Fluoreszenzfarbstoffe die Markierung von Proteinen in Abwesenheit eines Fusionsprotein-Tags ermöglicht, erfordern die Bedingungen, die im Allgemeinen für die Verwendung von nicht käfiggebundenen organischen Farbstoffen in der hochauflösenden Bildgebung erforderlich sind, dass Proben in Reduktionspuffer getaucht werden.2. Darüber hinaus erfordert die intrazelluläre Verabreichung von Antikörper-Farbstoff-Konjugaten in der Regel, dass Zellen fixiert und ihre Membranen permeabilisiert werden. oder erfordert, dass lebende Zellen durch Elektroporation oder auf andere Weise durchlässig gemacht werden. Die Anforderungen an die Reduzierung der Pufferbedingungen und der Membranpermeabilisierung schränken die Eignung organischer Farbstoffe für die Bildgebung lebender Zellen ein, obwohl die jüngsten Entwicklungen einen effektiven Einsatz von HaloTags und FPALM zur Abbildung von Membranstrukturen ermöglicht haben18.
FPALM war die erste Lokalisationsmikroskopietechnik, die auf lebende Zellen angewendet wurde10. In lebenden Zellen kann FPALM nicht nur eine zeitabhängige räumliche Karte der Positionen markierter Moleküle liefern, sondern auch einzelne Moleküle über mehrere Frames verfolgen und molekulare Trajektorien über Zeitskalen von Millisekundenbestimmen 19. Somit bietet FPALM Zugang zu relativ kurzen Zeitskalen und nanoskaliger Auflösung.
Multicolor FPALM kann für eine Vielzahl verschiedener Sonden verwendet werden, einschließlich photoaktivierbarer Proteine und organischer oder nicht käfigartiger Farbstoffe. Im Folgenden stellen wir Ihnen das Protokoll und den Aufbau für die gleichzeitige Bildgebung von zwei fluoreszierenden Proteinspezies, Dendra2 und PAmCherry, vor. Wir berichten über die Ergebnisse der Bildgebung von PAmCherry, konjugiert mit Beta-Aktin (PAmCherry-Aktin) und Dendra2, konjugiert mit Influenza-Hämagglutinin (Dendra2-HA) in NIH-3T3-Fibroblasten. Die in der Einrichtung beschriebenen Komponenten können gegen andere Hardware ausgetauscht werden, die für die Abbildung anderer Sonden besser geeignet ist. Wo dies der Fall ist, haben wir versucht, im Text explizit zu sein.
Multicolor FPALM ist ideal für die Darstellung der räumlichen Verteilungen mehrerer Proteinspezies in lebenden oder fixierten Zellen. Diese Technik eignet sich besonders für die Untersuchung räumlicher und/oder dynamischer Beziehungen auf räumlichen Längenskalen von Nanometern, obwohl Bilder die Lokalisierung auf einer Reihe von Längenskalen von Dutzenden von Nanometern bis zu Dutzenden von Mikrometern berichten. Ein großer Vorteil von multicolor FPALM ist, dass der Aufbau relativ kostengünstig zu konstruieren und sehr flexibel für den Einsatz mit verschiedenen Sondenkombinationen ist. Der Prozess der Konstruktion und Kalibrierung des Systems aus Komponenten bietet auch ein beträchtliches Verständnis von Faktoren, die die Qualität und Interpretierbarkeit der Daten und damit das Forschungsergebnis beeinträchtigen können. Im Folgenden werden die Methoden für den optischen Aufbau, die Probenvorbereitung und die Datenerfassung mehrerer Proteinspezies mit PSFP- und PAFP-Fusionskonstrukten unter Verwendung von FPALM detailliert beschrieben. Während dieses Protokoll die Analyse fixierter Zellen beschreibt, sind diese Verfahren ohne weiteres auf die Bildgebung lebender Zellen anwendbar.
Der hier beschriebene optische Aufbau ist ideal für die gleichzeitige Abbildung des PSFP Dendra2 und des PAFP PAmCherry. Viele andere Sonden können für die mehrfarbige Bildgebung verwendet werden; Die genauen benötigten Komponenten können jedoch variieren, abhängig von den Anregungs- und Emissionsspektren der gewählten Sonden. Die Auswahl der dichroitischen Spiegel, Filter und Laserwellenlängen sollte auf der Grundlage dieser Überlegungen getroffen werden.

<table><tbody><tr><td>LabTek II Kammern</td><td>Nunc</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Fluoreszierende Kügelchen</td><td>Invitrogen</td><td>F-8801</td><td>Kügelchen zur Kalibrierung</td></tr><tr><td>Tetraspeck Kügelchen</td><td>Invitrogen</td><td>T-7279</td><td>Vierfarbige Kügelchen zur</td></tr><tr><td>Kalibrierung Objektiv-Immersionsöl</td><td>Zeiss</td><td>518F</td><td>Immersionsöl für Objektive mit hohem NA-Gehalt (abhängig von der Wahl des Objektivs)</td></tr><tr><td>HPLC-Wasser</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td> </td></tr><tr><td>Media</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>Or Cellgro 10-090</td></tr><tr><td>Antibiotika</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td> </td></tr><tr><td>Serum</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30087.03</td><td> </td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td>52887</td><td> </td></tr><tr><td>Optimem I</td><td>GIBCO</td><td>11058-021</td><td> </td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>MPBiomedicals</td><td></td><td> </td>1689149</tr> <tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA433689M</td><td>VORSICHT: Giftig</td></tr></tbody></table>

simultane multicolor-imaging biologischer strukturen mit fluoreszenzphotoaktivierung lokalisationsmikroskopie

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Lokalisierungsbasierte Superauflösungsmikroskopie kann angewendet werden, um eine räumliche Karte (Bild) der Verteilung einzelner fluoreszenzmarkierter einzelner Moleküle innerhalb einer Probe mit einer räumlichen Auflösung von Dutzenden von Nanometern zu erhalten. Unter Verwendung von photoaktivierbaren (PAFP) oder photoschaltbaren (PSFP) fluoreszierenden Proteinen, die mit Proteinen von Interesse fusioniert sind, oder organischen Farbstoffen, die an Antikörper oder andere Moleküle von Interesse konjugiert sind, kann die Fluoreszenz-Photoaktivierungslokalisierungsmikroskopie (FPALM) gleichzeitig mehrere Arten von Molekülen innerhalb einzelner Zellen abbilden. Mit dem folgenden Ansatz werden Populationen einer großen Anzahl (Tausende bis Hunderttausende) einzelner Moleküle in einzelnen Zellen abgebildet und mit einer Genauigkeit von ~10-30 nm lokalisiert. Die gewonnenen Daten können verwendet werden, um die räumliche Verteilung mehrerer Proteintypen auf der Nanoskala innerhalb einer Zelle zu verstehen. Ein Hauptvorteil dieser Technik ist die drastische Erhöhung der räumlichen Auflösung: Während die Beugung die Auflösung bei der herkömmlichen Lichtmikroskopie auf ~200-250 nm begrenzt, kann FPALM Längenskalen abbilden, die mehr als eine Größenordnung kleiner sind. Da viele biologische Hypothesen die räumlichen Beziehungen zwischen verschiedenen Biomolekülen betreffen, kann die verbesserte Auflösung von FPALM Einblicke in Fragen der zellulären Organisation geben, die der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie bisher nicht zugänglich waren. Neben der Beschreibung der Methoden zur Probenvorbereitung und Datenerfassung beschreiben wir hier den optischen Aufbau für FPALM. Ein weiterer Aspekt für Forscher, die hochauflösende Mikroskopie betreiben möchten, sind die Kosten: Eigeninstallationen sind deutlich billiger als die meisten kommerziell erhältlichen Bildgebungsgeräte. Zu den Einschränkungen dieser Technik gehören die Notwendigkeit, die Markierung von Molekülen von Interesse in Zellproben zu optimieren, und die Notwendigkeit einer Nachbearbeitungssoftware zur Visualisierung der Ergebnisse. Wir beschreiben hier die Verwendung der PAFP- und PSFP-Expression, um zwei Proteinspezies in fixierten Zellen abzubilden. Die Ausweitung der Technik auf lebende Zellen wird ebenfalls beschrieben.

Influenza-Hämagglutinin (HA) bildet Cluster in der Größenordnung von zehn Nanometern bis Mikrometern, und diese Cluster kolokalisieren variabel mit Aktin (Abbildung 5). Diese räumlichen Verteilungen bestätigen grobkörnige Aufnahmen dieser beiden Proteine28 sowie die Abhängigkeit der räumlichen Verteilung von HA von Aktin19. Multifarbige FPALM-Aufnahmen können weiterhin verwendet werden, um Dichte, Fläche und Umfang dieser Cluster sowie das Ausmaß der Kolokalisation zwischen den beid...

Wir demonstrieren die Verwendung von Fluoreszenz-Photoaktivierungs-Lokalisierungsmikroskopie (FPALM), um gleichzeitig mehrere Arten von fluoreszenzmarkierten Molekülen in Zellen abzubilden. Die beschriebenen Techniken ermöglichen die Lokalisierung von Tausenden bis Hunderttausenden einzelner fluoreszierend markierter Proteine mit einer Genauigkeit von Dutzenden von Nanometern innerhalb einzelner Zellen.

Simultane Multicolor-Imaging biologischer Strukturen mit Fluoreszenzphotoaktivierung Lokalisationsmikroskopie

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mehrere Proteinspezies gleichzeitig mit Nanometerpräzision in fixierten oder lebenden Zellen abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst die Position einer Kamera und der Optik angepasst wird, bis ein scharfes Bild vom Mikroskop auf den Kamerachip projiziert wird. Der zweite Schritt besteht darin, Laserstrahlen so anzuordnen, dass sie direkt auf eine Probe auf dem Mikroskoptisch ausgerichtet sind. Anschließend wird die vorbereitete Zellprobe beleuchtet und eine Zelle ausgewählt, die die gewünschten Proteine exprimiert. Der letzte Schritt besteht darin, die Zelle mittels Fluoreszenz-Photoaktivierungs-Lokalisierungsmikroskopie abzubilden, indem die Probe mit Lasern beleuchtet und die Zellfluoreszenz anschließend auf den Kamerachip gelenkt wird, um einen Datensatz zu erfassen. Letztlich kommt die Fluoreszenz-Photoaktivierungs-Lokalisierungsmikroskopie zum Einsatz, um die Lokalisation mehrerer Proteinspezies auf nanometrischer räumlicher Skala in fixierten oder lebenden Zellen darzustellen, und zwar entweder im Weitfeld oder unter Verwendung der Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie, um einen dünnen Bereich der Probe zu isolieren.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der konfokalen oder Elektronenmikroskopie besteht darin, dass mehrere Proteine gleichzeitig mit nanometrischer Auflösung in fixierten oder lebenden Zellen abgebildet werden können. Die folgenden Schritte beziehen sich auf ein Nummerierungssystem, das hier dargestellt ist und ein Schema für die multicolor F Om-Aufbauten darstellt, das als Abbildung eins im beigefügten textbasierten Protokoll zur Ausrichtung des Mikroskops bereitgestellt wird. Beginnen Sie damit, eine Kalibrierskala oder ein Radikal auf den Mikroskoptisch zu platzieren, wobei ein 10×-Objektiv eingesetzt ist und die Lampe auf Durchlicht eingestellt ist. Zentrieren Sie die vertikale Linie in der Mitte des Sichtfeldes. Als Nächstes stellen Sie das Mikroskop für die Durchlichtbeleuchtung ein, indem Sie die Feldblende schließen und durch die Okulare auf die vertikale Ebene blicken. Wenn die Ränder der Feldblende unscharf sind, stellen Sie die Höhe des Kondensors so ein, bis sowohl die Feldblende als auch das Fadenkreuz scharf sind. Danach justieren Sie die laterale Position der Feldblende, bis diese bezüglich des Sichtfeldes zentriert ist, und schließen die Feldblende so weit, bis nur noch das mittlere Gitter im Fadenkreuz beleuchtet ist.Wenn diese Komponenten zum ersten Mal zusammengestellt werden, müssen die Pfadlängen jedes Kanals angeglichen werden. Um dieses Projekt durchzuführen, leiten Sie das rote Licht auf den Kamerachip, indem Sie die Spiegel sieben und neun justieren, und schließen Sie die Detektionsblende, um räumliche Überlappung zwischen den beiden Kanälen zu vermeiden. Fokussieren Sie dann das Bild des Radikals im reflektierten Lichtkanal und prüfen Sie, ob es auch im durchgehenden Lichtkanal scharfgestellt ist.Wenn das Bild im durchgehenden Lichtkanal nicht scharf ist, verschieben Sie Spiegel neun, bis das radikale Bild gleichzeitig in beiden Kanälen scharf ist. Beginnen Sie mit der Justage der Laser, indem Sie Linse eins aus dem Laserstrahlweg entfernen und die Aktivierungs- und Auslesestrahlen blockieren. Bringen Sie dann eine weiße Karte bündig vor Spiegel vier an, öffnen Sie den Mikroskop-Verschluss und fokussieren Sie, bis das radikale Bild auf die Karte vor Spiegel vier projiziert wird.Als Nächstes entsperren Sie den Abtaststrahl und justieren Sie Spiegel eins, um den Abtastlaser in der Mitte auf die Fadenkreuzmarkierung des Radikalbilds auf Spiegel vier auszurichten. Sobald er zentriert ist, projizieren Sie das Radikalbild auf Spiegel fünf und justieren Sie Spiegel vier, bis der Strahl auf den Fadenkreuzmarkierungen des Radikalbilds von Spiegel fünf zentriert ist. Der Abtaststrahl sollte nun sowohl auf Spiegel vier als auch auf Spiegel fünf zentriert sein.Blockieren Sie dann den Abtaststrahl, indem Sie den Verschluss eins schließen. Projizieren Sie anschließend das Radikalbild auf Spiegel drei. Entfernen Sie den Strahlaufweiter aus dem Laserstrahlengang und freigeben Sie den Aktivierungslaser.Justieren Sie nun Spiegel zwei so, dass der Aktivierungsstrahl auf dem Fadenkreuz des Radikalbildes auf Spiegel drei zentriert ist. Sobald dies erreicht ist, setzen Sie den Strahlexpander zwischen Spiegel zwei und Spiegel drei wieder ein und justieren Sie die Position des Strahlexpanders, bis der Strahl auf dem Fadenkreuz des Radikalbildes zentriert ist. Projizieren Sie auf Spiegel drei das Radikalbild auf Spiegel fünf und fokussieren Sie es.Stellen Sie mithilfe des Fokusknopfs des Mikroskops den Winkel des dichroitischen Spiegels Nummer eins so ein, dass der Aktivierungsstrahl in der Mitte des Redle-Bildes liegt. Blockieren Sie dann den Aktivierungslaser, indem Sie Verschluss zwei schließen, ohne Objektiv einzusetzen und bei geöffnetem Mikroskopverschluss. Öffnen Sie den Ableserverschluss, Verschluss eins, und leiten Sie den Laser durch die hintere Öffnung des Mikroskops.Stellen Sie Spiegel fünf so ein, bis der Strahl aus dem Mikroskop austritt, sodass der Strahl vertikal aus dem Mikroskop austritt, wobei Linse eins und das Objektiv wieder an ihrem Platz sind. Platzieren Sie eine Probe, die 100 Mikromolar Brom B enthält, auf dem Objekttisch, während der Aktivierungslaser blockiert ist. Leiten Sie den Ableselaser durch ein 60×-Objektiv und in den Farbstoff ein.Bei deaktivierter elektronenvervielfachender Verstärkung. Sende dieses Bild an die Kamera. Fokussieren Sie als Nächstes das Objektiv in die Probe hinein.Öffnen Sie die Blende so weit, dass die Abbildung des gesamten Strahlprofils möglich ist. Verschieben Sie dann die Blende seitlich, sodass der Mittelpunkt des Strahlprofils und der Mittelpunkt der Blende konzentrisch liegen. Wählen Sie mithilfe der Kamerasoftware den interessierenden Bereich, um die kleinste Kamera-Auslesefläche zu definieren, die beide Kanäle umschließt, und notieren Sie diese Koordinaten.Zu diesem Zeitpunkt eine einzelne Momentaufnahme aufnehmen, um das Profil des Ableselichtstrahls darzustellen. Danach den Ableselaser durch Schließen des ersten Verschlusses blockieren und den zweiten Verschluss öffnen. Um mit der Messung des Aktivierungsstrahlprofils zu beginnen, den Aktivierungslaser auf die Probe projizieren; falls erforderlich, einen elektronischen Verstärkungsgewinn von weniger als 100 verwenden und den ersten dichroischen Spiegel justieren, bis der Strahl in jedem Sichtfeld zentriert ist.Zeichnen Sie dann eine Momentaufnahme des Aktivierungsstrahlungsprofils auf, um mit der Aufnahme von multicolor F-PALM-Bildern zu beginnen. Schalten Sie sämtliche Raumbeleuchtung aus. Projizieren Sie dann die Quecksilberlampe über die Kippvorrichtung auf die transfizierten Zellen und wechseln Sie den Filterwürfel zu einem, der die geeignete Anregungswellenlänge des vorherigen Photo-Schaltzustands enthält.Wenn eine Zelle ausgewählt wurde, senken Sie die Flip-Mount, um die Laser in das Mikroskop eintreten zu lassen, und wechseln Sie den Filterrevolver zu dem, der den geeigneten dichroitischen Spiegel für die Bildgebung gemäß dem begleitenden Textprotokoll enthält. Projizieren Sie dann das Bild auf die Kamera, um transfizierte Zellen von der Hintergrundfluoreszenz zu unterscheiden und zu bestätigen, dass die Moleküle belichtbar sind. Beleuchten Sie die Probe kurz mit einer geringen Leistung von weniger als 10 Mikrowatt vom Aktivierungslaser. Bereiten Sie als Nächstes die Kamerasoftware für die Aufnahme einer kinetischen Serie vor, indem Sie den elektronischen Verstärkungsfaktor auf 200 und die gewünschte Anzahl von Einzelbildern auf einen Wert zwischen fünf und 10.000 einstellen. Stellen Sie außerdem die Belichtungszeit auf einen Wert zwischen 10 und 30 Millisekunden ein. Sperren Sie dann den Aktivierungsstrahl, entsperren Sie den Auslesestrahl und projizieren Sie das Bild der belichteten Zelle auf die Kamera.Wählen Sie eine Fokusebene nahe der unteren Zellmembran, indem Sie den Fokus so weit nach unten verschieben, bis die einzelnen Moleküle nicht mehr sichtbar sind. Bewegen Sie den Fokus dann allmählich nach oben, bis die Moleküle erstmals sichtbar werden. Blenden Sie nun den Aktivierungsstrahl frei und beleuchten Sie die Probe mit einer Intensität von weniger als einem Watt pro Quadratzentimeter.Beginnen Sie mit der Erfassung dieser Daten mithilfe der Kamerasoftware, wobei eine Dichte von 0,1 bis einem sichtbaren, abbildbaren Molekül pro Quadratmikrometer durch dynamische Anpassung des Neutraldichtefilters vor dem Aktivierungslaser aufrechterhalten wird. Für die Totalreflexions-Fluoreszenzbildgebung montieren Sie Spiegel fünf und Linse eins auf einer gemeinsamen Translationsstufe, die später lateral direkt hinter dem Eingang zum Mikroskop bewegt wird. Während Spiegel fünf und Linse eins verschoben werden, neigen sich die Laserstrahlen, die nach oben durch die Probe und das Objektiv austreten, allmählich zur Seite; setzen Sie die Verschiebung der Stufe fort, bis der Winkel der Laserstrahlen 90 Grad gegenüber der Vertikalen erreicht hat.Zu diesem Zeitpunkt verschwindet der entstehende Laser selbst, und der einfallende Laser wird rückreflektiert in die Öffnung, wobei er antiparallel zum einfallenden Strahl verläuft und seitlich versetzt ist. Sie sollten eine Verringerung der Hintergrundfluoreszenz beobachten, wenn die Probe nach Abschluss der Bildaufnahmen in die Totalreflexionsfluoreszenz eintritt; schließen Sie unmittelbar danach den Mikroskop-Verschluss und blockieren Sie beide Strahlen. Deaktivieren Sie die elektronische Verstärkung.Stellen Sie die Kamera so ein, dass sie einen einzelnen Bildrahmen aufnimmt, und setzen Sie den Auslesebereich der Kamera auf die maximale Größe. Blockieren Sie abschließend einen Kanal, indem Sie eine Karte über F drei oder F vier mit einem Langpassfilter, der am Mikroskoplicht angebracht ist, platzieren. Beleuchten Sie die Probe und projizieren Sie dieses Bild auf die Kamera.Nehmen Sie eine Momentaufnahme der Zelle im Durchlicht auf, um die gesamte Zelle darzustellen. Gezeigt ist ein Beispiel einer zweifarbigen F-palm-Aufnahme einer NIH-3T3-Zelle, die sowohl DENDRA zwei Hämagglutinin als auch PAM-Cherry-Aktin exprimiert. Der Durchlichtkanal auf der linken Seite enthält längere Wellenlängen als der Reflektionskanal auf der rechten Seite.Gezeigt sind hier Aufnahmen aus derselben zweifarbigen F-OM-Aufnahme nach Hintergrundsubtraktion und Transformation zur Überlagerung der linken und rechten Kanäle. Einzelne Moleküle können identifiziert und lokalisiert werden. Einige Moleküle erscheinen im durchgehenden Kanal heller, während andere eine gleichmäßigere Verteilung der Emission zwischen den beiden Kanälen aufweisen.Dies zeigt den Unterschied in den Emissionsspektren zwischen PAM cherry und DENDRA zwei beziehungsweise auf und wird in der Analyse verwendet, um diese beiden Spezies zu identifizieren. Das hier gezeigte Histogramm gibt ein Verhältnis der roten durchgelassenen Kanalintensität zur Gesamtintensität für alle lokalisierten Moleküle nach Anwendung der Toleranzen an. Die Pixel erscheinen im unteren linken Bild als weiß und im endgültigen zusammengefügten Bild, das rechts unten dargestellt ist, als rot, wobei jene im grünen Bereich im oberen rechten Bild als weiß dargestellt werden und im endgültigen zusammengefügten Bild, das rechts unten gezeigt wird, grün erscheinen.Die gewählten Schwellenwerte beim Rendern beeinflussen in hohem Maße das Maß an Rauschen und das Erscheinungsbild der Kolokalisation. Hier werden drei verschiedene Optionen für das Rendern gezeigt, die zu unterschiedlichem Ausmaß an Übersprechen führen; die konservativsten Schwellenwerte sind in den unteren beiden dargestellt. Farb-Histogramme von F-Palm-Alpha eignen sich am besten zur Interpretation, wenn zwei klar unterscheidbare Peaks im Bild vorhanden sind.Während das Histogramm auf der linken Seite gut für eine weitere Analyse geeignet ist, werden die aus den anderen beiden Histogrammen resultierenden Bilder viel schwieriger zu interpretieren sein. Mit Methoden wie der Totalreflexionsmikroskopie und der Live-Cell-Abbildung können zusätzliche Fragestellungen beantwortet werden, beispielsweise wie Proteine im Nanomaßstab in lebenden Zellmembranen organisiert sind. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ihr eigenes FAR-Mikroskop aufbauen und zur Datenaufnahme verwenden können.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lasern äußerst gefährlich sein kann und eine Sicherheitsschulung abgeschlossen werden sollte, bevor dieser Vorgang durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video beschreibt BiFC-PALM ― eine Kombination aus photoaktivierter Lokalisationsmikroskopie und bimolekularer Fluoreszenzkomplementierung ― zur Beurteilung von Protein-Protein-Wechselwirkungen. BiFC beinhaltet die Fusion von zwei fluoreszierenden Proteinfragmenten mit zwei interagierenden Proteinen von Interesse. Wenn die beiden Proteine interagieren, werden die Fragmente in die Nähe gebracht, wodurch die beiden Teile zusammenkommen und ein funktionsfähiges fluoreszierendes Protein...

Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementierungs-gekoppelte photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie

Komplexe Gewebemassen, von Organen, Tumoren, werden von verschiedenen zellulären Elementen. Wir erläutert den Beitrag von zellulären Phänotypen innerhalb eines Gewebes unter Verwendung von Multi-markierte Fluoreszenz-transgenen Mäusen in Kombination mit Multiimmunfluoreszenzfärbung gefolgt von Entmischung, den Zellursprung sowie Zelleigenschaften auf der Basis der Proteinexpression zu entschlüsseln.

Quantitative Multispektrale Fluoreszenz-Analyse Nach Gewebetransplantation zur Visualisierung von Zell Origins, Typen und Wechselwirkungen

Dual-Kamera-Emissionsspaltanlagen für zwei-Farben-Fluoreszenz-Mikroskopie erzeugen Echtzeit-Bildsequenzen mit außergewöhnlichen optischen und zeitlichen Auflösung, einem Bedarf von lebenden Zellassays einschließlich Parallelplattenlaufkammer Adhäsions-Assays. Als Software wird verwendet, um Bilder von gleichzeitig erworben Emissionskanäle verschmelzen, pseudocolored Bildsequenzen produziert.

Gleichzeitig Capturing in Echtzeit Bilder in zwei Emissions Kanäle unter Verwendung eines Dual-Kamera-Emissions-Splitting-System: Anwendungen in der Zelladhäsion

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