Simultane Multicolor-Imaging biologischer Strukturen mit Fluoreszenzphotoaktivierung Lokalisationsmikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mehrere Proteinspezies gleichzeitig mit Nanometergenauigkeit in fixierten oder lebenden Zellen abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst die Position einer Kamera und einer Optik angepasst wird, bis ein fokussiertes Bild vom Mikroskop auf den Kamerachip projiziert wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Laserstrahlen so anzuordnen, dass sie direkt auf eine Probe auf dem Mikroskoptisch ausgerichtet sind.

Als nächstes wird die vorbereitete Zellprobe beleuchtet und eine Zelle ausgewählt, die die gewünschten Proteine exprimiert. Der letzte Schritt besteht darin, die Zelle mit einer Fluoreszenz-Photoaktivierungs-Lokalisierungsmikroskopie abzubilden, indem die Probe mit Lasern beleuchtet und dann die Zellfluoreszenz auf den Kamerachip gerichtet wird, um einen Datensatz zu erfassen. Letztendlich wird die Fluoreszenz-Photoaktivierungs-Lokalisationsmikroskopie verwendet, um die Lokalisierung mehrerer Proteinspezies auf der räumlichen Nanometerskala in fixierten oder lebenden Zellen und entweder im Weitfeld oder bei Verwendung der Totalreflexionsfluoreszenz zur Isolierung eines dünnen Bereichs der Probe zu zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Konfokal- oder Elektronenmikroskopie besteht darin, dass man mehrere Proteine gleichzeitig mit Nanometerauflösung in fixierten oder lebenden Zellen abbilden kann. Die folgenden Schritte beziehen sich auf ein Nummerierungssystem, wie hier gezeigt, das ein Schema für den mehrfarbigen F Om-Aufbau ist, der als erste Figur im begleitenden Textprotokoll zum Ausrichten des Mikroskops bereitgestellt ist. Beginnen Sie mit dem Platzieren einer Kalibrierskala oder eines Radikals auf dem Mikroskoptisch mit einem 10-fach-Objektiv an Ort und Stelle und dem Lampensatz für Durchlicht. Zentrieren Sie die Vertikale in der Mitte des Sichtfelds.

Stellen Sie als Nächstes das Mikroskop auf die Koer-Beleuchtung ein, indem Sie die Feldblende schließen und durch das Okular auf die Vertikale schauen. Wenn die Ränder der Feldblende unscharf sind, passen Sie die Höhe des Kondensors an, bis sowohl die Feldblende als auch die Blende scharf sind. Passen Sie dann die seitliche Position der Feldblende an, bis sie in Bezug auf das Sichtfeld zentriert ist, und schließen Sie die Feldblende, bis nur noch das mittlere Raster auf dem Rot beleuchtet ist.

Wenn diese Komponenten zum ersten Mal eingebaut werden, passen Sie die Pfadlängen der einzelnen Kanäle gleich an. Um dieses Projekt zu erreichen, werden die Spiegel sieben und neun auf dem Kamerachip eingestellt und die Detektionsblende geschlossen, um eine räumliche Überlappung zwischen den beiden Kanälen zu verhindern. Fokussieren Sie dann das Bild des Radikals im Auflichtkanal und prüfen Sie, ob es auch im Durchlichtkanal scharf ist.

Wenn das Bild im Durchlichtkanal nicht scharf ist, wird Spiegel neun verschoben, bis das Radikalbild in beiden Kanälen gleichzeitig scharf ist. Beginnen Sie mit dem Ausrichten der Laser, indem Sie die erste Linse aus dem Lasergang entfernen und die Aktivierungs- und Auslesestrahlen blockieren. Legen Sie dann eine weiße Karte bündig gegen Spiegel vier, öffnen Sie den Mikroskopverschluss und fokussieren Sie, bis das Radikalbild auf die Karte vor Spiegel vier projiziert wird.

Lösen Sie als Nächstes die Blockierung des Auslesestrahls und stellen Sie den ersten Spiegel so ein, dass der Ausleselaser auf das Fadenkreuz des Radikalbildes auf Spiegel vier zentriert wird. Nach dem Zentrieren projizieren Sie das Radikalbild auf Spiegel fünf und stellen Sie Spiegel vier ein, bis der Strahl auf dem Fadenkreuz des fünften Spiegels zentriert ist. Der Auslesestrahl sollte nun sowohl bei M vier als auch bei M fünf zentriert sein.

Blockieren Sie dann den Auslesestrahl, indem Sie den ersten Verschluss schließen. Projizieren Sie als Nächstes das Radikalbild auf Spiegel drei. Entfernen Sie den Strahlaufweiter aus dem Laserpfad und entsperren Sie den Aktivierungslaser.

Stellen Sie nun Spiegel zwei so ein, dass der Aktivierungsstrahl auf das Fadenkreuz des Radikalbildes auf Spiegel drei zentriert wird. Setzen Sie nach der Zentrierung den Strahlaufweiter zwischen den Spiegeln zwei und drei wieder ein und passen Sie die Position des Strahlaufweiters an, bis der Strahl auf dem Fadenkreuz des Radikalbildes zentriert ist. Projizieren Sie auf Spiegel drei das Radikalbild auf Spiegel fünf und fokussieren Sie.

Stellen Sie mit dem Fokusknopf des Mikroskops den Winkel des dichroitischen Spiegels Nummer eins ein, bis der Aktivierungsstrahl auf dem Röntgenbild zentriert ist. Blockieren Sie dann den Aktivierungslaser, indem Sie den zweiten Verschluss ohne Objektiv schließen und den Mikroskopverschluss öffnen. Öffnen Sie den Ausleseverschluss, den Verschluss eins und projizieren Sie den Laser durch die hintere Öffnung des Mikroskops.

Stellen Sie den fünften Spiegel so ein, dass der Strahl aus dem Mikroskop austritt, sodass der Strahl das Mikroskop vertikal verlässt, wobei die erste Linse und das Objektiv wieder an Ort und Stelle sind. Legen Sie eine Probe mit 100 mikromolaren Brom B auf den Tisch, auf dem der Aktivierungslaser blockiert ist. Projizieren Sie den Ausleselaser durch ein 60-fach-Objektiv in den Farbstoff.

Wenn die Elektronenmultiplikationsverstärkung deaktiviert ist. Senden Sie dieses Bild an die Kamera. Fokussieren Sie als Nächstes das Objektiv auf die Stichprobe.

Öffnen Sie die Blende weit genug, um die Abbildung des vollen Lichtkegelprofils zu ermöglichen. Verschieben Sie dann die Apertur seitlich, so dass die Mitte des Strahlprofils und die Apertur konzentrisch sind. Wählen Sie mit der Kamerasoftware den interessierenden Bereich aus, um den kleinsten Kameraauslesebereich zu ermöglichen, der beide Kanäle umfasst, und zeichnen Sie diese Koordinaten auf.

Nehmen Sie an dieser Stelle einen einzelnen Schnappschuss auf, um das ausgelesene Strahlprofil darzustellen. Blockieren Sie anschließend den Ausleselaser, indem Sie den ersten Verschluss schließen und den zweiten Verschluss öffnen. Um mit der Messung des Aktivierungsstrahlprofils zu beginnen, projizieren Sie den Aktivierungslaser auf die Probe, falls erforderlich, verwenden Sie eine Elektronenmultiplikationsverstärkung von weniger als 100 und stellen Sie den ersten dichroitischen Spiegel so ein, dass der Strahl in jedem Sichtfeld zentriert ist.

Nehmen Sie dann einen Schnappschuss des Aktivierungsstrahlprofils auf, um mit der Aufnahme von mehrfarbigen F-Handflächenbildern zu beginnen. Eliminieren Sie die gesamte Raumbeleuchtung. Projizieren Sie dann die Quecksilberlampe über die Flip-Halterung auf transfizierte Küvetten und tauschen Sie den Filterwürfel gegen einen Würfel aus, der die entsprechende Anregungswellenlänge des Pre-Photo-Schalters enthält. Zustand.

Sobald eine Zelle ausgewählt ist, bewegen Sie die Flip-Halterung nach unten, um die Laser in das Mikroskop passieren zu lassen, und tauschen Sie den Filterturm gegen den aus, der den entsprechenden dichroitischen Spiegel für die Bildgebung enthält, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Projizieren Sie dieses Bild dann auf die Kamera, um transfizierte Zellen von der Hintergrundfluoreszenz zu unterscheiden und zu bestätigen, dass Moleküle photofähig sind. Beleuchten Sie die Probe kurz mit einer geringen Leistung von weniger als 10 Mikrowatt vom Aktivierungslaser.

Bereiten Sie als Nächstes die Kamerasoftware für die kinetische Serienerfassung vor, indem Sie das Elektronenmultiplikationsspiel auf 200 und die gewünschte Anzahl von Bildern auf fünf bis 10.000 einstellen. Stellen Sie außerdem die Belichtung auf 10 bis 30 Millisekunden ein. Blockieren Sie dann den Aktivierungsstrahl, entsperren Sie den Auslesestrahl und projizieren Sie das Bild der beleuchteten Zelle auf die Kamera.

Wählen Sie eine Brennebene in der Nähe der unteren Zellmembran, indem Sie den Fokus nach unten verschieben, bis die einzelnen Moleküle nicht mehr sichtbar sind. Bewegen Sie dann den Fokus allmählich nach oben, bis die Moleküle zum ersten Mal sichtbar werden. Lösen Sie nun die Blockade des Aktivierungsstrahls und beleuchten Sie die Probe mit weniger als einem Watt pro Quadratzentimeter Intensität.

Beginnen Sie mit der Erfassung dieser Daten über die Kamerasoftware unter Beibehaltung einer Dichte von 0,1 bis 1 sichtbaren photoablen Molekülen pro Quadratmikrometer, indem Sie den Neutraldichtefilter vor dem Aktivierungslaser dynamisch anpassen. Für die Totalreflexionsfluoreszenzbildgebung werden Spiegel fünf und Objektiv eins auf einen einzigen Translationstisch montiert, der seitlich direkt hinter dem Eingang zum Mikroskop verschoben wird. Während Spiegel fünf und Linse eins verschoben werden, kippen die Laser, die das Objektiv nach oben durch die Probe verlassen, allmählich zu einer Seite und setzen die Verschiebung des Tisches fort, bis der Winkel der Laser 90 Grad von der Vertikalen erreicht.

An diesem Punkt verschwindet der austretende Laser selbst und der eingehende Laser wird in die Apertur zurückreflektiert, wobei er sich antiparallel zum einfallenden Strahl bewegt und zur Seite verschoben wird. Sie sollten eine Verringerung des Hintergrunds sehen, wenn die Probe nach Abschluss der Bildaufnahme in die Totalreflexionsfluoreszenz eintritt, schließen Sie sofort den Mikroskopverschluss und blockieren Sie beide Strahlen. Deaktivieren Sie die Elektronenmultiplikationsverstärkung.

Stellen Sie die Kamera so ein, dass sie ein Bild aufzeichnet, und stellen Sie den Anzeigebereich der Kamera auf die maximale Größe ein. Blockieren Sie schließlich einen Kanal, indem Sie eine Karte über F drei oder F vier legen, auf der ein Langpassfilter auf der Mikroskoplampe montiert ist. Beleuchten Sie die Probe und projizieren Sie dieses Bild in die Kamera.

Nehmen Sie einen Schnappschuss der Zelle auf, um die gesamte Zelle im Durchlicht darzustellen. Hier sehen Sie ein Beispiel für die Aufnahme einer zweifarbigen F-Handfläche einer NIH-Drei-T-Zelle, die sowohl DENDRA-Zwei-Hämagglutinin als auch PAM-Kirsch-Aktin exprimiert. Der übertragene Kanal auf der linken Seite enthält längere Wellenlängen als der reflektierte Kanal auf der rechten Seite.

Hier sind Schnappschüsse aus der gleichen zweifarbigen F OM-Erfassung nach Hintergrund, Subtraktion und Transformation zu sehen, um den linken und rechten Kanal zu überlagern. Einzelne Moleküle können identifiziert und lokalisiert werden. Einige Moleküle erscheinen im übertragenen Kanal heller und andere haben eine gleichmäßigere Verteilung der Emission zwischen den beiden Kanälen.

Dies zeigt den Unterschied in den Emissionsspektren zwischen PAM-Kirsche und DENDRA jeweils zwei und wird in der Analyse zur Identifizierung dieser beiden Arten verwendet. Das hier gezeigte Histogramm zeigt ein Verhältnis der Intensität des rot übertragenen Kanals dividiert durch die Gesamtintensität für alle lokalisierten Moleküle nach Anwendung der Toleranzen. Die Pixel erscheinen im Bild unten links weiß und erscheinen rot im endgültigen zusammengefügten Bild, das unten rechts angezeigt wird, während die Pixel im grünen Bereich im Bild oben rechts als weiß und im endgültigen zusammengeführten Bild unten rechts grün angezeigt werden.

Die Schwellenwerte, die beim Rendern ausgewählt werden, wirken sich stark auf den Grad des Rauschens und die Darstellung der Kolokalisierung aus. Gezeigt. Hier sind drei verschiedene Optionen für das Rendern, die zu unterschiedlichen Graden von Bleed führen, wobei die konservativsten Schwellenwerte in den unteren beiden dargestellt sind. Color F Palm Alpha-Histogramme sind am besten zu interpretieren, wenn zwei Peaks im Bild erkennbar sind.

Während das Histogramm auf der linken Seite ein guter Kandidat für die weitere Analyse ist, sind die Bilder, die sich aus den beiden anderen Histogrammen ergeben, nach diesem Verfahren viel schwieriger zu interpretieren. Methoden wie Totalreflexion, Mikroskopie und Lebendzellbildgebung können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Organisation von Proteinen auf der Nanoskala in lebenden Zellmembranen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ihr eigenes FAR-Mikroskop einrichten und es zur Datenerfassung verwenden.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lasern extrem gefährlich sein kann und eine Sicherheitsschulung absolviert werden sollte, bevor Sie dieses Verfahren versuchen.