Simultane Multicolor-Imaging biologischer Strukturen mit Fluoreszenzphotoaktivierung Lokalisationsmikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mehrere Proteinspezies gleichzeitig mit Nanometerpräzision in fixierten oder lebenden Zellen abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst die Position einer Kamera und der Optik angepasst wird, bis ein scharfes Bild vom Mikroskop auf den Kamerachip projiziert wird. Der zweite Schritt besteht darin, Laserstrahlen so anzuordnen, dass sie direkt auf eine Probe auf dem Mikroskoptisch ausgerichtet sind.

Anschließend wird die vorbereitete Zellprobe beleuchtet und eine Zelle ausgewählt, die die gewünschten Proteine exprimiert. Der letzte Schritt besteht darin, die Zelle mittels Fluoreszenz-Photoaktivierungs-Lokalisierungsmikroskopie abzubilden, indem die Probe mit Lasern beleuchtet und die Zellfluoreszenz anschließend auf den Kamerachip gelenkt wird, um einen Datensatz zu erfassen. Letztlich kommt die Fluoreszenz-Photoaktivierungs-Lokalisierungsmikroskopie zum Einsatz, um die Lokalisation mehrerer Proteinspezies auf nanometrischer räumlicher Skala in fixierten oder lebenden Zellen darzustellen, und zwar entweder im Weitfeld oder unter Verwendung der Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie, um einen dünnen Bereich der Probe zu isolieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der konfokalen oder Elektronenmikroskopie besteht darin, dass mehrere Proteine gleichzeitig mit nanometrischer Auflösung in fixierten oder lebenden Zellen abgebildet werden können. Die folgenden Schritte beziehen sich auf ein Nummerierungssystem, das hier dargestellt ist und ein Schema für die multicolor F Om-Aufbauten darstellt, das als Abbildung eins im beigefügten textbasierten Protokoll zur Ausrichtung des Mikroskops bereitgestellt wird. Beginnen Sie damit, eine Kalibrierskala oder ein Radikal auf den Mikroskoptisch zu platzieren, wobei ein 10×-Objektiv eingesetzt ist und die Lampe auf Durchlicht eingestellt ist. Zentrieren Sie die vertikale Linie in der Mitte des Sichtfeldes.

Als Nächstes stellen Sie das Mikroskop für die Durchlichtbeleuchtung ein, indem Sie die Feldblende schließen und durch die Okulare auf die vertikale Ebene blicken. Wenn die Ränder der Feldblende unscharf sind, stellen Sie die Höhe des Kondensors so ein, bis sowohl die Feldblende als auch das Fadenkreuz scharf sind. Danach justieren Sie die laterale Position der Feldblende, bis diese bezüglich des Sichtfeldes zentriert ist, und schließen die Feldblende so weit, bis nur noch das mittlere Gitter im Fadenkreuz beleuchtet ist.

Wenn diese Komponenten zum ersten Mal zusammengestellt werden, müssen die Pfadlängen jedes Kanals angeglichen werden. Um dieses Projekt durchzuführen, leiten Sie das rote Licht auf den Kamerachip, indem Sie die Spiegel sieben und neun justieren, und schließen Sie die Detektionsblende, um räumliche Überlappung zwischen den beiden Kanälen zu vermeiden. Fokussieren Sie dann das Bild des Radikals im reflektierten Lichtkanal und prüfen Sie, ob es auch im durchgehenden Lichtkanal scharfgestellt ist.

Wenn das Bild im durchgehenden Lichtkanal nicht scharf ist, verschieben Sie Spiegel neun, bis das radikale Bild gleichzeitig in beiden Kanälen scharf ist. Beginnen Sie mit der Justage der Laser, indem Sie Linse eins aus dem Laserstrahlweg entfernen und die Aktivierungs- und Auslesestrahlen blockieren. Bringen Sie dann eine weiße Karte bündig vor Spiegel vier an, öffnen Sie den Mikroskop-Verschluss und fokussieren Sie, bis das radikale Bild auf die Karte vor Spiegel vier projiziert wird.

Als Nächstes entsperren Sie den Abtaststrahl und justieren Sie Spiegel eins, um den Abtastlaser in der Mitte auf die Fadenkreuzmarkierung des Radikalbilds auf Spiegel vier auszurichten. Sobald er zentriert ist, projizieren Sie das Radikalbild auf Spiegel fünf und justieren Sie Spiegel vier, bis der Strahl auf den Fadenkreuzmarkierungen des Radikalbilds von Spiegel fünf zentriert ist. Der Abtaststrahl sollte nun sowohl auf Spiegel vier als auch auf Spiegel fünf zentriert sein.

Blockieren Sie dann den Abtaststrahl, indem Sie den Verschluss eins schließen. Projizieren Sie anschließend das Radikalbild auf Spiegel drei. Entfernen Sie den Strahlaufweiter aus dem Laserstrahlengang und freigeben Sie den Aktivierungslaser.

Justieren Sie nun Spiegel zwei so, dass der Aktivierungsstrahl auf dem Fadenkreuz des Radikalbildes auf Spiegel drei zentriert ist. Sobald dies erreicht ist, setzen Sie den Strahlexpander zwischen Spiegel zwei und Spiegel drei wieder ein und justieren Sie die Position des Strahlexpanders, bis der Strahl auf dem Fadenkreuz des Radikalbildes zentriert ist. Projizieren Sie auf Spiegel drei das Radikalbild auf Spiegel fünf und fokussieren Sie es.

Stellen Sie mithilfe des Fokusknopfs des Mikroskops den Winkel des dichroitischen Spiegels Nummer eins so ein, dass der Aktivierungsstrahl in der Mitte des Redle-Bildes liegt. Blockieren Sie dann den Aktivierungslaser, indem Sie Verschluss zwei schließen, ohne Objektiv einzusetzen und bei geöffnetem Mikroskopverschluss. Öffnen Sie den Ableserverschluss, Verschluss eins, und leiten Sie den Laser durch die hintere Öffnung des Mikroskops.

Stellen Sie Spiegel fünf so ein, bis der Strahl aus dem Mikroskop austritt, sodass der Strahl vertikal aus dem Mikroskop austritt, wobei Linse eins und das Objektiv wieder an ihrem Platz sind. Platzieren Sie eine Probe, die 100 Mikromolar Brom B enthält, auf dem Objekttisch, während der Aktivierungslaser blockiert ist. Leiten Sie den Ableselaser durch ein 60×-Objektiv und in den Farbstoff ein.

Bei deaktivierter elektronenvervielfachender Verstärkung. Sende dieses Bild an die Kamera. Fokussieren Sie als Nächstes das Objektiv in die Probe hinein.

Öffnen Sie die Blende so weit, dass die Abbildung des gesamten Strahlprofils möglich ist. Verschieben Sie dann die Blende seitlich, sodass der Mittelpunkt des Strahlprofils und der Mittelpunkt der Blende konzentrisch liegen. Wählen Sie mithilfe der Kamerasoftware den interessierenden Bereich, um die kleinste Kamera-Auslesefläche zu definieren, die beide Kanäle umschließt, und notieren Sie diese Koordinaten.

Zu diesem Zeitpunkt eine einzelne Momentaufnahme aufnehmen, um das Profil des Ableselichtstrahls darzustellen. Danach den Ableselaser durch Schließen des ersten Verschlusses blockieren und den zweiten Verschluss öffnen. Um mit der Messung des Aktivierungsstrahlprofils zu beginnen, den Aktivierungslaser auf die Probe projizieren; falls erforderlich, einen elektronischen Verstärkungsgewinn von weniger als 100 verwenden und den ersten dichroischen Spiegel justieren, bis der Strahl in jedem Sichtfeld zentriert ist.

Zeichnen Sie dann eine Momentaufnahme des Aktivierungsstrahlungsprofils auf, um mit der Aufnahme von multicolor F-PALM-Bildern zu beginnen. Schalten Sie sämtliche Raumbeleuchtung aus. Projizieren Sie dann die Quecksilberlampe über die Kippvorrichtung auf die transfizierten Zellen und wechseln Sie den Filterwürfel zu einem, der die geeignete Anregungswellenlänge des vorherigen Photo-Schaltzustands enthält.

Wenn eine Zelle ausgewählt wurde, senken Sie die Flip-Mount, um die Laser in das Mikroskop eintreten zu lassen, und wechseln Sie den Filterrevolver zu dem, der den geeigneten dichroitischen Spiegel für die Bildgebung gemäß dem begleitenden Textprotokoll enthält. Projizieren Sie dann das Bild auf die Kamera, um transfizierte Zellen von der Hintergrundfluoreszenz zu unterscheiden und zu bestätigen, dass die Moleküle belichtbar sind. Beleuchten Sie die Probe kurz mit einer geringen Leistung von weniger als 10 Mikrowatt vom Aktivierungslaser.

Bereiten Sie als Nächstes die Kamerasoftware für die Aufnahme einer kinetischen Serie vor, indem Sie den elektronischen Verstärkungsfaktor auf 200 und die gewünschte Anzahl von Einzelbildern auf einen Wert zwischen fünf und 10.000 einstellen. Stellen Sie außerdem die Belichtungszeit auf einen Wert zwischen 10 und 30 Millisekunden ein. Sperren Sie dann den Aktivierungsstrahl, entsperren Sie den Auslesestrahl und projizieren Sie das Bild der belichteten Zelle auf die Kamera.

Wählen Sie eine Fokusebene nahe der unteren Zellmembran, indem Sie den Fokus so weit nach unten verschieben, bis die einzelnen Moleküle nicht mehr sichtbar sind. Bewegen Sie den Fokus dann allmählich nach oben, bis die Moleküle erstmals sichtbar werden. Blenden Sie nun den Aktivierungsstrahl frei und beleuchten Sie die Probe mit einer Intensität von weniger als einem Watt pro Quadratzentimeter.

Beginnen Sie mit der Erfassung dieser Daten mithilfe der Kamerasoftware, wobei eine Dichte von 0,1 bis einem sichtbaren, abbildbaren Molekül pro Quadratmikrometer durch dynamische Anpassung des Neutraldichtefilters vor dem Aktivierungslaser aufrechterhalten wird. Für die Totalreflexions-Fluoreszenzbildgebung montieren Sie Spiegel fünf und Linse eins auf einer gemeinsamen Translationsstufe, die später lateral direkt hinter dem Eingang zum Mikroskop bewegt wird. Während Spiegel fünf und Linse eins verschoben werden, neigen sich die Laserstrahlen, die nach oben durch die Probe und das Objektiv austreten, allmählich zur Seite; setzen Sie die Verschiebung der Stufe fort, bis der Winkel der Laserstrahlen 90 Grad gegenüber der Vertikalen erreicht hat.

Zu diesem Zeitpunkt verschwindet der entstehende Laser selbst, und der einfallende Laser wird rückreflektiert in die Öffnung, wobei er antiparallel zum einfallenden Strahl verläuft und seitlich versetzt ist. Sie sollten eine Verringerung der Hintergrundfluoreszenz beobachten, wenn die Probe nach Abschluss der Bildaufnahmen in die Totalreflexionsfluoreszenz eintritt; schließen Sie unmittelbar danach den Mikroskop-Verschluss und blockieren Sie beide Strahlen. Deaktivieren Sie die elektronische Verstärkung.

Stellen Sie die Kamera so ein, dass sie einen einzelnen Bildrahmen aufnimmt, und setzen Sie den Auslesebereich der Kamera auf die maximale Größe. Blockieren Sie abschließend einen Kanal, indem Sie eine Karte über F drei oder F vier mit einem Langpassfilter, der am Mikroskoplicht angebracht ist, platzieren. Beleuchten Sie die Probe und projizieren Sie dieses Bild auf die Kamera.

Nehmen Sie eine Momentaufnahme der Zelle im Durchlicht auf, um die gesamte Zelle darzustellen. Gezeigt ist ein Beispiel einer zweifarbigen F-palm-Aufnahme einer NIH-3T3-Zelle, die sowohl DENDRA zwei Hämagglutinin als auch PAM-Cherry-Aktin exprimiert. Der Durchlichtkanal auf der linken Seite enthält längere Wellenlängen als der Reflektionskanal auf der rechten Seite.

Gezeigt sind hier Aufnahmen aus derselben zweifarbigen F-OM-Aufnahme nach Hintergrundsubtraktion und Transformation zur Überlagerung der linken und rechten Kanäle. Einzelne Moleküle können identifiziert und lokalisiert werden. Einige Moleküle erscheinen im durchgehenden Kanal heller, während andere eine gleichmäßigere Verteilung der Emission zwischen den beiden Kanälen aufweisen.

Dies zeigt den Unterschied in den Emissionsspektren zwischen PAM cherry und DENDRA zwei beziehungsweise auf und wird in der Analyse verwendet, um diese beiden Spezies zu identifizieren. Das hier gezeigte Histogramm gibt ein Verhältnis der roten durchgelassenen Kanalintensität zur Gesamtintensität für alle lokalisierten Moleküle nach Anwendung der Toleranzen an. Die Pixel erscheinen im unteren linken Bild als weiß und im endgültigen zusammengefügten Bild, das rechts unten dargestellt ist, als rot, wobei jene im grünen Bereich im oberen rechten Bild als weiß dargestellt werden und im endgültigen zusammengefügten Bild, das rechts unten gezeigt wird, grün erscheinen.

Die gewählten Schwellenwerte beim Rendern beeinflussen in hohem Maße das Maß an Rauschen und das Erscheinungsbild der Kolokalisation. Hier werden drei verschiedene Optionen für das Rendern gezeigt, die zu unterschiedlichem Ausmaß an Übersprechen führen; die konservativsten Schwellenwerte sind in den unteren beiden dargestellt. Farb-Histogramme von F-Palm-Alpha eignen sich am besten zur Interpretation, wenn zwei klar unterscheidbare Peaks im Bild vorhanden sind.

Während das Histogramm auf der linken Seite gut für eine weitere Analyse geeignet ist, werden die aus den anderen beiden Histogrammen resultierenden Bilder viel schwieriger zu interpretieren sein. Mit Methoden wie der Totalreflexionsmikroskopie und der Live-Cell-Abbildung können zusätzliche Fragestellungen beantwortet werden, beispielsweise wie Proteine im Nanomaßstab in lebenden Zellmembranen organisiert sind. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ihr eigenes FAR-Mikroskop aufbauen und zur Datenaufnahme verwenden können.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lasern äußerst gefährlich sein kann und eine Sicherheitsschulung abgeschlossen werden sollte, bevor dieser Vorgang durchgeführt wird.