Name: Simultane Multicolor-Imaging biologischer Strukturen mit Fluoreszenzphotoaktivierung Lokalisationsmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-09T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 51 s
Description: Erfahren Sie die Fluoreszenzphotoaktivierungs-Lokalisationsmikroskopie (FPALM) zur hochaufgelösten Bildgebung mehrerer Proteinspezies in Zellen. Diese Methode ermöglicht Nanometer-präzise Lokalisation in fixierten und lebenden Zellen.

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Die Autoren danken Philip Andresen, Matthew Parent und Sean Carter für die Computerprogrammierung, technische Unterstützung und nützliche Gespräche sowie Pat Byard für die administrative Unterstützung. Diese Arbeit wurde finanziert durch den NIH Career Award K25-AI65459, NIH R15 GM094713, NSF MRI CHE-0722759, das Maine Technology Institute MTAF 1106 und 2061 und den Maine Economic Improvement Fund.

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<li>Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biological+structures+with+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Nat. Protoc. 4, 291-308 (2009).</li>
<li>Gould, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+molecular+positions+and+anisotropies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of molecular positions and anisotropies.</a> Nat. Methods. 5, 1027-1030 (2008).</li>
<li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat Meth. 5, 527-529 (2008).</li>
<li>Kanchanawong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+architecture+of+integrin-based+cell+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat%22%5BJournal%5D)">Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions.</a> Nat. 468, 580-584 (2010).</li>
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<li>Hess, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clustered+distribution+of+hemagglutinin+resolved+at+40+nm+in+living+cell+membranes+discriminates+between+raft+theories%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamic clustered distribution of hemagglutinin resolved at 40 nm in living cell membranes discriminates between raft theories.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17370-17375 (2007).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nat. Methods. 5, 417-423 (2008).</li>
<li>Sengupta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+protein+heterogeneity+in+the+plasma+membrane+using+PALM+and+pair+correlation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis.</a> Nat. Methods. 8, 969-975 (2011).</li>
<li>Shroff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+superresolution+imaging+of+genetically+expressed+probes+within+individual+adhesion+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dual-color superresolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20308-20313 (2007).</li>
<li>Bock, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+far-field+fluorescence+nanoscopy+based+on+photoswitchable+emitters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+B%22%5BJournal%5D)">Two-color far-field fluorescence nanoscopy based on photoswitchable emitters.</a> Appl. Phys. B. 88, 161-165 (2007).</li>
<li>Bossi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+far-field+fluorescence+nanoscopy+through+isolated+detection+of+distinct+molecular+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Multicolor far-field fluorescence nanoscopy through isolated detection of distinct molecular species.</a> Nano Lett. 8, 2463-2468 (2008).</li>
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<li>Wilmes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple-Color+Super-Resolution+Imaging+of+Live+Cells%3A+Resolving+Submicroscopic+Receptor+Organization+in+the+Plasma+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Triple-Color Super-Resolution Imaging of Live Cells: Resolving Submicroscopic Receptor Organization in the Plasma Membrane.</a> Angewandte Chemie Int. Ed. 51, 4868-4871 (2012).</li>
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<li>Tanaka, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+molecules+mobile+even+after+chemical+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Membrane molecules mobile even after chemical fixation.</a> Nat. Methods. 7, 865-866 (2010).</li>
<li>Beisker, W., Dolbeare, F., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+immunocytochemical+procedure+for+high-sensitivity+detection+of+incorporated+bromodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">An improved immunocytochemical procedure for high-sensitivity detection of incorporated bromodeoxyuridine.</a> Cytometry. 8, 235-239 (1987).</li>
<li>Koehler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Method+of+Illumination+for+Photomicrographical+Purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">New Method of Illumination for Photomicrographical Purposes.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 Forthcoming.</li>
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</ol>

S.T.H. und M.J.M. halten Patente in der hochauflösenden Mikroskopie. S.T.H. ist Mitglied des wissenschaftlichen Beirats von Vutara, Inc.

Die lokalisierungsbasierte hochauflösende Bildgebung bietet viele leistungsstarke Funktionen für die biologische Bildgebung. Der Weg von einzelnen optischen Komponenten, die auf dem Tisch platziert werden, zu einem funktionsfähigen Superauflösungsmikroskop, das in der Lage ist, mehrere fluoreszierende Spezies in einer biologischen Probe gleichzeitig abzubilden, stellt eine Reihe von Herausforderungen dar. Einige Aspekte der Ausrichtung sind kritischer als andere; Im Folgenden bemühen wir uns, potenziellen Benutzern, die ...

Während zelluläre Strukturen auf einer Vielzahl von räumlichen Skalen existieren, ist die Fluoreszenzbildgebung der zellulären Organisation auf Längenskalen kleiner als ~250 nm in der konventionellen Mikroskopie aufgrund der physikalischen Einschränkung der Beugungsgrenze eingeschränkt. Diese Grenze wurde mit dem Aufkommen der Fluoreszenz-Photoaktivierungslokalisierungsmikroskopie (FPALM1) und ähnlicher Technikenüberwunden 2,3, die eine große Anzahl einzelner Moleküle mit einer Genauigkeit von ~10 nm lokalisieren können, um Bilder mit einer Auflösung von einigen Dutzend Nanometern zu erzeugen. FPALM basiert auf der Verwendung optischer Kontrolle, um Untergruppen von Molekülen zu aktivieren und zu inaktivieren (für eine vollständige Beschreibung von FPALM und Anweisungen zur Implementierung dieses Bildgebungssystems siehe Gould et al.4). Diese Technik ermöglicht es, die räumlichen Verteilungen ganzer Populationen einzelner Moleküle zu kartieren und so biologische Strukturen über Längenskalen von mehreren zehn Nanometern bis zu mehreren zehn Mikrometern aufzuklären. Die lokalisationsbasierte Superauflösungsmikroskopie (im Folgenden als Lokalisationsmikroskopie bezeichnet) wurde inzwischen an eine Reihe biologischer Fragestellungen angepasst, wobei technologische Entwicklungen beispielsweise die Abbildung einzelner molekularer Orientierungen mit Polarisations-FPALM oder P-FPALM5, die Fluoreszenzbildgebung einzelner Moleküle in drei Dimensionen mit Biplane FPALM6 oder anderen Techniken ermöglichen7-9und die hochauflösende Fluoreszenzbildgebung einzelner Moleküle in lebenden Zellen10-12. Die Lokalisationsmikroskopie wurde auch auf die Bildgebung mehrerer Spezies in fixierten Zellen angewendet13-16. Kürzlich wurden drei Proteinspezies gleichzeitig mit FPALM sowohl in fixierten als auch in lebenden Zellen abgebildet17. Die Lokalisationsmikroskopie kann Proben abbilden, die auf verschiedene Weise markiert wurden: Beispiele hierfür sind Proteine, die mit PAFP- oder PSFP-Fusionsmarkierungen exprimiert werden, Antikörper oder Moleküle, die mit eingeschlossenen organischen Farbstoffen markiert sind, oder herkömmliche organische Farbstoffe. Während die Verwendung herkömmlicher Fluoreszenzfarbstoffe die Markierung von Proteinen in Abwesenheit eines Fusionsprotein-Tags ermöglicht, erfordern die Bedingungen, die im Allgemeinen für die Verwendung von nicht käfiggebundenen organischen Farbstoffen in der hochauflösenden Bildgebung erforderlich sind, dass Proben in Reduktionspuffer getaucht werden.2. Darüber hinaus erfordert die intrazelluläre Verabreichung von Antikörper-Farbstoff-Konjugaten in der Regel, dass Zellen fixiert und ihre Membranen permeabilisiert werden. oder erfordert, dass lebende Zellen durch Elektroporation oder auf andere Weise durchlässig gemacht werden. Die Anforderungen an die Reduzierung der Pufferbedingungen und der Membranpermeabilisierung schränken die Eignung organischer Farbstoffe für die Bildgebung lebender Zellen ein, obwohl die jüngsten Entwicklungen einen effektiven Einsatz von HaloTags und FPALM zur Abbildung von Membranstrukturen ermöglicht haben18.
FPALM war die erste Lokalisationsmikroskopietechnik, die auf lebende Zellen angewendet wurde10. In lebenden Zellen kann FPALM nicht nur eine zeitabhängige räumliche Karte der Positionen markierter Moleküle liefern, sondern auch einzelne Moleküle über mehrere Frames verfolgen und molekulare Trajektorien über Zeitskalen von Millisekundenbestimmen 19. Somit bietet FPALM Zugang zu relativ kurzen Zeitskalen und nanoskaliger Auflösung.
Multicolor FPALM kann für eine Vielzahl verschiedener Sonden verwendet werden, einschließlich photoaktivierbarer Proteine und organischer oder nicht käfigartiger Farbstoffe. Im Folgenden stellen wir Ihnen das Protokoll und den Aufbau für die gleichzeitige Bildgebung von zwei fluoreszierenden Proteinspezies, Dendra2 und PAmCherry, vor. Wir berichten über die Ergebnisse der Bildgebung von PAmCherry, konjugiert mit Beta-Aktin (PAmCherry-Aktin) und Dendra2, konjugiert mit Influenza-Hämagglutinin (Dendra2-HA) in NIH-3T3-Fibroblasten. Die in der Einrichtung beschriebenen Komponenten können gegen andere Hardware ausgetauscht werden, die für die Abbildung anderer Sonden besser geeignet ist. Wo dies der Fall ist, haben wir versucht, im Text explizit zu sein.
Multicolor FPALM ist ideal für die Darstellung der räumlichen Verteilungen mehrerer Proteinspezies in lebenden oder fixierten Zellen. Diese Technik eignet sich besonders für die Untersuchung räumlicher und/oder dynamischer Beziehungen auf räumlichen Längenskalen von Nanometern, obwohl Bilder die Lokalisierung auf einer Reihe von Längenskalen von Dutzenden von Nanometern bis zu Dutzenden von Mikrometern berichten. Ein großer Vorteil von multicolor FPALM ist, dass der Aufbau relativ kostengünstig zu konstruieren und sehr flexibel für den Einsatz mit verschiedenen Sondenkombinationen ist. Der Prozess der Konstruktion und Kalibrierung des Systems aus Komponenten bietet auch ein beträchtliches Verständnis von Faktoren, die die Qualität und Interpretierbarkeit der Daten und damit das Forschungsergebnis beeinträchtigen können. Im Folgenden werden die Methoden für den optischen Aufbau, die Probenvorbereitung und die Datenerfassung mehrerer Proteinspezies mit PSFP- und PAFP-Fusionskonstrukten unter Verwendung von FPALM detailliert beschrieben. Während dieses Protokoll die Analyse fixierter Zellen beschreibt, sind diese Verfahren ohne weiteres auf die Bildgebung lebender Zellen anwendbar.
Der hier beschriebene optische Aufbau ist ideal für die gleichzeitige Abbildung des PSFP Dendra2 und des PAFP PAmCherry. Viele andere Sonden können für die mehrfarbige Bildgebung verwendet werden; Die genauen benötigten Komponenten können jedoch variieren, abhängig von den Anregungs- und Emissionsspektren der gewählten Sonden. Die Auswahl der dichroitischen Spiegel, Filter und Laserwellenlängen sollte auf der Grundlage dieser Überlegungen getroffen werden.

<table><tbody><tr><td>LabTek II Kammern</td><td>Nunc</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Fluoreszierende Kügelchen</td><td>Invitrogen</td><td>F-8801</td><td>Kügelchen zur Kalibrierung</td></tr><tr><td>Tetraspeck Kügelchen</td><td>Invitrogen</td><td>T-7279</td><td>Vierfarbige Kügelchen zur</td></tr><tr><td>Kalibrierung Objektiv-Immersionsöl</td><td>Zeiss</td><td>518F</td><td>Immersionsöl für Objektive mit hohem NA-Gehalt (abhängig von der Wahl des Objektivs)</td></tr><tr><td>HPLC-Wasser</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td> </td></tr><tr><td>Media</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>Or Cellgro 10-090</td></tr><tr><td>Antibiotika</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td> </td></tr><tr><td>Serum</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30087.03</td><td> </td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td>52887</td><td> </td></tr><tr><td>Optimem I</td><td>GIBCO</td><td>11058-021</td><td> </td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>MPBiomedicals</td><td></td><td> </td>1689149</tr> <tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA433689M</td><td>VORSICHT: Giftig</td></tr></tbody></table>

simultane multicolor-imaging biologischer strukturen mit fluoreszenzphotoaktivierung lokalisationsmikroskopie

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Lokalisierungsbasierte Superauflösungsmikroskopie kann angewendet werden, um eine räumliche Karte (Bild) der Verteilung einzelner fluoreszenzmarkierter einzelner Moleküle innerhalb einer Probe mit einer räumlichen Auflösung von Dutzenden von Nanometern zu erhalten. Unter Verwendung von photoaktivierbaren (PAFP) oder photoschaltbaren (PSFP) fluoreszierenden Proteinen, die mit Proteinen von Interesse fusioniert sind, oder organischen Farbstoffen, die an Antikörper oder andere Moleküle von Interesse konjugiert sind, kann die Fluoreszenz-Photoaktivierungslokalisierungsmikroskopie (FPALM) gleichzeitig mehrere Arten von Molekülen innerhalb einzelner Zellen abbilden. Mit dem folgenden Ansatz werden Populationen einer großen Anzahl (Tausende bis Hunderttausende) einzelner Moleküle in einzelnen Zellen abgebildet und mit einer Genauigkeit von ~10-30 nm lokalisiert. Die gewonnenen Daten können verwendet werden, um die räumliche Verteilung mehrerer Proteintypen auf der Nanoskala innerhalb einer Zelle zu verstehen. Ein Hauptvorteil dieser Technik ist die drastische Erhöhung der räumlichen Auflösung: Während die Beugung die Auflösung bei der herkömmlichen Lichtmikroskopie auf ~200-250 nm begrenzt, kann FPALM Längenskalen abbilden, die mehr als eine Größenordnung kleiner sind. Da viele biologische Hypothesen die räumlichen Beziehungen zwischen verschiedenen Biomolekülen betreffen, kann die verbesserte Auflösung von FPALM Einblicke in Fragen der zellulären Organisation geben, die der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie bisher nicht zugänglich waren. Neben der Beschreibung der Methoden zur Probenvorbereitung und Datenerfassung beschreiben wir hier den optischen Aufbau für FPALM. Ein weiterer Aspekt für Forscher, die hochauflösende Mikroskopie betreiben möchten, sind die Kosten: Eigeninstallationen sind deutlich billiger als die meisten kommerziell erhältlichen Bildgebungsgeräte. Zu den Einschränkungen dieser Technik gehören die Notwendigkeit, die Markierung von Molekülen von Interesse in Zellproben zu optimieren, und die Notwendigkeit einer Nachbearbeitungssoftware zur Visualisierung der Ergebnisse. Wir beschreiben hier die Verwendung der PAFP- und PSFP-Expression, um zwei Proteinspezies in fixierten Zellen abzubilden. Die Ausweitung der Technik auf lebende Zellen wird ebenfalls beschrieben.

Influenza-Hämagglutinin (HA) bildet Cluster in der Größenordnung von zehn Nanometern bis Mikrometern, und diese Cluster kolokalisieren variabel mit Aktin (Abbildung 5). Diese räumlichen Verteilungen bestätigen grobkörnige Aufnahmen dieser beiden Proteine28 sowie die Abhängigkeit der räumlichen Verteilung von HA von Aktin19. Multifarbige FPALM-Aufnahmen können weiterhin verwendet werden, um Dichte, Fläche und Umfang dieser Cluster sowie das Ausmaß der Kolokalisation zwischen den beid...

Wir demonstrieren die Verwendung von Fluoreszenz-Photoaktivierungs-Lokalisierungsmikroskopie (FPALM), um gleichzeitig mehrere Arten von fluoreszenzmarkierten Molekülen in Zellen abzubilden. Die beschriebenen Techniken ermöglichen die Lokalisierung von Tausenden bis Hunderttausenden einzelner fluoreszierend markierter Proteine mit einer Genauigkeit von Dutzenden von Nanometern innerhalb einzelner Zellen.

Simultane Multicolor-Imaging biologischer Strukturen mit Fluoreszenzphotoaktivierung Lokalisationsmikroskopie

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mehrere Proteinspezies gleichzeitig mit Nanometerpräzision in fixierten oder lebenden Zellen abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst die Position einer Kamera und der Optik angepasst wird, bis ein scharfes Bild vom Mikroskop auf den Kamerachip projiziert wird. Der zweite Schritt besteht darin, Laserstrahlen so anzuordnen, dass sie direkt auf eine Probe auf dem Mikroskoptisch ausgerichtet sind. Anschließend wird die vorbereitete Zellprobe beleuchtet und eine Zelle ausgewählt, die die gewünschten Proteine exprimiert. Der letzte Schritt besteht darin, die Zelle mittels Fluoreszenz-Photoaktivierungs-Lokalisierungsmikroskopie abzubilden, indem die Probe mit Lasern beleuchtet und die Zellfluoreszenz anschließend auf den Kamerachip gelenkt wird, um einen Datensatz zu erfassen. Letztlich kommt die Fluoreszenz-Photoaktivierungs-Lokalisierungsmikroskopie zum Einsatz, um die Lokalisation mehrerer Proteinspezies auf nanometrischer räumlicher Skala in fixierten oder lebenden Zellen darzustellen, und zwar entweder im Weitfeld oder unter Verwendung der Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie, um einen dünnen Bereich der Probe zu isolie

simultaneous-multicolor-imaging-biological-structures-with

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video beschreibt BiFC-PALM ― eine Kombination aus photoaktivierter Lokalisationsmikroskopie und bimolekularer Fluoreszenzkomplementierung ― zur Beurteilung von Protein-Protein-Wechselwirkungen. BiFC beinhaltet die Fusion von zwei fluoreszierenden Proteinfragmenten mit zwei interagierenden Proteinen von Interesse. Wenn die beiden Proteine interagieren, werden die Fragmente in die Nähe gebracht, wodurch die beiden Teile zusammenkommen und ein funktionsfähiges fluoreszierendes Protein...

Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementierungs-gekoppelte photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie

Komplexe Gewebemassen, von Organen, Tumoren, werden von verschiedenen zellulären Elementen. Wir erläutert den Beitrag von zellulären Phänotypen innerhalb eines Gewebes unter Verwendung von Multi-markierte Fluoreszenz-transgenen Mäusen in Kombination mit Multiimmunfluoreszenzfärbung gefolgt von Entmischung, den Zellursprung sowie Zelleigenschaften auf der Basis der Proteinexpression zu entschlüsseln.

Quantitative Multispektrale Fluoreszenz-Analyse Nach Gewebetransplantation zur Visualisierung von Zell Origins, Typen und Wechselwirkungen

Dual-Kamera-Emissionsspaltanlagen für zwei-Farben-Fluoreszenz-Mikroskopie erzeugen Echtzeit-Bildsequenzen mit außergewöhnlichen optischen und zeitlichen Auflösung, einem Bedarf von lebenden Zellassays einschließlich Parallelplattenlaufkammer Adhäsions-Assays. Als Software wird verwendet, um Bilder von gleichzeitig erworben Emissionskanäle verschmelzen, pseudocolored Bildsequenzen produziert.

Gleichzeitig Capturing in Echtzeit Bilder in zwei Emissions Kanäle unter Verwendung eines Dual-Kamera-Emissions-Splitting-System: Anwendungen in der Zelladhäsion

Protein-Wechselwirkungen werden in Zellen mit räumlicher Auflösung im Nanometerbereich visualisiert, indem die bimolekulare Fluoreszenzkomplemmentierung (BiFC) mit der photoaktivierten Lokalisationsmikroskopie (PALM) kombiniert wird. Beschrieben wird hier die Verwendung von BiFC-PALM zur Abbildung von Ras-Raf-Wechselwirkungen in U2OS-Zellen zur Visualisierung des nanoskaligen Clusterings und der Diffusion einzelner Ras-Raf-Komplexe.

Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie mit Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BIFC-PALM)

Wir zeigen eine Methode, um mehrere Moleküle innerhalb heterogener Nanostrukturen bei Einzelmolekülgenauigkeit unter Verwendung sequentieller Bindung und Elution von fluoreszenzmarkierten Antikörpern abzubilden.

Hochmultiplexed, Super-Auflösung Bildgebung von T-Zellen mit madSTORM

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die multi-Color Lokalisierung der einzelnen Membranproteine in Organellen der lebenden Zellen. Um Fluorophore zu befestigen, sind selbst Kennzeichnung Proteine verwendet. Proteine, befindet sich in verschiedenen Membranen Kompartimenten des die gleichen Organellen lokalisiert werden können, mit einer Genauigkeit von ~ 18 nm.

Multi-Color-Lokalisierung Mikroskopie des einzigen Membranproteine in Organellen der lebenden Säugetier-Zellen

Hier präsentieren wir Ihnen eine praktische Anleitung für eine integrierte Mikroskopie Bausystem, das konventionelle Epi-fluoreszierende Bildgebung, Einzelmolekül-Erkennung-basierte Höchstauflösung Bildgebung und Multi-Color Einzelmolekül-Erkennung übergeht, einschließlich Einzelmolekül-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer imaging, in einer Aufspannung auf kostengünstige Weise.

Durchführung von mehreren Imaging-Modi mit einem Fluoreszenzmikroskop

Wir beschreiben eine schnelle Färbemethode zur multispektralen Bildgebung an gefrorenen Geweben.

Eine schnelle Methode zur multispektralen Fluoreszenz-Bildgebung von tiefgefrorenen Gewebeabschnitten

Wir stellen ein Protokoll zur Implementierung der Interferenzreflexionsmikroskopie und der Total-Interreflexions-Fluoreszenzmikroskopie für die gleichzeitige Abbildung von dynamischen Mikrotubuli und fluoreszenzmarkierten Mikrotubuli-assoziierten Proteinen vor.

Simultane Interferenzreflexion und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie zur Abbildung dynamischer Mikrotubuli und assoziierter Proteine

Dieses Protokoll enthält eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die simultane markierungsfreie Autofluoreszenz-Multiharmonische (SLAM)-Mikroskopietechnik, einschließlich Details zur Erzeugung der Laserlichtquelle, zur Vorbereitung einer Gewebeprobe, zur Durchführung der Bildgebung und zur Analyse der Daten. SLAM entwickelt die nichtlineare Mikroskopie weiter, indem es vier komplementäre markierungsfreie Kontraste misst, um die Mikroumgebung des Gewebes zu untersuchen.

Simultane markierungsfreie Autofluoreszenz-Multi-Harmonic-Mikroskopie

Dieses Protokoll bietet einen effizienten Arbeitsablauf für die mikroskopische Mikroskopieabbildung isolierter Arabidopsis-Kerne durch optimierte Isolierung, Fixierung und Markierung, um eine zuverlässige nanoskalige Visualisierung von Chromatin und RNA-Polymerase II zu erreichen. Dieser Ansatz kann leicht an andere chromatinassoziierte Proteine oder Histonmodifikationen für hochauflösende Bildgebung angepasst werden.

Ein stromlinienförmiges Protokoll für Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie in Arabidopsis-Kernen

Erfahren Sie die Fluoreszenzphotoaktivierungs-Lokalisationsmikroskopie (FPALM) zur hochaufgelösten Bildgebung mehrerer Proteinspezies in Zellen. Diese Methode ermöglicht Nanometer-präzise Lokalisation in fixierten und lebenden Zellen.

Simultane Multicolor-Imaging biologischer Strukturen mit Fluoreszenzphotoaktivierung Lokalisationsmikroskopie

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