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La tinción de Gram permite una visualización rápida de la morfología bacteriana y una amplia distinción celular a partir de una amplia gama de muestras ambientales. Para teñir las bacterias, se aplica una mancha uniforme en un lado del vidrio y se deja secar. Después de fijar con calor la mancha, se aplica el cristal violeta.
Un agente decolorante enjuaga el cristal violeta de las células Gram-negativas, pero no de las células Gram-positivas. Un segundo colorante, generalmente safranina, se utiliza como tinción de fondo para visualizar las células gramnegativas. Una vez teñidas, se puede evaluar la morfología, el tamaño y la disposición de las células, como cadenas o grupos.
Este video demostrará cómo preparar una muestra ambiental, aislar las especies bacterianas que se encuentran en ella y realizar una tinción de Gram en las colonias aisladas
. La
tinción de Gram permite la categorización de la mayoría de las bacterias en dos grandes clases estructurales: Gram-positivas y Gram-negativas. Si bien ambas clases tienen una membrana plasmática de fosfolípidos subyacente, la estructura de la pared celular varía mucho. La pared celular grampositiva está compuesta principalmente por una capa gruesa de peptidoglicano, que es un polímero que consta de azúcares y aminoácidos. Las paredes celulares gramnegativas tienen una capa más delgada de peptidoglicano, intercalada entre una segunda membrana lipídica. Esta membrana externa suele contener lipopolisacáridos.
El cristal violeta cargado positivamente se une débilmente a la pared celular bacteriana cargada negativamente. El yodo de Gram forma un complejo insoluble con el tinte violeta cristalino, fijándolo así en la pared celular.
Durante la etapa de decoloración, el peptidoglicano en las células Gram-positivas se deshidrata, lo que hace que se contraiga y atrape los complejos de yodo violeta cristalino. En las células Gram-negativas, el agente decolorante compromete la membrana externa, aumentando su porosidad. Esto permite que los complejos cristalinos de violeta-yodo se laven.
Ahora que comprende los principios detrás de la tinción de Gram para las bacterias del suelo, veamos el proceso que se realiza en las bacterias del suelo en el laboratorio.
Después de recolectar una muestra de suelo en el campo, llévela al laboratorio para su análisis. Refinar la muestra con un tamiz y pesar 10 g de la tierra tamizada utilizando una balanza analítica.
Diluya la muestra en 95 mL de solución salina tamponada con fosfato y vórtice para mezclar. Realice de 1 a 10 diluciones adicionales, vórtice entre cada dilución. Transfiera alícuotas de al menos 3 diluciones sucesivas, a placas de agarosa replicadas de bajo contenido en nutrientes.
Después de la esterilización con llama de etanol y el enfriamiento de una varilla de vidrio doblada golpeando el medio, extienda la muestra sobre la superficie de las placas. Incuba las placas a temperatura ambiente. Después de incubar durante 3 a 5 días, seleccione la dilución más alta con 30 a 300 colonias discretas. Con un circuito de inoculación estéril, seleccione las colonias de interés para el aislamiento.
Coloque la colonia en una sección de un plato fresco. Esterilizando el bucle entre rayas, haga rayas sucesivas en un patrón en zig-zag en cada sección de la placa para permitir el aislamiento posterior de colonias individuales discretas. Incubar las placas durante 1 o 2 días a temperatura ambiente.
Para comenzar la preparación de frotis bacterianos, coloque un clip en un portaobjetos de vidrio previamente limpiado para facilitar su manejo. Para cada frotis bacteriano, limpie y esterilice con llama un asa de inoculación. Coloque 2 bucles de agua destilada estéril en el centro del portaobjetos.
Después de esterilizar el asa nuevamente, retire una pequeña cantidad de cultivo de una colonia aislada y mezcle con el agua en el portaobjetos. Es importante enfriar el bucle antes de tocar el cultivo golpeando varias veces una porción de agar no inoculada. El frotis debe parecerse a la leche diluida. Deje que el portaobjetos se seque a temperatura ambiente. Después del secado, fije el frotis con calor pasándolo rápidamente a través de una llama.
Una vez seco, pipetee crystal violet sobre el frotis y déjelo reposar durante 2 a 3 min. Enjuague cuidadosamente el portaobjetos con agua destilada dirigiendo el flujo directo hacia la parte superior del portaobjetos, permitiendo que el agua fluya suavemente hacia abajo. No apunte el flujo de agua directamente a la mancha.
Cubre el portaobjetos con yodo de Gram. Después de 2 minutos, enjuague suavemente con agua destilada. Decolora el portaobjetos con etanol al 95% hasta que la mancha ya no se lave. Enjuague inmediatamente con agua destilada. Esto limitará la decoloración excesiva de la mancha.
Añadir safranina como contratinción al frotis durante 30 s. Esto teñirá cualquier célula Gram-negativa presente. Enjuague suavemente con agua destilada y seque con papel absorbente. Observe el portaobjetos resultante con un microscopio. Utilice primero un objetivo de baja potencia para hacer ajustes gruesos y encontrar una porción ideal del frotis antes de pasar al campo de visión más pequeño de los aumentos más altos.
Después de obtener más imágenes y ajustar el frotis con un objetivo de potencia media, agregue aceite de inmersión directamente al frotis. El aceite es necesario para objetivos de alta potencia que proporcionarán las mejores micrografías. Las bacterias grampositivas aparecerán de color azul o morado, mientras que las células gramnegativas serán rojas o rosadas. Además de la estructura de la pared celular, la forma y la disposición se dilucidan a partir de las micrografías resultantes.
La capacidad de la tinción de Gram para estudiar cualitativamente las bacterias es importante para una amplia gama de campos científicos.
El suelo es solo una de las fuentes ambientales a partir de las cuales se pueden aislar y analizar las bacterias. Para el agua potable, la preparación de la muestra debe modificarse. Las muestras de agua del grifo se pueden extraer de un grifo y colocar en un medio de crecimiento que facilita el crecimiento de diversas colonias bacterianas heterótrofas. Al enchapar en un medio como el R2A, el proceso es casi idéntico al procedimiento del suelo.
Para ciertas técnicas de identificación bacteriana, los parámetros dependen del tipo de pared celular de las bacterias de interés. En este ejemplo, se analizó la sangre de un paciente séptico y se descubrió que albergaba bacterias Gram-positivas.
Con esta información, se eligieron sondas de ácido nucleico peptídico específicas de la especie que se unirían al ARNr de las células. Estas sondas estaban unidas a tintes fluorescentes que se utilizaban para identificar las especies presentes.
Debido a las diferencias fundamentales en la estructura celular Gram-positiva y -negativa, las bacterias tienen respuestas únicas a otros compuestos además del violeta cristalino. Este experimento buscó aislar Clostridium difficile, una bacteria Gram-positiva, a partir de muestras fecales. La cicloserina, que inhibe el crecimiento de las células Gram-negativas, se añadió a la placa de agar. Las células Gram-positivas que crecieron en la placa se aislaron aún más mediante otros métodos.
Acaba de ver la introducción de JoVE a la tinción de Gram para estudios ambientales. Ahora debe comprender los beneficios del proceso y cómo realizar la técnica y utilizar los resultados. ¡Gracias por mirar!
