A principios del siglo XX, un bacteriólogo británico llamado Frederick Griffith trabajaba con la bacteria causante de la neumonía, Streptococcus pneumoniae. Realizó un experimento sencillo utilizando dos cepas diferentes. Una cepa se conoce como cepa S debido a una cápsula protectora que hace que las colonias o grupos que forma parezcan lisas, y también la hace virulenta o dañina. La segunda fue la cepa R, una versión de la bacteria que carece de la cápsula protectora, lo que le da a las colonias una apariencia áspera y las hace no virulentas.
Primero, Griffith tomó algunas de las bacterias de la cepa S y las calentó, produciendo una versión muerta por calor de la cepa S. Luego, reunió algunos ratones y los dividió en cuatro grupos. Inyectó al primer grupo la cepa virulenta S y al segundo la cepa R no virulenta. Dosificó el tercer grupo con la cepa S muerta por calor y, finalmente, combinó la cepa S y la cepa R muertas por calor, e inyectó esta mezcla en el cuarto grupo. Como era de esperar, los ratones del primer grupo murieron, y los del segundo y tercer grupo sobrevivieron. Pero para sorpresa de Griffith, los ratones del último grupo también murieron.
Cuando publicó su estudio en 1928, llamó a este misterioso proceso transformación, ya que especuló con la presencia de un principio transformador subyacente, que permitía que la cepa previamente no virulenta se volviera mortal. Más tarde, en 1943, Avert, MacLeod y McCarty informaron que este principio transformador era probablemente el ácido desoxirribonucleico, o ADN, que ahora sabemos que es el material hereditario. Esencialmente, lo que sucedió en el experimento de Griffith fue que cuando se combinaron las bacterias, parte del ADN se filtró de la cepa S muerta por calor a las células de la cepa R, transformando estas bacterias no virulentas y transmitiendo la información para hacer la cápsula protectora, convirtiendo la cepa R en una virulenta, ahora capaz de matar a los animales del cuarto grupo.
Hoy en día, los científicos han desarrollado una forma mucho más sencilla de estudiar la transformación bacteriana, utilizando la bacteria E. coli y pequeños bucles circulares de ADN llamados plásmidos. Por lo general, el plásmido utilizado en los experimentos de transformación incluye un gen para una función especial, como la resistencia a los antibióticos. Las E. coli son un excelente sujeto para la transformación porque pueden mostrar una propiedad llamada competencia, la capacidad de absorber ADN del medio ambiente. Esencialmente, esto significa que bajo ciertas condiciones ambientales, como un producto químico o un choque eléctrico o de calor, la pared celular de E. coli puede volverse temporalmente permeable y permitir la absorción de ADN del medio ambiente. Una vez que el plásmido está dentro de la E. coli, puede permanecer en el citoplasma de su nueva célula huésped y replicarse y expresarse a lo largo de generaciones junto con el genoma, o puede incorporarse completamente al genoma del huésped. Si las bacterias pierden el plásmido en algún punto, la célula también perderá su resistencia a los antibióticos, por lo que los científicos cultivan las bacterias en un medio que contiene el antibiótico para asegurarse de que los únicos supervivientes sean los que contienen el plásmido de interés.
En este laboratorio, aprenderá a transformar células de E. coli con un plásmido que contiene un gen de resistencia a antibióticos, mientras practica técnicas microbiológicas estériles.
Fondo
A principios del sigloXX, la neumonía era responsable de una gran parte de las muertes por enfermedadesinfecciosas. Con el fin de desarrollar una vacuna eficaz contra la neumonía, Frederick Griffith se propuso estudiar dos cepas diferentes de Streptococcus pneumoniae: una cepa no virulenta con un aspecto rugoso (cepa R) y una cepa virulenta con un aspecto liso (cepa S) debido a una cápsula exterior de polisacáridos2. Esta capa externa de la bacteria de la cepa S les permitió resistir el sistema inmunológico del huésped, lo que finalmente condujo a una enfermedad potencialmente mortal. Cuando Griffith inyectó por separado a los ratones bacterias muertas por calor de cualquiera de las cepas, los ratones sobrevivieron. Sin embargo, cuando inyectó a los ratones una combinación de la cepa S muerta por calor con una cepa R viva, los ratones murieron2. Cuando analizó las muestras obtenidas de ratones muertos inyectados con la combinación, observó la presencia de bacterias vivas de la cepa S. En 1928, Griffith señaló que debía haber ocurrido un proceso de "transformación" para cambiar las bacterias no virulentas en la cepa virulenta. Como el primer descubrimiento conocido de la transformación bacteriana, su descubrimiento allanó el camino para el desarrollo de una herramienta esencial en la ingeniería genética: la transformación3.
La transformación es el cambio genético en una célula debido a la ingesta de ADN del medio ambiente. En el experimento de Griffith, el ADN que codifica la capa protectora de polisacáridos de la bacteria de la cepa S no se descompuso por el choque térmico y se introdujo en la cepa R, lo que permitió a esta última eludir el sistema inmunológico del ratón. Si bien este proceso ocurre constantemente en la naturaleza entre organismos e incluso diferentes especies, los científicos transforman las bacterias en entornos de laboratorio con fines de investigación4.
Transformación bacteriana mediante plásmidos
Las bacterias son los organismos ideales para la transformación, ya que pueden absorber fácilmente material genético exógeno en su genoma y amplificarlo rápidamente3,5. Tienen un cromosoma circular y múltiples pequeñas piezas circulares de ADN bicatenario llamadas plásmidos dentro del citoplasma. Estos plásmidos pueden replicarse independientemente del ADN cromosómico y, en general, proporcionan ciertos beneficios funcionales, como la resistencia a los antibióticos6,7. En su entorno natural, las bacterias experimentan una "transformación bacteriana" al absorber plásmidos de otras bacterias en un proceso llamado conjugación8. Además, cuando se multiplican, cada uno de sus descendientes recibe una copia del nuevo plásmido.
Los plásmidos que se utilizan con fines experimentales se denominan vectores plásmidos. En un entorno de laboratorio, los científicos pueden crear artificialmente "plásmidos recombinantes" de aproximadamente 5.000 a 10.000 pares de bases de longitud insertando fragmentos de ADN en un vector de plásmido. Estos plásmidos recombinantes suelen tener ciertos componentes: un origen de replicación (ORI), un gen de resistencia a antibióticos, un sitio de clonación múltiple, un promotor, un marcador de selección y el gen de interés. El origen de la replicación es donde comienza la replicación. El gen de resistencia a los antibióticos permite que las bacterias que absorben el plásmido sobrevivan en las placas en presencia de un determinado medicamento antibiótico. Aunque los plásmidos son fragmentos relativamente pequeños de ADN, los científicos necesitan tratar las células huésped para permitir la penetración del plásmido a través de la membrana celular. Por lo tanto, la eficiencia de la transformación está directamente relacionada con la porosidad de la membrana huésped. Un enfoque común es el choque térmico de las bacterias que han sido tratadas con una solución de cloruro de calcio9. Las bacterias que no incorporan el plásmido no se transforman, y por lo tanto no tienen resistencia para sobrevivir en la placa y ser visibles. Los múltiples sitios de clonación ayudan en la inserción de ADN al contener sitios para que las enzimas de restricción corten el plásmido donde se puede insertar y ligar el gen de interés. El promotor impulsa la transcripción del gen de interés. Está marcado por un marcador, generalmente una proteína fluorescente como una proteína fluorescente verde (GFP), o puede ser un gen adicional de resistencia a los antibióticos. El gen de resistencia a los antibióticos y los otros marcadores de selección nos ayudan a determinar si las bacterias recolectadas contienen el plásmido de interés.
Aplicaciones
Los métodos de transformación eficaces permitieron a los científicos aislar y perfilar genes y productos genéticos, y condujeron a muchos avances en las ciencias de la vida y la medicina, como el desarrollo de fármacos eficaces, la generación de cultivos modificados genéticamente y herramientas de diagnóstico avanzadas10. Además, con los avances tecnológicos, han surgido nuevos métodos de transformación. Por ejemplo, la clonación de puerta de enlace permite la inserción de múltiples fragmentos de ADN en diferentes vectores, así como la transferencia de secuencias de ADN entre plásmidos11. Además, las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR)-Cas9 son una técnica de edición génica que modifica directamente los nucleótidos del genoma y no requiere el uso de plásmidos12. Después de la transformación, los investigadores a menudo aíslan y perfilan el gen de interés y sus productos. Posteriormente, todo el proceso de clonación genética ha abierto un nuevo campo de manipulación genética. Gracias a la clonación genética, los investigadores pueden manipular las bacterias para producir grandes cantidades de proteínas humanas específicas, como la insulina para tratara los pacientes con diabetes. La clonación también ha tenido una gran importancia en la agricultura moderna. Los organismos genéticamente modificados (OGM) son el resultado directo de la clonación genética y la transformación bacteriana10. Por ejemplo, los científicos están trabajando para generar cultivos genéticamente modificados con genes fijadores de nitrógeno incorporados en su genoma para impulsar la producción de alimentos y reducir el uso de fertilizantes, disminuyendo así el impacto económico y ambiental de los fertilizantes. En resumen, la transformación bacteriana es el primer paso de la biotecnología moderna y la base de futuros descubrimientos de investigación.
Referencias
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- F, Griffith. La importancia de los tipos neumocócicos. J Hyg (Londres). . 1928, 2 (113-59).
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A principios del siglo XX, un bacteriólogo británico llamado Frederick Griffith trabajaba con la bacteria causante de la neumonía, Streptococcus pneumoniae. Realizó un experimento sencillo utilizando dos cepas diferentes. Una cepa se conoce como cepa S debido a una cápsula protectora que hace que las colonias o grupos que forma parezcan lisas, y también la hace virulenta o dañina. La segunda fue la cepa R, una versión de la bacteria que carece de la cápsula protectora, lo que le da a las colonias una apariencia áspera y las hace no virulentas.
Primero, Griffith tomó algunas de las bacterias de la cepa S y las calentó, produciendo una versión muerta por calor de la cepa S. Luego, reunió algunos ratones y los dividió en cuatro grupos. Inyectó al primer grupo la cepa virulenta S y al segundo la cepa R no virulenta. Dosificó el tercer grupo con la cepa S muerta por calor y, finalmente, combinó la cepa S y la cepa R muertas por calor, e inyectó esta mezcla en el cuarto grupo. Como era de esperar, los ratones del primer grupo murieron, y los del segundo y tercer grupo sobrevivieron. Pero para sorpresa de Griffith, los ratones del último grupo también murieron.
Cuando publicó su estudio en 1928, llamó a este misterioso proceso transformación, ya que especuló con la presencia de un principio transformador subyacente, que permitía que la cepa previamente no virulenta se volviera mortal. Más tarde, en 1943, Avert, MacLeod y McCarty informaron que este principio transformador era probablemente el ácido desoxirribonucleico, o ADN, que ahora sabemos que es el material hereditario. Esencialmente, lo que sucedió en el experimento de Griffith fue que cuando se combinaron las bacterias, parte del ADN se filtró de la cepa S muerta por calor a las células de la cepa R, transformando estas bacterias no virulentas y transmitiendo la información para hacer la cápsula protectora, convirtiendo la cepa R en una virulenta, ahora capaz de matar a los animales del cuarto grupo.
Hoy en día, los científicos han desarrollado una forma mucho más sencilla de estudiar la transformación bacteriana, utilizando la bacteria E. coli y pequeños bucles circulares de ADN llamados plásmidos. Por lo general, el plásmido utilizado en los experimentos de transformación incluye un gen para una función especial, como la resistencia a los antibióticos. Las E. coli son un excelente sujeto para la transformación porque pueden mostrar una propiedad llamada competencia, la capacidad de absorber ADN del medio ambiente. Esencialmente, esto significa que bajo ciertas condiciones ambientales, como un producto químico o un choque eléctrico o de calor, la pared celular de E. coli puede volverse temporalmente permeable y permitir la absorción de ADN del medio ambiente. Una vez que el plásmido está dentro de la E. coli, puede permanecer en el citoplasma de su nueva célula huésped y replicarse y expresarse a lo largo de generaciones junto con el genoma, o puede incorporarse completamente al genoma del huésped. Si las bacterias pierden el plásmido en algún punto, la célula también perderá su resistencia a los antibióticos, por lo que los científicos cultivan las bacterias en un medio que contiene el antibiótico para asegurarse de que los únicos supervivientes sean los que contienen el plásmido de interés.
En este laboratorio, aprenderá a transformar células de E. coli con un plásmido que contiene un gen de resistencia a antibióticos, mientras practica técnicas microbiológicas estériles.
A principios del siglo XX, un bacteriólogo británico llamado Frederick Griffith trabajaba con la bacteria causante de la neumonía, Streptococcus pneumoniae. Realizó un experimento sencillo utilizando dos cepas diferentes. Una cepa se conoce como cepa S debido a una cápsula protectora que hace que las colonias o grupos que forma parezcan lisas, y también la hace virulenta o dañina. La segunda fue la cepa R, una versión de la bacteria que carece de la cápsula protectora, lo que le da a las colonias una apariencia áspera y las hace no virulentas.
Primero, Griffith tomó algunas de las bacterias de la cepa S y las calentó, produciendo una versión muerta por calor de la cepa S. Luego, reunió algunos ratones y los dividió en cuatro grupos. Inyectó al primer grupo la cepa virulenta S y al segundo la cepa R no virulenta. Dosificó el tercer grupo con la cepa S muerta por calor y, finalmente, combinó la cepa S y la cepa R muertas por calor, e inyectó esta mezcla en el cuarto grupo. Como era de esperar, los ratones del primer grupo murieron, y los del segundo y tercer grupo sobrevivieron. Pero para sorpresa de Griffith, los ratones del último grupo también murieron.
Cuando publicó su estudio en 1928, llamó a este misterioso proceso transformación, ya que especuló con la presencia de un principio transformador subyacente, que permitía que la cepa previamente no virulenta se volviera mortal. Más tarde, en 1943, Avert, MacLeod y McCarty informaron que este principio transformador era probablemente el ácido desoxirribonucleico, o ADN, que ahora sabemos que es el material hereditario. Esencialmente, lo que sucedió en el experimento de Griffith fue que cuando se combinaron las bacterias, parte del ADN se filtró de la cepa S muerta por calor a las células de la cepa R, transformando estas bacterias no virulentas y transmitiendo la información para hacer la cápsula protectora, convirtiendo la cepa R en una virulenta, ahora capaz de matar a los animales del cuarto grupo.
Hoy en día, los científicos han desarrollado una forma mucho más sencilla de estudiar la transformación bacteriana, utilizando la bacteria E. coli y pequeños bucles circulares de ADN llamados plásmidos. Por lo general, el plásmido utilizado en los experimentos de transformación incluye un gen para una función especial, como la resistencia a los antibióticos. Las E. coli son un excelente sujeto para la transformación porque pueden mostrar una propiedad llamada competencia, la capacidad de absorber ADN del medio ambiente. Esencialmente, esto significa que bajo ciertas condiciones ambientales, como un producto químico o un choque eléctrico o de calor, la pared celular de E. coli puede volverse temporalmente permeable y permitir la absorción de ADN del medio ambiente. Una vez que el plásmido está dentro de la E. coli, puede permanecer en el citoplasma de su nueva célula huésped y replicarse y expresarse a lo largo de generaciones junto con el genoma, o puede incorporarse completamente al genoma del huésped. Si las bacterias pierden el plásmido en algún punto, la célula también perderá su resistencia a los antibióticos, por lo que los científicos cultivan las bacterias en un medio que contiene el antibiótico para asegurarse de que los únicos supervivientes sean los que contienen el plásmido de interés.
En este laboratorio, aprenderá a transformar células de E. coli con un plásmido que contiene un gen de resistencia a antibióticos, mientras practica técnicas microbiológicas estériles.
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