L’essai CApillary FEeder (CAFE) : Une méthode pour suivre la consommation alimentaire et la préférence à Drosophila

Overview

Cette vidéo décrit le CApillary FEeder, ou CAFE, analyse, une méthode comportementale qui mesure l’apport alimentaire et la préférence des mouches des fruits non retenues. Le protocole en vedette montre comment effectuer l’analyse avec une évaporation minimale des capillaires remplis de liquide utilisés pour livrer la nourriture et suivre son apport.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Diegelmann et coll., The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

1. Assemblage et exécution de l’essai CApillary FEeder

1. Si le jeûne n’est pas nécessaire, transférez les mouches expérimentales à l’essai en tapant ou par pipe à pipe. Assurez-vous d’inclure trois flacons de commande sans mouches pour quantifier l’évaporation.
2. Retirez soigneusement une pointe de pipette (volume de 2 à 20 μL) qui ferme l’une des ouvertures extérieures et insérez d’abord un capillaire en verre rempli. Fixez le capillaire en plaçant la pointe de la pipette à côté du capillaire. Si plusieurs solutions alimentaires sont testées, répétez cette procédure en conséquence.
3. Placer les extrémités capillaires à l’intérieur de tous les flacons au même niveau pour éviter les biais qui pourraient se produire si les sources de nourriture étaient situées à des hauteurs différentes (3 à 4 cm du couvercle); garder une distance avec le papier filtre pour empêcher le capillaire de fuir en touchant accidents le papier filtre ou différentes viscosités des sources alimentaires.
4. Étiquetez l’extrémité supérieure du liquide coloré à l’aide d’un stylo marqueur (début_{de marque).} Pour s’assurer que les différents capillaires peuvent être identifiés, étiquetez-les individuellement à l’aide d’un code couleur ou rayé.
5. Placez plusieurs essais CAFE préparés à l’intérieur d’une boîte en plastique avec incrustation quadrillée et transférez la boîte (figure 2A) à une position sûre dans des conditions de laboratoire ou dans une chambre climatique à température, lumière et humidité contrôlée (paramètres : 25 °C, humidité relative de 60 %, cycle clair-obscurité de 12 h/12 h) pour la période expérimentale (p.ex. 3 h ou jours).
6. Comme le papier filtre inférieur sèche si l’analyse est effectuée sur plusieurs jours, appliquer de l’eau douce toutes les 24 h par l’intermédiaire de l’éponge bung (100 μL) pour garder l’humidité constante à l’intérieur de l’essai. Utilisez quatre flacons séparés (hauteur de 8 cm, diamètre de 3,3 cm) remplis de 30 mL ddH₂O comme dispositifs d’humidité et placez-les à côté des analyses CAFE dans la boîte en plastique. Utilisez un couvercle pour la boîte en plastique pour créer un environnement contrôlé par l’humidité pendant l’expérience( Figure 2A).
   REMARQUE: Une variabilité plus large se produit dans des conditions de laboratoire; toutefois, il est possible d’effectuer l’essai CAFE à température ambiante(p. ex.,dans une salle de classe). L’utilisation d’un dispositif d’humidification (papier filtre, avec ou sans bouse d’éponge humide, flacons d’eau remplis et couvercle pour la boîte en plastique) est fortement encouragée à diminuer l’évaporation (figure 2B).
7. Remplacez les capillaires par des capillaires fraîchement remplis pour des expériences à long terme toutes les 24 h. Notez les mouches mortes avant chaque intervalle de 24 heures et utilisez le nombre de mouches vivantes pour calculer la consommation par mouche pour la période suivante. Jeter les anciens capillaires après avoir mesuré le déclin du ménisque (voir 2.1).
   REMARQUE: Au cours d’une expérience de 3 h, nous ne voyons guère de mouches mortes. Au cours d’une étude de 4 jours, nous trouvons habituellement 1 à 3 mouches mortes.
8. À la fin de l’essai ou avant de remplacer le capillaire, marquer le ménisque inférieur du capillaire (extrémité de_marque)avec un stylo marqueur tandis que l’essai CAFE est toujours en position verticale. Jetez les données si l’extrémité_{de la marque} n’est pas inférieure à la marque initiale (début de la_marque). N’enlevez pas le couvercle, car cela pourrait changer le ménisque.
9. Retirez soigneusement les capillaires de l’analyse et rangez-les pour la collecte de données. Vérifiez si le liquide à l’intérieur du capillaire a atteint l’extrémité inférieure sinon jeter les données, car la nourriture n’était pas accessible aux mouches. Recueillir tous les capillaires par flacon en groupe. Insérez des pointes de pipette non coupées dans toutes les ouvertures pour empêcher les mouches de s’échapper. Démonter l’installation et laver les flacons, couvercles et bouses d’éponge dans un bain de savon et sécher toute la nuit à température ambiante pour une utilisation plus appropriée.
   REMARQUE: Les mouches peuvent être analysées plus avant après l’essai. Confirmer l’absorption des aliments par les yeux ou au microscope à dissection.
10. Répétez des expériences avec les mêmes génotypes sur au moins trois jours différents.

2. Collecte et analyse de données

1. Mesurez la distance entre le début de_{la marque et} la fin de la_marque sur le capillaire à l’aide d’un étrier ou d’une règle. Pour transférer des données directement sur une feuille de calcul, utilisez un étrier numérique connecté USB (Universal Serial Bus)(figure 1E). Jeter les capillaires après la mesure.
2. Tenir compte de la taille capillaire pour calculer l’absorption ou l’évaporation des aliments. Par exemple, considérez un capillaire de 73 mm de long qui contient 5 μL de solution alimentaire. Une diminution de 14,6 mm du ménisque reflète l’absorption de la solution 1 μL. Calculez l’absorption des aliments à l’aide de la formule suivante :
   Absorption des aliments (μL) = distance mesurée (mm)/ 14,6 mm
3. Pour exclure l’effet de l’évaporation sur l’apport alimentaire, calculer l’évaporation moyenne dans les trois flacons de contrôle (au minimum) sans mouches. Soustrayez cette valeur moyenne de la valeur obtenue pour la consommation alimentaire par les mouches.
4. Utilisez la formule suivante pour déterminer la consommation totale par mouche :
   Consommation alimentaire (μL) = (Absorption alimentaire [μL] - Perte d’évaporation [μL])/nombre total de mouches dans le flacon. Pour les expériences à long terme, utilisez le nombre de mouches vivantes avant le début de l’intervalle de 24 h.
5. Pour tenir compte des différences dans la taille du corps, comme entre les mouches mâles et femelles, normalisez la consommation alimentaire au poids corporel (mouche de nourriture/mg de μL).
6. Utilisez un logiciel statistique pour l’analyse des données. Pour les données normalement distribuées, utilisez les tests T de l’élèvepour déterminer les différences entre deux groupes de mouches et utilisez ANOVA (analyse de la variance) avec des tests Tukey Cramer post-hoc pour plus de deux groupes. Dans une situation de choix, analyser les différences par rapport au choix aléatoire à l’aide d’un test de signe non paramétrique d’un échantillon.

Representative Results

Figure 1 : L’essai Drosophila melanogaster CApillary FEeder. A) L’analyse d’alimentation avec des mouches. Le papier filtre humidifié fournit de l’eau au fond du flacon. Quatre capillaires sont fournis pendant l’expérience (nourriture de couleur rouge et bleue dans des capillaires opposés). Notez que les capillaires sont fixés en position par une deuxième pointe de pipette, et les positions inutilisées sont fermées à l’aide de pointes de pipette. Une prise en mousse au centre du couvercle permet l’échange d’air. B) Vue détaillée du couvercle. Des pointes de pipette coupées (2 - 20 μL, bordures rouges) sont insérées dans les ouvertures coniques des positions inutilisées, et une deuxième pointe de pipette est insérée dans la pointe de coupe pour fermer le trou. Les pointes de pipette coupées sont utilisées pour contrôler le placement des microcapillaires, et des bouts non coupés sont utilisés pour maintenir les capillaires serrés. C) Une mouche D. melanogaster se nourrit d’un capillaire. D) Après l’alimentation, la couleur des aliments est clairement visible dans l’abdomen de la mouche. E) Un étrier numérique est utilisé pour mesurer la distance entre le début de_{la marque} et la_fin de la marque du ménisque. Les données sont transférées directement sur une feuille de calcul Excel via USB. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Influence de l’évaporation dans l’essai de la mangeoire capillaire. A) Essai multiple de CAFE placé à l’intérieur d’une boîte en plastique avec une incrustation quadrillée. Pour contrôler l’humidité pendant l’expérience, quatre flacons remplis d’eau (jantes rouges) sont placés à l’intérieur de la grille. Les commandes d’évaporation sont placées à proximité directe de ces flacons. Une couverture pour l’ensemble de la configuration est affichée en arrière-plan. B) Comparaison de la perte de volume par évaporation. La valeur moyenne de l’évaporation sur 4 jours est indiquée. L’humidité est contrôlée par (i) l’application d’eau sur l’éponge centrale bung (intervalle de 24 h); (ii) l’ajout de quatre flacons remplis d’eau dans la grille; et (iii) à l’aide d’un couvercle en plastique pour toute la configuration. L’évaporation est significativement plus faible si l’humidité est contrôlée pour les deux solutions testées (***P ≤ 0,001; N = 48). Aucune différence de volatilité entre la solution de saccharose contenant et non contenant n’est détectable avec les dispositifs d’humidité utilisés. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vials (breeding)	Greiner Bio-One	960177	www.greinerbioone.com
Vials (CAFE assay)	Greiner Bio-One	217101	www.greinerbioone.com
Lid-CAFE assay	Workshop	–	–
Plastic box, low wall	Plastime	353	www.plastime.it
Cover for the plastic box	Workshop	–	–
Capillaries	BLAUBRAND	REF 7087 07	www.brand.de
Pipette tips	Greiner Bio-One	771290	www.greinerbioone.com
Filter paper circles	Whatman	10 311 804	www.sigmaaldrich.com
D(+)-Sucrose	AppliChem	57-50-1	www.applichem.com
Ethanol absolute	VWR Chemicals	20,821,330	www.vwr.com
Food color (red, E124)	Backfun	10027	www.backfun.de
Food color (blue, E133)	Backfun	10030	www.backfun.de
Soap solution (CVK 8)	CVH	103220	www.cvh.de
Digital caliper	GARANT	412,616	www.hoffmann-group.com
Vials (breeding)			Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm
Vials (CAFE assay)			Height 8 cm, diameter 3.3 cm
Lid-CAFE assay			Produced in university workshop, technical drawing supplied Please click here to download this file.
Plastic box, low wall			A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions
Cover for the plastic box			Dimensions (37 x 29 x 18 cm)
Capillaries			DIN ISO 7550 norm, IVD-guideline 98/79 EG, ends polished
Pipette tips			Pipettes for the outer circle are cut according to the lid
Filter paper circles			45 mm diameter works nicely if folded for the vials used
D(+)-Sucrose			Not harmful
Ethanol absolute			Highly flammable liquid and vapor
Food color (red, E124)			Not stated
Food color (blue, E133)			Not stated
Soap solution (CVK 8)			Odor neutral soap
Digital caliper
Standard fly food			(for 20 L)
Agar			160 g
Brewer's Yeast			299.33 g
Cornmeal			1,200 g
Molasses			1.6 L
Propionic acid			57.3 mL
Nipagin 30%			160 mL