Overview
यह वीडियो CApillary FEeder, या कैफे, परख, एक व्यवहार विधि है कि भोजन के सेवन और अनर्गल फल मक्खियों की वरीयता के उपाय का वर्णन करता है । विशेष रुप से प्रदर्शित प्रोटोकॉल से पता चलता है कि भोजन देने और इसके सेवन को ट्रैक करने के लिए उपयोग किए जाने वाले तरल-भरे केशिकाओं से न्यूनतम वाष्पीकरण के साथ परख कैसे करें।
Protocol
यह प्रोटोकॉल डिगेलमैन एट अल से एक अंश है, CApillary FEeder परख ड्रोसोफिला मेलानोगस्टर, जे विस Exp.(२०१७) में खाद्य सेवन के उपाय करता है ।
1. विधानसभा और CApillary FEeder परख प्रदर्शन
- यदि उपवास की आवश्यकता नहीं है, तो प्रयोगात्मक मक्खियों को टैप करके या ब्लो-पाइप द्वारा परख में स्थानांतरित करें। वाष्पीकरण की मात्रा निर्धारित करने के लिए मक्खियों के बिना तीन नियंत्रण शीशियों को शामिल करना सुनिश्चित करें।
- ध्यान से एक पिपेट टिप (2 - 20 माइक्रोन वॉल्यूम) को हटा दें जो बाहरी उद्घाटन में से एक को बंद कर रहा है, और पहले एक भरा हुआ ग्लास केशिका, नीचे-अंत डालें। केशिका के बगल में पिपेट टिप को वापस रखकर केशिका को सुरक्षित करें। यदि कई खाद्य समाधानों का परीक्षण किया जा रहा है, तो तदनुसार इस प्रक्रिया को दोहराएं।
- यदि खाद्य स्रोत विभिन्न ऊंचाइयों (ढक्कन से 3 - 4 सेमी) पर स्थित थे तो पूर्वाग्रह से बचने के लिए एक ही स्तर पर सभी शीशियों के अंदर केशिका समाप्त होता है; फिल्टर पेपर या खाद्य स्रोतों के विभिन्न चिपचिपाहट को दुर्घटनापूर्वक छूने से केशिका को लीक होने से रोकने के लिए फिल्टर पेपर की दूरी बनाए रखें।
- मार्कर पेन (मार्कशुरुआत)का उपयोग करके रंगीन तरल के ऊपरी छोर को लेबल दें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि विभिन्न केशिकाओं की पहचान की जा सकती है, उन्हें व्यक्तिगत रूप से एक रंग या धारी कोड का उपयोग करके लेबल करें।
- एक प्लास्टिक बॉक्स के अंदर कई तैयार कैफे परख रखें और प्रायोगिक अवधि(जैसे 3 घंटे यादिन)के लिए प्रयोगशाला की स्थिति में या तापमान-, प्रकाश और आर्द्रता नियंत्रित जलवायु कक्ष (पैरामीटर: 25 डिग्री सेल्सियस, 60% सापेक्ष आर्द्रता, 12 एच/12 एच-डार्क चक्र) के लिए बॉक्स(चित्रा2 ए) को एक सुरक्षित स्थिति में स्थानांतरित करें।
- के रूप में नीचे फिल्टर कागज बाहर सूख जाता है अगर परख कई दिनों में किया जाता है, स्पंज डाट (१०० μL) के माध्यम से हर 24 घंटे ताजा पानी लागू करने के लिए नमी परख के अंदर स्थिर रखने के लिए । आर्द्रता उपकरणों के रूप में 30 एमएल डीडीएच 2 ओ से भरे चार अलग-अलग शीशियों (8 सेमी ऊंचाई,3.3सेमी व्यास) का उपयोग करें और उन्हें प्लास्टिक बॉक्स में कैफे के बगल में रखें। प्रयोग(चित्रा 2ए)के दौरान आर्द्रता नियंत्रित वातावरण बनाने के लिए प्लास्टिक बॉक्स के लिए एक कवर का उपयोग करें।
नोट: व्यापक परिवर्तनशीलता प्रयोगशाला की स्थिति के तहत होती है; हालांकि, कमरे के तापमान पर कैफे परख करना संभव है(उदाहरण के लिए,एक कक्षा में)। एक आर्द्रीकरण उपकरण (फिल्टर पेपर, गीले स्पंज डाट, भरे हुए पानी की शीशियों और प्लास्टिक बॉक्स के लिए कवर के साथ या बिना) का उपयोग वाष्पीकरण(चित्रा 2बी)को कम करने के लिए अत्यधिक प्रोत्साहित किया जाता है। - हर 24 घंटे में दीर्घकालिक प्रयोगों के लिए हौसले से भरे लोगों के साथ केशिकाओं को बदलें। प्रत्येक 24 घंटे के अंतराल से पहले मृत मक्खियों का ध्यान दें और निम्नलिखित अवधि के लिए प्रति फ्लाई खपत की गणना करने के लिए जीवित मक्खियों की संख्या का उपयोग करें। मेनिस्कस की गिरावट को मापने के बाद पुरानी केशिकाओं को त्यागें (2.1 देखें)।
नोट: एक 3 घंटे के प्रयोग के दौरान हम शायद ही किसी भी मृत मक्खियों को देखते हैं । 4 दिनों के अध्ययन के दौरान हम आमतौर पर 1 - 3 मृत मक्खियों पाते हैं। - परख के अंत में या केशिका की जगह से पहले, एक मार्कर कलम के साथ केशिका (मार्कअंत)के निचले meniscus निशान जबकि कैफे परख ईमानदार स्थिति में अभी भी है । यदि मार्कएंड प्रारंभिक निशान (मार्कशुरुआत)से नीचे नहीं है तो डेटा को त्याग दें। ढक्कन को न हटाएं, क्योंकि इससे मेनिस्कस बदल सकता है।
- परख से केशिकाओं को सावधानी से हटा दें और उन्हें डेटा संग्रह के लिए स्टोर करें। जांच करें कि क्या केशिका के अंदर तरल डेटा को त्यागने नहीं तो निचले छोर तक पहुंच गया, क्योंकि भोजन मक्खियों के लिए सुलभ नहीं था। एक समूह के रूप में प्रति शीशी सभी केशिकाएं ले लीजिए। मक्खियों को बचने से रोकने के लिए सभी उद्घाटनों में अनकट पिपेट टिप्स डालें। सेटअप को खत्म करें और आगे के उपयोग के लिए कमरे के तापमान पर साबुन स्नान और सूखी रात में शीशियों, ढक्कन और स्पंज बंग्स को धोएं।
नोट: परख के बाद मक्खियों का और विश्लेषण किया जा सकता है। आंख से या विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे भोजन तेज की पुष्टि करें। - कम से कम तीन अलग-अलग दिनों पर एक ही जीनोटाइप के साथ प्रयोग दोहराएं।
2. डेटा संग्रह और विश्लेषण
- कैलिपर या शासक का उपयोग करके केशिका पर मार्कशुरुआत और मार्कअंत के बीच की दूरी को मापें। डेटा को सीधे स्प्रेडशीट में स्थानांतरित करने के लिए, यूएसबी (यूनिवर्सल सीरियल बस) कनेक्टेड डिजिटल कैलिपर(चित्रा 1ई)का उपयोग करें। माप के बाद केशिकाओं को त्याग दें।
- भोजन तेज या वाष्पीकरण की गणना करने के लिए केशिका आकार का लेखा-जोखा। उदाहरण के लिए, एक केशिका पर विचार करें जो 73 मिमी लंबा है और इसमें 5 माइक्रोन खाद्य समाधान शामिल हैं। मेनिस्कस में 14.6 मिमी की कमी 1 माइक्रोल समाधान के तेज को दर्शाती है। निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके भोजन तेज की गणना करें:
खाद्य तेज (μL) = मापा दूरी (मिमी)/१४.६ मिमी - भोजन के सेवन पर वाष्पीकरण के प्रभाव को बाहर करने के लिए, मक्खियों के बिना तीन (न्यूनतम) नियंत्रण शीशियों में औसत वाष्पीकरण की गणना करें। मक्खियों द्वारा भोजन की खपत के लिए प्राप्त मूल्य से इस मतलब मूल्य को घटाएं।
- फ्लाई प्रति कुल खपत निर्धारित करने के लिए निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करें:
खाद्य खपत (μL) = (खाद्य तेज [μL]-वाष्पीकरण हानि [μL])/शीशी में मक्खियों की कुल संख्या । लंबे समय तक प्रयोगों के लिए 24 घंटे के अंतराल की शुरुआत से पहले जीवित मक्खियों की संख्या का उपयोग करें। - शरीर के आकार में अंतर के लिए खाते में, जैसे पुरुष और महिला मक्खियों के बीच, शरीर के वजन (μL भोजन/एमजी मक्खी) के लिए भोजन की खपत को सामान्य ।
- डेटा विश्लेषण के लिए सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। सामान्य रूप से वितरित डेटा के लिए, दो फ्लाई समूहों के बीच मतभेदों को निर्धारित करने के लिए छात्र के टी-परीक्षणों का उपयोग करें, और दो से अधिक समूहों के लिए पोस्ट हॉक ट्यूकी क्रैमर परीक्षणों के साथ ANOVA (विचरण का विश्लेषण) का उपयोग करें। एक विकल्प की स्थिति में, एक गैर-पैरामेट्रिक वन-सैंपल साइन टेस्ट का उपयोग करके यादृच्छिक विकल्प से मतभेदों का विश्लेषण करें।
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Representative Results
चित्रा 1: ड्रोसोफिला मेलनोगेस्टर सीपिलरी फेडर परख। ए) मक्खियों के साथ खिला परख । गीला फिल्टर पेपर शीशी के तल पर पानी प्रदान करता है। प्रयोग के दौरान चार केशिकाएं प्रदान की जाती हैं (विपरीत केशिकाओं में लाल और नीले रंग का भोजन)। ध्यान दें कि केशिकाओं को दूसरे पिपेट टिप द्वारा स्थिति में सुरक्षित किया जाता है, और अप्रयुक्त पदों को पिपेट युक्तियों का उपयोग करके बंद कर दिया जाता है। ढक्कन के केंद्र में एक फोम प्लग हवा विनिमय की अनुमति देता है। ख) ढक्कन का विस्तृत दृश्य । कट पिपेट टिप्स (2 - 20 माइक्रोन, लाल सीमाएं) अप्रयुक्त पदों के शंकुके उद्घाटन में डाली जाती हैं, और छेद को बंद करने के लिए कट टिप में एक दूसरा पिपेट टिप डाला जाता है। माइक्रोकैपिलरी के प्लेसमेंट को नियंत्रित करने के लिए कट पिपेट टिप्स का उपयोग किया जाता है, और केशिकाओं को टाइट रखने के लिए अनकट युक्तियों का उपयोग किया जाता है। ग) एक डी मेलनोगास्टर फ्लाई एक केशिका पर फ़ीड करता है । घ) खिलाने के बाद, फ्लाई पेट में भोजन का रंग स्पष्ट रूप से दिखाई देता है। ई) मेनिस्कस के मार्कशुरुआत और मार्कएंड के बीच की दूरी को मापने के लिए एक डिजिटल कैलिपर का उपयोग किया जाता है। डेटा सीधे यूएसबी के माध्यम से एक्सेल स्प्रेडशीट में स्थानांतरित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: केशिका फीडर परख में वाष्पीकरण का प्रभाव। ए) एक ग्रिड वाले इनले के साथ एक प्लास्टिक बॉक्स के अंदर रखा गया मल्टीपल कैफे परख। प्रयोग के दौरान आर्द्रता को नियंत्रित करने के लिए ग्रिड के अंदर चार पानी से भरी शीशियां (रेड रिम्स) रखी जाती हैं। वाष्पीकरण नियंत्रण इन शीशियों के सीधे निकटता में रखा जाता है। पूरे सेटअप के लिए एक कवर पृष्ठभूमि में दिखाया गया है। ख) वाष्पीकरण के माध्यम से मात्रा हानि की तुलना। 4 दिनों में वाष्पीकरण के लिए औसत मूल्य दिखाया गया है। आर्द्रता (i) केंद्रीय स्पंज डाट (24 घंटे के अंतराल) पर पानी लगाने से नियंत्रित होती है; (ii) ग्रिड में पानी से भरी चार शीशियों को जोड़ना; और (iii) पूरे सेटअप के लिए प्लास्टिक कवर का उपयोग करना। यदि आर्द्रता को परीक्षण किए गए दोनों समाधानों के लिए नियंत्रित किया जाता है तो वाष्पीकरण काफी कम है (***पी ≤ 0.001; एन = 48)। EtOH युक्त और गैर युक्त सुक्रोज समाधान के बीच अस्थिरता में कोई अंतर उपयोग किए जाने वाले आर्द्रता उपकरणों के साथ पता लगाने योग्य नहीं है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vials (breeding) | Greiner Bio-One | 960177 | www.greinerbioone.com |
| Vials (CAFE assay) | Greiner Bio-One | 217101 | www.greinerbioone.com |
| Lid-CAFE assay | Workshop | – | – |
| Plastic box, low wall | Plastime | 353 | www.plastime.it |
| Cover for the plastic box | Workshop | – | – |
| Capillaries | BLAUBRAND | REF 7087 07 | www.brand.de |
| Pipette tips | Greiner Bio-One | 771290 | www.greinerbioone.com |
| Filter paper circles | Whatman | 10 311 804 | www.sigmaaldrich.com |
| D(+)-Sucrose | AppliChem | 57-50-1 | www.applichem.com |
| Ethanol absolute | VWR Chemicals | 20,821,330 | www.vwr.com |
| Food color (red, E124) | Backfun | 10027 | www.backfun.de |
| Food color (blue, E133) | Backfun | 10030 | www.backfun.de |
| Soap solution (CVK 8) | CVH | 103220 | www.cvh.de |
| Digital caliper | GARANT | 412,616 | www.hoffmann-group.com |
| Vials (breeding) | Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm | ||
| Vials (CAFE assay) | Height 8 cm, diameter 3.3 cm | ||
| Lid-CAFE assay | Produced in university workshop, technical drawing supplied Please click here to download this file. |
||
| Plastic box, low wall | A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions | ||
| Cover for the plastic box | Dimensions (37 x 29 x 18 cm) | ||
| Capillaries | DIN ISO 7550 norm, IVD-guideline 98/79 EG, ends polished | ||
| Pipette tips | Pipettes for the outer circle are cut according to the lid | ||
| Filter paper circles | 45 mm diameter works nicely if folded for the vials used | ||
| D(+)-Sucrose | Not harmful | ||
| Ethanol absolute | Highly flammable liquid and vapor | ||
| Food color (red, E124) | Not stated | ||
| Food color (blue, E133) | Not stated | ||
| Soap solution (CVK 8) | Odor neutral soap | ||
| Digital caliper | |||
| Standard fly food | (for 20 L) | ||
| Agar | 160 g | ||
| Brewer's Yeast | 299.33 g | ||
| Cornmeal | 1,200 g | ||
| Molasses | 1.6 L | ||
| Propionic acid | 57.3 mL | ||
| Nipagin 30% | 160 mL |
