Overview
このビデオでは、食品摂取量と抑制されていないフルーツハエの好みを測定する行動方法であるCApillary FEeder(CAFE)アッセイについて説明します。注目のプロトコルは、食品を供給し、その摂取量を追跡するために使用される液体充填毛細血管からの最小限の蒸発でアッセイを実行する方法を示しています。
Protocol
このプロトコルは、ディーゲルマンらからの抜粋であり、ショウジョウバエメラノガスターの食品摂取量を測定するCApillary FEederアッセイ、J.Vis. Exp. (2017).
1. キャピラリー・フィーダーアッセイの組み立てと実行
- 断食が必要ない場合は、実験ハエをタップまたはブローパイプでアッセイに移します。蒸発を定量化するためにハエなしで3つのコントロールバイアルを含むようにしてください。
- 外側の開口部の1つを閉じているピペットチップ(2~20 μLボリューム)を慎重に取り外し、最初に充填ガラスキャピラリーを挿入します。ピペットチップをキャピラリーの隣に戻してキャピラリーを固定します。複数の食品溶液がテストされている場合は、この手順を繰り返します。
- 食料源が異なる高さ(蓋から3-4 cm)に位置していた場合に発生する可能性のあるバイアスを避けるために、キャピラリーエンドを同じレベルですべてのバイアルの内側に置きます。濾紙や食料源の異なる粘度に誤って触れることによって毛細血管が漏れるのを防ぐために、濾紙までの距離を保ちます。
- マーカーペン(マーク開始)を使用して、着色された液体の上端にラベルを付けます。異なる毛細血管を識別できるようにするには、カラーコードまたはストライプコードを使用して個別にラベルを付けます。
- 複数の準備されたCAFEアッセイをグリッド付きインレイ付きのプラスチックボックスの中に入れ、実験室の条件下で、または温度、光、湿度制御の気候室(パラメータ:25°C、相対湿度60%、12時間/12時間明暗サイクル)の下で、箱を安全な位置に移します(例えば3時間または数日)。
- アッセイが数日間にわたって行われると底ろ紙が乾燥するので、スポンジバン(100 μL)を介して24時間ごとに新鮮な水を適用して、アッセイ内の湿度を一定に保ちます。湿度装置として30 mL ddH2Oで満たされた4つの別々のバイアル(8 cmの高さ、3.3 cmの直径)を使用し、プラスチックボックスのCAFEアッセイの隣に置きます。実験中に、プラスチックボックスのカバーを使用して湿度制御環境を作り出します(図2A)。
注:より広範な変動は実験室の条件の下で起こる;しかし、室温(教室など)でCAFEアッセイを行うことは可能です。加湿装置(フィルター紙、湿ったスポンジバングの有無にかかわらず、プラスチックボックス用の水バイアルおよびカバーを満たした)の使用は、蒸発を減少させることが強く奨励される(図2B)。 - 毛細血管を24時間ごとに長期実験のために満たされたばかりの毛細血管に置き換えます。各24時間間隔の前に死んだハエをメモし、ライブハエの数を使用して、次の期間のフライあたりの消費量を計算します。半月板の減少を測定した後、古い毛細血管を捨てる(2.1参照)。
注: 3時間の実験の間、私たちは死んだハエをほとんど見ませんでした。4日間の研究の間、私たちは通常1 - 3死んだハエを見つけます。 - アッセイの最後または毛細管を交換する前に、CAFEアッセイがまだ直立した位置にある間、キャピラリーの下半月板(マークエンド)をマーカーペンでマークします。マークの終点 が初期マーク (先頭マーク)未満でない場合は、データを破棄します。半月板が変わる可能性があるため、蓋を外しないでください。
- 慎重に分析から毛細血管を取り除き、データ収集のためにそれらを保存します。食物がハエにアクセスできなかったので、データを捨てなければ、毛細血管内の液体が下端に達したかどうかを確認してください。グループとしてバイアルごとにすべての毛細血管を収集します。ハエが逃げるのを防ぐために、すべての開口部に無カットのピペットの先端を挿入します。セットアップを解体し、石鹸浴でバイアル、蓋、スポンジバングを洗い、室温で一晩乾燥させてさらに使用します。
注: ハエはアッセイ後にさらに分析することができる。目で、または解剖顕微鏡の下で食物の取り込み確認。 - 少なくとも3つの異なる日に同じ遺伝子型の実験を繰り返す。
2. データ収集と分析
- キャリパーまたは定規を使用して、キャピラリーのマークの開始 と終了 マークの間の距離を測定します。スプレッドシートに直接データを転送するには、USB (ユニバーサル シリアル バス) 接続されたデジタル キャリパーを使用します (図 1E)。測定後に毛細血管を廃棄します。
- 食物の取り込みまたは蒸発を計算する毛細管の大きさを考慮する。たとえば、長さ 73 mm で、5 μL の食品溶液を含む毛細管があるとします。半月板の14.6 mmの減少は1 μLの取り込みが反映される。次の式を使用して、食品の取り込み値を計算します。
食品取り込み(μL)=測定距離(mm)/14.6mm - 蒸発が食物摂取に及ぼす影響を排除するには、ハエを使わない3つの(最低)コントロールバイアルの平均蒸発を計算する。ハエが摂取する食品の値からこの平均値を引きます。
- 次の式を使用して、1 つのフライあたりの総消費量を決定します。
食品消費量(μL)=(食品摂取[μL]-蒸発損失[μL])/バイアル内のハエの総数。長期実験では、24時間間隔の開始前に生きているハエの数を使用します。 - 男性と雌のハエなど、体の大きさの違いを考慮して、食品の消費量を体重(μL食品/mg fly)に正規化します。
- データ分析には統計ソフトウェアを使用します。正規分布データの場合、学生の T検定を使用して2つのフライグループ間の違いを判断し、ANOVA(分散分析)を使用して、2つ以上のグループに対してポストホックのTukey Cramer検定を行います。選択状況では、ノンパラメトリックな 1 サンプル符号検定を使用して、ランダム選択との違いを分析します。
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Representative Results
図1:ショウジョウバエメラノガスターキャピラリーFEederアッセイ。A)ハエでの摂食アッセイ。湿らせたろ紙はバイアルの底に水を提供する。実験中に4つの毛細血管が提供されます(反対の毛細血管の赤と青の色の食品)。毛細血管は2番目のピペットチップによって位置に固定され、未使用の位置はピペットチップを使用して閉じられていることに注意してください。蓋の中央に泡プラグは空気交換を可能にする。B)蓋の詳細図。カットピペットチップ(2 - 20 μL、赤い枠線)は未使用の位置の円錐形の開口部に挿入され、2番目のピペットチップがカットチップに挿入されて穴が閉じます。カットピペットチップは、マイクロキャピラリーの配置を制御するために使用され、ノーカットの先端は、キャピラリをしっかりと保持するために使用されます。C)D.メラノガスターフライは毛細血管に餌を与える。D)餌を与えた後、ハエ腹部に食物の色がはっきりと見える。E)デジタルキャリパーは、半月板のマーク始まりとマークの終点の間の距離を測定するために使用されます。データはUSB経由でExcelスプレッドシートに直接転送されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:キャピラリーフィーダアッセイにおける蒸発の影響A)グリッドインレイでプラスチック製の箱の中に置かれた複数のCAFEアッセイ。実験中の湿度を制御するために、4つの水満たされたバイアル(赤い縁)がグリッド内に配置されます。蒸発制御はこれらのバイアルに直接近い位置に置かれる。全体のセットアップのカバーが背景に表示されます。B)蒸発による体積損失の比較。4日間にわたる蒸発の平均値を示す。湿度は、(i)中央スポンジブン(24時間間隔)に水を適用することによって制御されます。(ii) 4つの水をグリッドに充填したバイアルを追加する。(iii)全体のセットアップのためのプラスチックカバーを使用して。両方の溶液に対して湿度が制御されている場合、蒸発は大幅に低くなります (**P ≤ 0.001;N = 48)。EtOH含有および非含有スクロース溶液の間の揮発性に差は無く、使用される湿度デバイスで検出可能である。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vials (breeding) | Greiner Bio-One | 960177 | www.greinerbioone.com |
| Vials (CAFE assay) | Greiner Bio-One | 217101 | www.greinerbioone.com |
| Lid-CAFE assay | Workshop | – | – |
| Plastic box, low wall | Plastime | 353 | www.plastime.it |
| Cover for the plastic box | Workshop | – | – |
| Capillaries | BLAUBRAND | REF 7087 07 | www.brand.de |
| Pipette tips | Greiner Bio-One | 771290 | www.greinerbioone.com |
| Filter paper circles | Whatman | 10 311 804 | www.sigmaaldrich.com |
| D(+)-Sucrose | AppliChem | 57-50-1 | www.applichem.com |
| Ethanol absolute | VWR Chemicals | 20,821,330 | www.vwr.com |
| Food color (red, E124) | Backfun | 10027 | www.backfun.de |
| Food color (blue, E133) | Backfun | 10030 | www.backfun.de |
| Soap solution (CVK 8) | CVH | 103220 | www.cvh.de |
| Digital caliper | GARANT | 412,616 | www.hoffmann-group.com |
| Vials (breeding) | Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm | ||
| Vials (CAFE assay) | Height 8 cm, diameter 3.3 cm | ||
| Lid-CAFE assay | Produced in university workshop, technical drawing supplied Please click here to download this file. |
||
| Plastic box, low wall | A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions | ||
| Cover for the plastic box | Dimensions (37 x 29 x 18 cm) | ||
| Capillaries | DIN ISO 7550 norm, IVD-guideline 98/79 EG, ends polished | ||
| Pipette tips | Pipettes for the outer circle are cut according to the lid | ||
| Filter paper circles | 45 mm diameter works nicely if folded for the vials used | ||
| D(+)-Sucrose | Not harmful | ||
| Ethanol absolute | Highly flammable liquid and vapor | ||
| Food color (red, E124) | Not stated | ||
| Food color (blue, E133) | Not stated | ||
| Soap solution (CVK 8) | Odor neutral soap | ||
| Digital caliper | |||
| Standard fly food | (for 20 L) | ||
| Agar | 160 g | ||
| Brewer's Yeast | 299.33 g | ||
| Cornmeal | 1,200 g | ||
| Molasses | 1.6 L | ||
| Propionic acid | 57.3 mL | ||
| Nipagin 30% | 160 mL |
