Overview
Bu videoda, gıda alımını ve sınırsız meyve sineklerinin tercihini ölçen davranışsal bir yöntem olan CApillary FEeder veya CAFE tahlilleri açıklanmaktadır. Öne çıkan protokol, yiyecekleri teslim etmek ve alımını izlemek için kullanılan sıvı dolu kılcal damarlardan minimum buharlaşma ile tahlilin nasıl gerçekleştirildiğini göstermektedir.
Protocol
Bu protokol Diegelmann ve ark., CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017)'den bir alıntıdır.
1. CApillary FEeder Tahlilinin Montajı ve Gerçekleştirilmesi
- Oruç tutmak gerekmemesi halinde deneysel sinekleri dokunarak veya üfleme borusu ile tahlilden tahlile aktarın. Buharlaşmayı ölçmek için sineksiz üç kontrol şişesi eklenin.
- Dış açıklıklardan birini kapatan bir pipet ucunu (2 - 20 μL hacim) dikkatlice çıkarın ve önce alt uçlu dolgulu bir cam kılcal damar yerleştirin. Pipet ucunu kılcal damarın yanına yerleştirerek kılcal damarı sabitleyin. Birkaç gıda çözeltisi test ediliyorsa, bu prosedürü buna göre tekrarlayın.
- Besin kaynakları farklı yüksekliklerde (kapaktan 3 - 4 cm) bulunursa oluşabilecek önyargıyı önlemek için kılcal uçları tüm şişelerin içine aynı seviyede yerleştirin; yanlışlıkla filtre kağıdına veya besin kaynaklarının farklı viskozitelerine dokunarak kılcal damarların sızmasını önlemek için filtre kağıdına mesafe ayırın.
- Renkli sıvının üst ucını bir işaret kalemi kullanarak etiketleyin(başlangıçişareti). Farklı kılcal damarların tanımlanabilmesini sağlamak için, bunları bir renk veya şerit kodu kullanarak ayrı ayrı etiketleyin.
- Birden fazla hazırlanmış CAFE testini ızgaralı kakma ile plastik bir kutunun içine yerleştirin ve kutuyu (Şekil 2A) laboratuvar koşullarında veya sıcaklık, ışık ve nem kontrollü bir iklim odasında (parametreler: 25 °C, %60 bağıl nem, 12 saat/12 saat açık-karanlık döngü) deneysel dönem için(örneğin 3 saat veya gün) güvenli bir konuma aktarın.
- Test birkaç gün boyunca yapılırsa alt filtre kağıdı kuruduğunda, nemi test içinde sabit tutmak için sünger bung (100 μL) aracılığıyla her 24 saatte bir tatlı su uygulayın. Nem cihazları olarak 30 mL ddH 2 O ile doldurulmuş dört ayrı şişe (8 cm yükseklik,3,3cm çapında) kullanın ve plastik kutudaki CAFE testlerinin yanına yerleştirin. Deney sırasında nem kontrollü ortam oluşturmak için plastik kutu için bir kapak kullanın (Şekil 2A).
NOT: Laboratuvar koşullarında daha geniş değişkenlik oluşur; ancak, CAFE testini oda sıcaklığında(örneğin,bir sınıfta) gerçekleştirmek mümkündür. Bir nemlendirme cihazının (filtre kağıdı, ıslak sünger bung, doldurulmuş su şişeleri ve plastik kutu kapağı olsun veya olmasın) kullanımı, buharlaşmayı azaltmak için son derece teşvik edilir (Şekil 2B). - Her 24 saat uzun süreli deneyler için kılcal damarları taze doldurulmuşlarla değiştirin. Her 24 saat aralığından önce ölü sinekleri not edin ve sonraki dönem için sinek başına tüketimi hesaplamak için canlı sinek sayısını kullanın. Menisküsün düşüşünü ölçtükten sonra eski kılcal damarları atın (bkz. 2.1).
NOT: 3 saat süren bir deney sırasında neredeyse hiç ölü sinek görmüyoruz. 4 günlük bir çalışma sırasında genellikle 1 - 3 ölü sinek buluyoruz. - Tahlilin sonunda veya kılcal damarı değiştirmeden önce, CAFE tahlili hala dik konumdayken kılcal damarın alt menisküsünü (işaretucu)bir işaret kalemi ile işaretleyin. İşaretucu ilk işaretin altında değilse(başlangıcıişaretle) verileri atın. Menisküsleri değiştirebileceğinden kapağı çıkarmayın.
- Kılcal damarları testten dikkatlice çıkarın ve veri toplama için saklayın. Kılcal damarın içindeki sıvının verileri atmazsa alt uca ulaşıp ulaşmadığını kontrol edin, çünkü yiyecekler sineklere erişemiyordu. Şişe başına tüm kılcal damarları grup olarak toplayın. Sineklerin kaçmasını önlemek için tüm açıklıklara kesilmemiş pipet uçları yerleştirin. Kurulumu sökün ve şişeleri, kapakları ve sünger maşaları bir sabun banyosunda yıkayın ve daha fazla kullanım için oda sıcaklığında bir gecede kurutun.
NOT: Sinekler test edildikten sonra daha fazla analiz edilebilir. Gıda alımını gözle veya diseksiyon mikroskobu altında onaylayın. - Aynı genotiplerle yapılan deneyleri en az üç farklı günde tekrarlayın.
2. Veri Toplama ve Analiz
- Bir kaliper veya cetvel kullanarak kılcal damarda işaretbaşlangıcı ile işaretucu arasındaki mesafeyi ölçün. Verileri doğrudan bir elektronik tabloya aktarmak için, USB (Evrensel Seri Veri Yolu) bağlı dijital kaliper(Şekil 1E)kullanın. Ölçümden sonra kılcal damarları atın.
- Gıda alımını veya buharlaşmayı hesaplamak için kılcal damar boyutunu hesaba katın. Örneğin, 73 mm uzunluğunda ve 5 μL gıda çözeltisi içeren bir kılcal damar düşünün. Menisküste 14,6 mm'lik bir azalma, 1 μL çözeltinin alımını yansıtır. Aşağıdaki formülü kullanarak gıda alımını hesaplayın:
Gıda alımı (μL) = ölçülen mesafe (mm)/ 14,6 mm - Buharlaşmanın gıda alımı üzerindeki etkisini dışlamak için, sineksiz üç (minimum) kontrol şişesinde ortalama buharlaşmayı hesaplayın. Bu ortalama değeri sineklerin gıda tüketimi için elde ettiği değerden çıkarın.
- Uçucu başına toplam tüketimi belirlemek için aşağıdaki formülü kullanın:
Gıda tüketimi (μL) = (Gıda alımı [μL] - Buharlaştırıcı kayıp [μL])/şişedeki toplam sinek sayısı. Uzun süreli deneyler için 24 saat aralığı başlamadan önce canlı sinek sayısını kullanın. - Erkek ve dişi sinekler arasındaki gibi vücut büyüklüğündeki farklılıkları hesaba katmak için, gıda tüketimini vücut ağırlığına normalleştirin (μL gıda / mg sinek).
- Veri analizi için istatistiksel yazılım kullanın. Normalde dağıtılmış veriler için, iki sinek grubu arasındaki farkları belirlemek için öğrencinin Ttestlerini kullanın ve ikiden fazla grup için geçici Tukey Cramer testleri ile ANOVA 'yı (varyans analizi) kullanın. Bir seçim durumunda, nonparametrik tek örnekli bir işaret testi kullanarak rastgele seçimden farklılıkları analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1: Drosophila melanogaster CApillary FEeder Tahlil. A) Sineklerle beslenme tahlilleri. Nemlendirilmiş filtre kağıdı şişenin dibinde su sağlar. Deney sırasında dört kılcal damar sağlanır (zıt kılcal damarlarda kırmızı ve mavi renkli yiyecekler). Kılcal damarların ikinci bir pipet ucuyla sabitlendiğini ve kullanılmayan pozisyonların pipet uçları kullanılarak kapatıldığını unutmayın. Kapağın ortasındaki bir köpük fiş hava değişimine izin verir. B) Kapağın ayrıntılı görünümü. Kullanılmayan pozisyonların konik açıklıklarına kesme pipet uçları (2 - 20 μL, kırmızı kenarlıklar) yerleştirilir ve deliği kapatmak için kesme ucuna ikinci bir pipet ucu yerleştirilir. Kesilen pipet uçları mikrokapsillerin yerleştirilmesini kontrol etmek için kullanılır ve kılcal damarları sıkı tutmak için kesilmemiş uçlar kullanılır. C) Bir D. melanogaster sineği kılcal damarla beslenir. D) Beslendikten sonra sinek karnında gıda rengi açıkça görülür. E) Menisküsbaşlangıcının işareti ileucu arasındaki mesafeyi ölçmek için dijital kaliper kullanılır. Veriler doğrudan USB üzerinden bir Excel elektronik tablosuna aktarılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kılcal Besleyici Testinde Buharlaşmanın Etkisi. A) Izgara kakma ile plastik bir kutunun içine yerleştirilmiş birden fazla CAFE tahlil. Deney sırasında nemi kontrol etmek için ızgaranın içine dört su dolu şişe (kırmızı jant) yerleştirilir. Buharlaştırma kontrolleri bu şişelere doğrudan yakın bir yere yerleştirilir. Tüm kurulum için bir kapak arka planda gösterilir. B) Buharlaşma yoluyla hacim kaybının karşılaştırılması. 4 gün boyunca buharlaşma için ortalama değer gösterilir. Nem, (i) merkezi sünger bung'a (24 saat aralıklarla) su uygulanmasıyla kontrol edilir; (ii) şebekeye dört su dolu şişe eklemek; ve (iii) tüm kurulum için plastik bir kapak kullanmak. Test edilen her iki çözelti için de nem kontrol edilirse buharlaşma önemli ölçüde daha düşüktür (***P ≤ 0.001; N = 48). EtOH içeren ve içermeyen sakkaroz çözeltisi arasındaki volatilite farkı, kullanılan nem cihazları ile tespit edilemez. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vials (breeding) | Greiner Bio-One | 960177 | www.greinerbioone.com |
| Vials (CAFE assay) | Greiner Bio-One | 217101 | www.greinerbioone.com |
| Lid-CAFE assay | Workshop | – | – |
| Plastic box, low wall | Plastime | 353 | www.plastime.it |
| Cover for the plastic box | Workshop | – | – |
| Capillaries | BLAUBRAND | REF 7087 07 | www.brand.de |
| Pipette tips | Greiner Bio-One | 771290 | www.greinerbioone.com |
| Filter paper circles | Whatman | 10 311 804 | www.sigmaaldrich.com |
| D(+)-Sucrose | AppliChem | 57-50-1 | www.applichem.com |
| Ethanol absolute | VWR Chemicals | 20,821,330 | www.vwr.com |
| Food color (red, E124) | Backfun | 10027 | www.backfun.de |
| Food color (blue, E133) | Backfun | 10030 | www.backfun.de |
| Soap solution (CVK 8) | CVH | 103220 | www.cvh.de |
| Digital caliper | GARANT | 412,616 | www.hoffmann-group.com |
| Vials (breeding) | Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm | ||
| Vials (CAFE assay) | Height 8 cm, diameter 3.3 cm | ||
| Lid-CAFE assay | Produced in university workshop, technical drawing supplied Please click here to download this file. |
||
| Plastic box, low wall | A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions | ||
| Cover for the plastic box | Dimensions (37 x 29 x 18 cm) | ||
| Capillaries | DIN ISO 7550 norm, IVD-guideline 98/79 EG, ends polished | ||
| Pipette tips | Pipettes for the outer circle are cut according to the lid | ||
| Filter paper circles | 45 mm diameter works nicely if folded for the vials used | ||
| D(+)-Sucrose | Not harmful | ||
| Ethanol absolute | Highly flammable liquid and vapor | ||
| Food color (red, E124) | Not stated | ||
| Food color (blue, E133) | Not stated | ||
| Soap solution (CVK 8) | Odor neutral soap | ||
| Digital caliper | |||
| Standard fly food | (for 20 L) | ||
| Agar | 160 g | ||
| Brewer's Yeast | 299.33 g | ||
| Cornmeal | 1,200 g | ||
| Molasses | 1.6 L | ||
| Propionic acid | 57.3 mL | ||
| Nipagin 30% | 160 mL |
