Overview
Это видео описывает CApillary FEeder, или CAFE, анализ, поведенческий метод, который измеряет потребление пищи и предпочтение безудержных плодовых мушек. Протокол показывает, как выполнить анализ с минимальным испарением из заполненных жидкостью капилляров, используемых для доставки пищи и отслеживания ее потребления.
Protocol
Этот протокол является выдержкой из Diegelmann и др., CApillary FEeder Assay Измеряет потребление пищи в Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).
1. Сборка и выполнение CApillary FEeder Assay
- Если пост не нужен, перенесите экспериментальные мухи на анализ, постукивая или ударом трубы. Убедитесь в том, чтобы включить три контрольных флакона без мух для количественной оценки испарения.
- Аккуратно удалите наконечник пипетки (объем 2 - 20 мкл), который закрывает одно из внешних отверстий, и вставьте заполненный стеклянный капилляр, нижний конец в первую очередь. Закрепив капилляр, поместив наконечник пипетки обратно рядом с капилляром. Если тестируется несколько пищевых растворов, повторите эту процедуру соответствующим образом.
- Поместите капиллярные концы внутри всех флаконов на одном уровне, чтобы избежать смещения, которое может произойти, если источники пищи расположены на разных высотах (3 - 4 см от крышки); держать расстояние до фильтровальной бумаги, чтобы предотвратить капилляр от утечки случайно касаясь фильтровальной бумаги или различных вязкостей источников питания.
- Наклейте этикетку на верхний конец цветной жидкости с помощью маркерной ручки (началознака). Чтобы обеспечить возможность идентифицирования различных капилляров, отмейте их по отдельности с помощью цветового или полосатого кода.
- Поместите несколько подготовленных анализов CAFE внутри пластиковой коробки с сетчатой вставной вставки и перенеситекоробку (рисунок 2A) в безопасное положение в лабораторных условиях или в климат-камеру, контролируемую температурой, светом и влажностью (параметры: 25 градусов по Цельсию, 60% относительная влажность, 12 ч/12 ч светло-темного цикла)в течение экспериментального периода (например, 3 ч или дней).
- По мере того как нижняя бумага фильтра высыхает вне если анализ выполнен над несколькими днями, то принесите свежую воду каждые 24 h через губку bung (100 L) для того чтобы держать влажность постоянн внутри анализа. Используйте четыре отдельных флакона (высота 8 см, диаметр 3,3 см), наполненных 30 мл ddH2O в качестве устройств влажности и поместите их рядом с анализами CAFE в пластиковой коробке. Используйте крышку для пластиковой коробки для создания среды, контролируемой влажностью во время эксперимента(рисунок 2A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Более широкая изменчивость происходит в лабораторных условиях; однако, возможно выполнить анализ CAFE при комнатной температуре(например,в классе). Использование увлажняющее устройство (фильтровающая бумага, с или без мокрой губки bung, заполненные флаконы воды и крышка для пластиковой коробки) настоятельно рекомендуется уменьшить испарение (Рисунок 2B). - Замените капилляры на свежезаполнутые для длительных экспериментов каждые 24 ч. Обратите внимание на мертвых мух перед каждым интервалом 24 ч и используйте количество живых мух для расчета потребления на муху в течение следующего периода. Откажитесь от старых капилляров после измерения упадка мениска (см. 2.1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время эксперимента 3 ч мы почти не видим мертвых мух. В течение 4 дней исследования мы обычно находим 1 - 3 мертвых мух. - В конце анализа или перед заменой капилляра, отметь нижний мениска капилляра (конецзнака)маркерной ручкой, в то время как анализ CAFE все еще находится в вертикальном положении. Отбросьте данные,если конец знака не ниже начальной отметки (началоотметки). Не снимите крышку, так как это может изменить мениска.
- Тщательно удалите капилляры из анализа и храните их для сбора данных. Проверьте, достигла ли жидкость внутри капилляра нижнего конца, если не отбросьте данные, так как пища была недоступна мухам. Соберите все капилляры на флакон в группе. Вставьте необрезанные советы пипетки во все отверстия, чтобы предотвратить мух от побега. Разобрать установку и мыть флаконы, крышки и губки койки в мыльной ванне и сухой на ночь при комнатной температуре для дальнейшего использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мухи могут быть дополнительно проанализированы после анализа. Подтвердите поглощение пищи глазом или под микроскопом вскрытия. - Повторите эксперименты с одними и теми же генотипами по крайней мере в три разных дня.
2. Сбор и анализ данных
- Измерьте расстояние междуначалом знака иконцом знака на капилляре с помощью калипера или линейки. Для передачи данных непосредственно в электронную таблицу используйте USB (Универсальный серийный автобус), подключенный к цифровому калиперу(рисунок 1E). Откажитесь от капилляров после измерения.
- Учитывайте размер капилляров для расчета поглощения пищи или испарения. Например, рассмотрим капилляр длиной 73 мм и содержащий 5 мл пищевого раствора. Уменьшение мениска на 14,6 мм отражает поглощение раствора 1 мл. Рассчитайте поглощение пищи по следующей формуле:
Поглощение пищи (ОЛ) - измеренное расстояние (мм)/ 14,6 мм - Чтобы исключить влияние испарения на потребление пищи, рассчитайте среднее испарение в трех (как минимум) контрольных флаконах без мух. Вычесть это среднее значение из стоимости, полученной для потребления продуктов питания мухами.
- Используйте следующую формулу для определения общего потребления на лету:
Потребление пищевых продуктов (ОЛ) - (Поглощение пищи ( L) - Испарительная потеря (L))/общее количество мух во флаконе. Для длительных экспериментов используйте количество мух живыми до начала интервала 24 ч. - Для учета различий в размерах тела, таких как между мужскими и женскими мухами, нормализуют потребление пищи до массы тела (пища/мг мухи).
- Используйте статистическое программное обеспечение для анализа данных. Для обычно распределенных данных используйте T-тесты студентадля определения различий между двумя группами мух и используйте ANOVA (анализ дисперсии) с пост-специальными тестами Tukey Cramer для более чем двух групп. В ситуации выбора проанализируйте отличия от случайного выбора с помощью непараметрического одно образеца теста знака.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1: Drosophila меланогастер CApillary FEeder Assay. A) Кормление анализ с мухами. Увлажненной фильтровальной бумагой обеспечивается вода на дне флакона. В ходе эксперимента предусмотрено четыре капилляра (красная и синяя пища в противоположных капиллярах). Обратите внимание, что капилляры закреплены в положении вторым наконечником пипетки, а неиспользованные позиции закрываются с помощью пипеток. Пенная вилка в центре крышки позволяет обмениваться воздухом. B) Детальное представление крышки. Вырезать пипетки советы (2 - 20 йл, красные границы) вставляются в конические отверстия неиспользованных позиций, и второй кончик пипетки вставляется в разрез наконечник, чтобы закрыть отверстие. Вырезать пипетки советы используются для контроля размещения микрокапилляров, и необрезанные кончики используются для хлестить капилляры плотно. C) D. melanogaster летать питается капилляром. D) После кормления, пищевой цвет хорошо виден в животе мухи. E) Цифровой калипер используется для измерения расстояния между началомзнака иконцом знака мениска. Данные передаются непосредственно в электронную таблицу Excel через USB. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Влияние испарения в Capillary Feeder Assay. A) Несколько CAFE анализ помещены внутри пластиковой коробке с сеткой вставки. Для контроля влажности во время эксперимента внутри сетки помещаются четыре заполненных флакона воды (красные диски). Элементы управления испарением расположены в непосредственной близости от этих флаконов. Обложка для всей настройки отображается в фоновом режиме. B) Сравнение потери объема через испарение. Показано среднее значение испарения в течение 4 дней. Влажность контролируется i) применением воды к центральной губке bung (интервал 24 ч); ii) добавление в сетку четырех заполненных водой флаконов; и iii) с использованием пластиковой крышки для всей установки. Испарение значительно ниже, если влажность контролируется для обоих проверенных растворов(P ≤ 0.001; N No 48). Никаких различий в волатильности между содержащим etOH и несодержащих раствором сахарозы не обнаруживается с используемыми устройствами влажности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Vials (breeding) | Greiner Bio-One | 960177 | www.greinerbioone.com |
Vials (CAFE assay) | Greiner Bio-One | 217101 | www.greinerbioone.com |
Lid-CAFE assay | Workshop | – | – |
Plastic box, low wall | Plastime | 353 | www.plastime.it |
Cover for the plastic box | Workshop | – | – |
Capillaries | BLAUBRAND | REF 7087 07 | www.brand.de |
Pipette tips | Greiner Bio-One | 771290 | www.greinerbioone.com |
Filter paper circles | Whatman | 10 311 804 | www.sigmaaldrich.com |
D(+)-Sucrose | AppliChem | 57-50-1 | www.applichem.com |
Ethanol absolute | VWR Chemicals | 20,821,330 | www.vwr.com |
Food color (red, E124) | Backfun | 10027 | www.backfun.de |
Food color (blue, E133) | Backfun | 10030 | www.backfun.de |
Soap solution (CVK 8) | CVH | 103220 | www.cvh.de |
Digital caliper | GARANT | 412,616 | www.hoffmann-group.com |
Vials (breeding) | Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm | ||
Vials (CAFE assay) | Height 8 cm, diameter 3.3 cm | ||
Lid-CAFE assay | Produced in university workshop, technical drawing supplied Please click here to download this file. |
||
Plastic box, low wall | A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions | ||
Cover for the plastic box | Dimensions (37 x 29 x 18 cm) | ||
Capillaries | DIN ISO 7550 norm, IVD-guideline 98/79 EG, ends polished | ||
Pipette tips | Pipettes for the outer circle are cut according to the lid | ||
Filter paper circles | 45 mm diameter works nicely if folded for the vials used | ||
D(+)-Sucrose | Not harmful | ||
Ethanol absolute | Highly flammable liquid and vapor | ||
Food color (red, E124) | Not stated | ||
Food color (blue, E133) | Not stated | ||
Soap solution (CVK 8) | Odor neutral soap | ||
Digital caliper | |||
Standard fly food | (for 20 L) | ||
Agar | 160 g | ||
Brewer's Yeast | 299.33 g | ||
Cornmeal | 1,200 g | ||
Molasses | 1.6 L | ||
Propionic acid | 57.3 mL | ||
Nipagin 30% | 160 mL |