Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

إعداد عينة للفحص المجهري للقوة الذرية Virion واحد والتصوير الفلوري فائقة الدقة

Published: January 2, 2014 doi: 10.3791/51366
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Physics & Astronomy, University of Utah, 2Center for Cell and Genome, University of Utah

Summary

إن ربط الف virions بالسطح هو شرط لتصوير الفيروسة الواحدة عن طريق التصوير الفلوري فائق الدقة أو المجهر للقوة الذرية (AFM). هنا نحن نثبت طريقة إعداد عينة للالتصاق الخاضعة للرقابة من virions إلى الأسطح الزجاجية مناسبة للاستخدام في AFM والتصوير الفلوري فائقة الدقة.

Abstract

تعطيل virions إلى الأسطح الزجاجية هو خطوة حاسمة في التصوير virion واحد. هنا نقدم تقنية اعتمدت من مقايسات التصوير جزيء واحد الذي يسمح التصاق virions واحد إلى الأسطح الزجاجية مع خصوصية. ويستند هذا الإعداد على تطعيم سطح الزجاج مع خليط من PLL-g-PEG وPLL-g-PEG-Biotin، إضافة طبقة من avidin، وأخيرا خلق المراسي virion من خلال مرفق الأجسام المضادة فيروس البيوتينيلات البيوتينية محددة. لقد طبقنا هذه التقنية عبر مجموعة من التجارب بما في ذلك المجهر القوة الذرية (AFM) والتصوير الفلوري فائق الدقة. ينتج عن طريقة إعداد العينة هذه التصاق تحكم للفيروينات إلى السطح.

Introduction

تستخدم التفاعلات غير المحددة القائمة على الشحن بشكل روتيني لتصاق virions في المجهر للقوة الذرية1،2. هذه التقنيات تعمل بشكل جيد خاصة عند استخدامها على virions غير مجسم مع capsids قاسية جدا3-6. على الرغم من أن هذه التقنيات فعالة جدا في شل العينة، فإنها لا تمنع ربط غير محدد من البروتينات إلى السطح. الربط غير محدد يمكن أن تخلق مشكلة عند محاولة لتصوير virions مع AFM وتقنيات الفلورسينس فائقة الدقة التي تتطلب حضانات العينة مع الأجسام المضادة المختلفة. هنا نوضح طريقة إعداد عينة لشل محددة من virions.

بولي (الإيثيلين غليكول) (PEG) المطعمة إلى بولي (L-lysine) (PLL) ومموج على سطح زجاجي يوفر كتلة كبيرة للتفاعلات الكهروستاتيكية من البروتينات مع الزجاج7. وقد استغلت المقايسات جزيء واحد التي تتطلب شل جزيئات واحدة على الأسطح الزجاجية من هذه الخاصية واستخدامها لإنشاء PEG محددة على أساس تقنية شل جزيء واحد8-10. كما تم استخدام هذا الإعداد لشل أقفاص clathrin على سطح الزجاج11، فضلا عن خلق طلاء فيبروكتين متجانسة للسيطرة على خلية التصاق 12.

لقد اعتمدنا طريقة إعداد العينة على أساس الامتزاز PLL-g-PEG إلى الأسطح الزجاجية من منهجيات تصوير جزيء واحد وتطبيقها على تصوير فيروس واحد من فيروس التهاب الفم الرسغي (VSV). تم تصوير هذه الفيروسات المفردة باستخدام المجهر القوة الذرية (AFM). كما أجريت تجارب مماثلة على الخرز الوظيفي كعنصر تحكم. كما تم تصوير virions بواسطة المجهر الفلوري فائق الدقة كانت الأجسام المضادة VSV-G المسمى مع اليكسا 647 تم استخدامها لخلق صورة للمغلف من virions واحد. يستخدم التصوير الفلوري عالي الدقة توطين جزيئات مفردة لإنشاء صورة13-15. fPALM التصوير ثنائي الخطاف يسمح توطين جزيئات واحدة مع 20 نانومتر في الطائرة و 50 نانومتر القرار على طول المحور البصري15,16. وقد استخدمت هذه التقنية ثنائية الخطاف لتصوير الصور الفلورية فائقة الدقة الموجودة في هذه الدراسة. تقنية بديلة لها نتائج مماثلة هي STORM13,17,18.

كل من AFM وصور الفلورسنت فائقة الدقة من VSV الراسية على الزجاج من خلال الإجراءات المبينة في هذه الورقة، وأظهرت ملزمة محددة من virions إلى الزجاج مع الحد الأدنى من التفاعلات غيرمحددة 19. هنا نقدم بروتوكولات إعداد العينة لAFM وتجارب التصوير الفلوري فائقة الدقة. باختصار: تعمل قطع الأغطية الزجاجية النظيفة عن طريق مبهر خليط من PLL-g-PEG و PLL-g-PEG-biotin. ومن المعتاد لهذا الفيلم رقيقة أن تكون هندسيا لتوفير ما بين 15-25٪ البيوتين وظيفية على سطح مغلفة. يتم احتضان الأغطية بشكل أكبر مع رباعية الميركم أفيدين. ثم يتم استخدام الأجسام المضادة الفيروسية البيوتينية لإنشاء موقع ربط فريد من نوعه للف فحوى. يمكن أن يتم ربط الأجسام المضادة بطريقتين.

الطريقة الأولى هي الأمثل لAFM ومع ذلك فإنه لا يزال مناسبا للتصوير الفلوري فائقة الدقة. في هذه الطريقة يتم التعامل مع سطح أفيدين المغلفة مع الأجسام المضادة البيوتينية قبل التصاق الفيروسي. يتم التعامل مع virions شلت مع اليكسا 647 وصفت الأجسام المضادة لتغطية المغلف والسماح فائقة الدقة التصوير الفلوري من virions.

الطريقة الثانية هي لمهاجمة الفيروس في حل مع الأجسام المضادة البيوتينية واليكسا 647 المسمى الأجسام المضادة قبل التمسك الفيروسات إلى سطح avidin المعالجة. تم تحسين هذه الطريقة لتجارب التصوير الفلوري فائقة الدقة التي يكون فيها استرداد المغلف الفيروسي مهما. هذه الطريقة لديها ميزة السماح طلاء الأجسام المضادة موحدة على السطح الفيروسي. قد يتم خلط الأجسام المضادة البيوتينية مع اليكسا 647 وصفت الأجسام المضادة الفيروسية في النسب التي تسمح لامتزاز كافية من الفيروس إلى السطح المعالج avidin مع الحفاظ على تركيز عال من التسمية الفلورسنت على السطح الخارجي للمغلف الفيروسي. هذه اليكسا 647 وصفت الأجسام المضادة الفيروسية ليست البيوتينية ويمكن شطف الزائدة بعيدا من أجل الحد من الضوضاء الخلفية.

Protocol

1. إعداد الكيمياء

  1. إعداد وتخزين PLL-g-PEG-البيوتين و avidin:
    1. حل البوليمر PLL-g-PEG-البيوتين في مخزن تلفزيوني وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة بتركيز 1.0 ملغم/مل.
    2. Aliquot وفقا لحجم coverlip (انظر الجدول 1)وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة.
  2. إعداد وتخزين أفيدين / نيوترافين
    1. حل أفيدين غير الملمع / NeutrAvidin في مخزن تلفزيوني وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة بتركيز 1.0 ملغ / مل.
    2. Aliquot وفقا لحجم coverlip (انظر الجدول 1)وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 سنوات.
  3. إعداد عينة الفيروس: إعداد عينات الفيروسات وفقا للحاجة التجريبية وبروتوكول المختبر قبل هذا الفحص. استخدم الخطوة 1.3.1 للطريقة 5A أو 1.3.2 للطريقة 5B.
    1. إعداد عينات الفيروسات للطريقة 5A قبل المرحلة 2. استخدام عينات الفيروسية المعدة في غضون 1-2 أيام من التحضير، أو aliquot وفقا لحجم زلة الغطاء (انظر الجدول 1)ثم تجميد فلاش في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة. عند إذابة، استخدم على الفور.
    2. إعداد عينات الفيروسات للطريقة 5B مشابهة ل 1.3.1. تذوب aliquots من الفيروس في وقت مبكر من 5B وتخزينها في 4 درجة مئوية لا يزيد عن 24 ساعة قبل الاختلاط مع الأجسام المضادة.
  4. إعداد الأجسام المضادة البيوتينية المناسبة للتجربة.

2. تنظيف غطاء الغطاء استعدادا للعلاج الكيميائي

  1. ضع أغطية في رف غطاء تفلون بحجم مناسب يحملها في اتجاه عمودي ويغمرها في كوب مليء بالكحول الإيثيلي المصفا (0.2 ميكرومتر) (190 إثباتا).
  2. Sonicate يغطي في الكحول الإيثيلي المصفاة (190 دليل) لمدة 30 دقيقة.
  3. إزالة الأغطية من الكحول وشطف coverlips على نطاق واسع مع المياه فائقة البور.
  4. ضع أغطية مشطفة في رف تفلون نظيف منفصل وأكواب مليئة ب M NaOH 1.
  5. Sonicate الأغطية في 1 M NaOH لمدة 30 دقيقة.
  6. إزالة الأغطية من NaOH وشطفها على نطاق واسع مع المياه فائقة النبور.
  7. جفف الأغطية المشطفة بتيار النيتروجين، ووضعها في رف تفلون نظيف وجاف.
  8. فحص الأغطية لأي فيلم مرئي أو الجسيمات التي لا تزال على coverlip. إذا بقيت أي مواد مرئية ، لم يتم تنظيف غطاء الغطاء بشكل صحيح وشطفه. إذا لم يتم تنظيفها بشكل صحيح كرر الخطوات 2.1-2.7.
  9. تنظيف الأغطية مع الأكسجين والبلازما لمدة 2 دقيقة. هذه الخطوة اختيارية ولكن يوصى بها.

3. تشكيل طبقة الفيلم رقيقة PLL-g-PEG

  1. مباشرة بعد التجفيف في تيار النيتروجين (أو اختياري الأكسجين البلازما)، ضع واحد coverslip أفقيا في طبق بيتري عقيمة. Pipet في وسط coverlip كمية مناسبة من برنامج تلفزيوني إذابة تخزين PLL-g-PEG-biotin (انظر الجدول 1).
  2. ضع غطاء آخر تم تنظيفه فوق السائل بطريقة شطيرة. لاحظ أن هذه الطريقة تتكون من وجود اثنين من الأغطية احتضان أفلامهم الكيميائية عن طريق توجيه "وجوههم النشطة" المعالجة كيميائيا نحو بعضهم البعض، مفصولة فقط من قبل الطبقة الكيميائية الحالية. تأكد من وجود ما يكفي من السوائل بحيث يتم تعبئة الحجم بين اثنين من الأغطية تماما مع السوائل، ولكن لا تسرب السوائل من بين الأغطية (انظر الجدول 1). "الوجه النشط" من الآن فصاعدا يعين وجوه coverlip التي كانت على اتصال مع السائل في تكوين شطيرة.
  3. ضع غطاء طبق بيتري فوق شطيرة الأغطية واحتضنه في RT لمدة 45-60 دقيقة.
  4. إزالة غطاء طبق بيتري والتقاط شطيرة مع زوج من ملاقط. كن حذرا من قرص السوائل الزائدة. استخدام الإبهام والسبابة لقرصة شطيرة طفيفة والشريحة coverslips في اتجاهين متعاكسين أفقيا فيما يتعلق ببعضها البعض، ثم فصل اثنين من coverslips من بعضها البعض دون لمس الوجوه النشطة.
  5. شطف كلا الوجهين النشطين بالماء فائقة الشراء عن طريق الأنابيب 25 مل من المياه فائقة الشراء على الوجه النشط 2-4x، ومن ثم تجفيف الأغطية مع تيار النيتروجين. تأكد من ملاحظة أي وجوه coverslip نشطة.
  6. الاستفادة من coverlips على الفور، أو تخزين O / N مع الوجه النشط حتى في طبق بيتري العقيمة وضعت في بيئة الرطوبة منخفضة الغبار الحرة.

4. تعزيز ملزم أفيدين

  1. ضع غطاء معالج PLL-g-PEG مع الوجه النشط في طبق بيتري معقم.
  2. ماصة كمية مناسبة من أفيدين إذابة في المخزن المؤقت (أعدت في الخطوة 1.2) على منتصف الوجه النشط.
  3. ضع غطاء آخر (الوجه النشط لأسفل) فوق السائل في طريقة الساندويتش. لاحظ الوجه النشط للأغطية. من المهم أن تكون الوجوه النشطة على اتصال مع السائل أثناء الحضانة (انظر الخطوة 3.2).
  4. ضع غطاء طبق بيتري على شطيرة الأغطية واحتضنه في RT لمدة 25-30 دقيقة.
  5. إزالة غطاء طبق بيتري وفصل اثنين من coverlips كما هو موضح في الخطوة 3.4، مع التأكد من تتبع وعدم لمس الوجوه النشطة.
  6. شطف كل من الوجوه النشطة مع المياه فائقة الشراء عن طريق pipetting 25 مل من المياه فائقة الشراء على الوجه النشط 2-4x ومن ثم تجفيف الأغطية مع تيار النيتروجين. لاحظ الوجه النشط للأغطية. يستخدم على الفور للمرحلة التالية.

ملاحظة هامة: هناك طريقتان متميزتان لإكمال إعداد العينة اعتمادا على نوع المقايسة التي تنطوي عليها التجربة. يجب على المجرب المضي قدما في المرحلة 5A التي يتم فيها تثبيت الفيروس على الزجاج قبل إضافة أي علاج إضافي للأجسام المضادة مطلوب للتصوير فائق الدقة. يصف 5B طريقة بديلة لوضع علامة على الفيروس في الحل قبل تثبيته على الزجاج. يتم إعداد البيانات التمثيلية في هذه المخطوطة باستخدام 5A. يجب اختيار طريقة مناسبة وفقا لنوع الفحص التجريبي.

5A. الوجه النشط الحبل الأجسام المضادة

  1. مباشرة بعد التجفيف مع تيار النيتروجين في المرحلة 4.6، ضع غطاء غطاء معالج avidin الوجه النشط حتى في طبق بيتري معقمة.
  2. ماصة كمية مناسبة من الأجسام المضادة البيوتينية الذائبة في العازلة على منتصف الوجه النشط (انظر الجدول 1).
  3. ضع غطاء آخر (الوجه النشط لأسفل) فوق السائل بطريقة شطيرة. لاحظ الوجه النشط للأغطية ، من المهم أن تكون الوجوه النشطة على اتصال مع السائل لاحتضانه (انظر الخطوة 3.2).
  4. ضع غطاء طبق بيتري فوق شطيرة الأغطية واحتضنه في RT لمدة 45-60 دقيقة.
  5. إزالة غطاء طبق بيتري وفصل اثنين من coverlips كما هو موضح في الخطوة 3.4، مع التأكد من تتبع وعدم لمس الوجوه النشطة.
  6. شطف كل من الوجوه النشطة مع برنامج تلفزيوني عن طريق pipetting 25 مل من برنامج تلفزيوني على الوجه النشط 2-4x، لا تجف واستخدامها على الفور. تأكد من تتبع أي وجوه coverslip نشطة.
  7. ضع غطاء يغطي الوجه النشط المعالج للأجسام المضادة في طبق بيتري معقم ، وماصة كمية مناسبة من الفيروس المذاب في المخزن المؤقت في منتصف الوجه النشط.
  8. ضع غطاء آخر (الوجه النشط لأسفل) فوق السائل بطريقة شطيرة. لاحظ الوجه النشط ، لأنه من المهم أن تكون الوجوه النشطة على اتصال مع السائل لاحتضانه (انظر الخطوة 3.2).
  9. ضع غطاء طبق بيتري فوق شطيرة الأغطية واحتضنه في RT لمدة 45-60 دقيقة.
  10. إزالة غطاء طبق بيتري وفصل اثنين من coverlips كما هو موضح في الخطوة 3.4، مع التأكد من تتبع وعدم لمس الوجوه النشطة.
  11. شطف كل من الوجوه النشطة مع برنامج تلفزيوني عن طريق pipetting 25 مل من برنامج تلفزيوني على الوجه النشط 2-4x. لا تجف coverlips ، بدلا من وضعها في رف تفلون وأكواب مليئة برنامج تلفزيوني على الفور. تأكد من تتبع أي وجوه coverslip نشطة.
  12. استخدم العينات المعدة فورا أو قم بتخزينها في مخزن مؤقت مناسب عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أيام دون فقدان كبير للنزاهة.

    ملاحظة هامة: إذا كان سيتم استخدام العينات في AFM المقايسة، إعداد كاملة ويمكن استخدامها فورا أو تخزينها كما هو موضح في الخطوة 5A.20 - 5A.21. إذا كان للعينات أن تستخدم في فحص التصوير الفلوري فائق الدقة، انتقل إلى وضع العلامات على الأجسام المضادة الموصوفة في الخطوات 5A.12 - 5A.19.
  13. مكان كل من الفيروسات المعالجة coverslips الوجه النشط حتى في طبق بيتري العقيمة وماصة ما يكفي من البروتين حجب العازلة على coverlips إلى حبة حجم السوائل بما فيه الكفاية لتغطية المركزية 95٪ من coverlip دون تدفق أي عازلة حجب قبالة coverslip (عادة 100 -200 ميكرولتر.) احتضان في RT لمدة 60-90 دقيقة.
  14. إزالة بعناية حظر العازلة عن طريق إزالة coverlips واحد في وقت واحد من طبق بيتري وصب السائل الخروج من غطاء في كوب النفايات. كن حذرا من إسقاط غطاء.
  15. شطف كل من الوجوه النشطة مع برنامج تلفزيوني عن طريق pipetting 25 مل من برنامج تلفزيوني على الوجه النشط 2-4x، لا تجف واستخدامها على الفور. تأكد من تتبع أي وجوه coverslip نشطة.
  16. وضع عازلة حظر واحدة معالجة coverslip الوجه النشط حتى في طبق بيتري عقيمة، وماصة كمية مناسبة من الأجسام المضادة الفيروسية المسمى fluorescently في المخزن المؤقت على منتصف الوجه النشط.
  17. ضع غطاء آخر (الوجه النشط لأسفل) على أعلى السائل في طريقة شطيرة. لاحظ الوجه النشط ، من المهم أن تكون الوجوه النشطة على اتصال مع السائل لاحتضانه (انظر الخطوة 3.2).
  18. ضع غطاء طبق بيتري فوق شطيرة الأغطية واحتضنه في RT لمدة 30 دقيقة.
  19. إزالة غطاء طبق بيتري وفصل اثنين من coverlips كما هو موضح في الخطوة 3.4، مع التأكد من تتبع وعدم لمس الوجوه النشطة.
  20. شطف كل من الوجوه النشطة مع برنامج تلفزيوني عن طريق pipetting 25 مل من برنامج تلفزيوني على الوجه النشط 2-4x، لا تجف واستخدامها على الفور. تأكد من تتبع أي وجوه coverslip نشطة.
  21. لا تجف الأغطية ، وبدلا من وضعها في رف تفلون داخل كوب مليء برنامج تلفزيوني. تأكد من تتبع أي وجوه coverslip نشطة.
  22. استخدم العينات المعدة فورا أو قم بتخزينها في مخزن مؤقت مناسب عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أيام دون فقدان كبير للنزاهة.

5ب. في حل هجوم الأجسام المضادة

هذه الطريقة هي تعزيز اختياري لاستراتيجية وضع العلامات للتصوير الفلوري فائق الدقة. من خلال تطبيق هجوم الحل ، يمكن تحقيق طلاء أفضل للأجسام المضادة على السطح الفيروسي.

  1. مزيج حلول الأجسام المضادة في نسب وفقا للتجارب الحاجة. مثال 1:4 نسبة 0.01 ملغم /مل الأجسام المضادة البيوتينية إلى 0.01 ملغ / مل الأجسام المضادة المسمى fluorescently سيعطي تقارب ملزمة جيدة والسماح لاسترداد مغلف جيدة في فحص التصوير فائقة الدقة.
  2. مزيج أجزاء متساوية من الأجسام المضادة والفيروسات الحلول على التوالي أعدت في (5B.1) و (1.3). مزيج بلطف عن طريق pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات في aliquot. يمكن تخزين هذا الحل الناتج حتى الحاجة لمدة تصل إلى 24 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  3. عند الانتهاء من الخطوة 4.6، ضع غطاء معالج avidin مع الوجه النشط حتى في طبق بيتري معقمة.
  4. ماصة كمية مناسبة من الفيروس مع حل الأجسام المضادة (أعدت في الخطوة 5B.2) على منتصف الوجه النشط.
  5. ضع غطاء آخر (الوجه النشط لأسفل) فوق السائل بطريقة شطيرة. لاحظ الوجه النشط ، لأنه من المهم أن تكون الوجوه النشطة على اتصال مع السائل لاحتضانه (انظر الخطوة 3.2).
  6. ضع غطاء طبق بيتري فوق شطيرة الأغطية واحتضنه في RT لمدة 45-60 دقيقة.
  7. إزالة غطاء طبق بيتري وفصل اثنين من coverlips كما هو موضح في الخطوة 3.4، مع التأكد من تتبع وعدم لمس الوجوه النشطة.
  8. شطف كل من الوجوه النشطة مع برنامج تلفزيوني عن طريق pipetting 25 مل من برنامج تلفزيوني على الوجه النشط 2-4x. لا تجف coverlips ، بدلا من وضعها في رف تفلون وأكواب مليئة برنامج تلفزيوني على الفور. تأكد من تتبع أي وجوه coverslip نشطة.
  9. استخدم العينات المعدة على الفور أو قم بتخزينها عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أيام دون فقدان كبير للنزاهة.

6. القوة الذرية قياس خصائص المواد المجهرية

  1. قم بتشغيل ليزر AFM وافتح برنامج AFM. حدد وضع المسح الضوئي المناسب للمقايسة المطلوبة من مربع الحوار الافتتاحي. يجب فتح كافة الإطارات الضرورية بشكل افتراضي; إذا لم يكن راجع دليل المستخدم الخاص بك من أجل فتح النوافذ المطلوبة.
  2. حدد cantilever مناسبة للقياس المطلوب وإدراجه في السكن cantilever وفقا للمبادئ التوجيهية للشركة المصنعة. هناك مجموعة واسعة من الشروط وأنواع التجارب التي توجد مجموعة متنوعة من cantilevers. يجب على المجرب البحث عن الكانتيليفير وفقا لحاجتهم.
  3. إدراج السكن cantilever في رئيس AFM وفقا للمبادئ التوجيهية للشركة المصنعة.
  4. إذا كان سيتم استخدام العينة تحت ظروف رطبة، قم بإزالة العينة من المخزن المؤقت للتخزين ثم انتقل إلى الخطوة 6.7.
  5. إذا كان للعينة أن تستخدم في ظل ظروف المحيطة (الجافة)، وإزالة العينة من المخزن المؤقت وشطف لفترة وجيزة عن طريق غمس في كوب من المياه فائقة النحافة. ملاحظة: هذا سوف يترك طبقة ترطيب رقيقة على العينة التي قد تحفز جاذبية الشعرية مع cantilevers وجود ثابت الربيع منخفضة.
  6. إذا كان للعينة أن تستخدم في الظروف المحيطة (الجافة)، الجافة بلطف العينة مع تيار النيتروجين.
  7. قم بتجفيف الجانب الخلفي من الغطاء برفق بورق فلتر خال من الغبار، مع التأكد من عدم لمس الوجه النشط للعينة.
  8. ضع العينة في حامل عينة AFM المناسب، ثم ضع العينة على مرحلة AFM.
  9. إذا كان للعينة أن تكون صورة في ظل ظروف رطبة، ماصة كمية صغيرة من المخزن المؤقت على وسط العينة (~ 10 ميكرولتر).
  10. ضع رأس AFM فوق العينة.
  11. إذا كانت العينة رطبة، تأكد من أن طرف cantilever و AFM تخترق الطبقة السطحية، وأنه لا توجد فقاعات بين السكن cantilever و cantilever.
  12. محاذاة ليزر AFM مع cantilever وفقا لتوصيات الشركة المصنعة من أجل الحصول على إشارة الأمثل.
  13. قياس تردد الرنانة cantilever وتعيين تردد المسح الضوئي وفقا لنوع التجربة.
  14. خفض تلميح AFM إلى السطح وتحسين إعدادات الإشارة.
  15. إجراء مسح AFM مربع 20 ميكرومتر في الوضع الذي تختاره. تم استخدام وضع النقر (AC) في إنشاء بيانات تمثيلية. تحديد المرشحين للفيروس حسب الارتفاع التقريبي ، والتي يمكن أن ينظر إليها عادة على أنها طفرات حادة على السطح الزجاجي.
  16. حدد مرشح الفيروسات ومركز رئيس المسح فوقه.
  17. إجراء مسح مربع 250 نانومتر (أو فحص فائق الدقة المناسبة) حول الفيروس المحدد من أجل الحصول على طبولوجيا والتوجه.
  18. حدد نقطة على الفيروس لقياس الخصائص المادية(على سبيل المثال مركز فيروس كروي لقياس معامل يونغ) وإجراء القياس وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة.

7. فائقة الدقة طريقة التصوير

  1. افتح برنامج التصوير فائق الدقة ومعايرة البرنامج وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
  2. معايرة معدات التصوير فائقة الدقة وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة باستخدام حبات الفلورسنت.
  3. تجميع المخزن المؤقت للتصوير العينة من المخزون قبل التصوير مباشرة عن طريق الجمع بين 50 ميكرولتر من 1 M MEA و 100 ميكرولتر من 10x Gloxy إلى 850 ميكرولتر من المخزن المؤقت للمخزون. الحفاظ على التصوير العازلة على الجليد لمدة التجربة.
  4. إزالة غطاء المعدة مع عينة من المخزن المؤقت وشطفه 5x عن طريق غمسه في كوب من المياه فائقة البور.
  5. جفف الوجه غير النشط للأغطية باستخدام ورق فلتر خال من الغبار. تأكد من عدم لمس الوجه النشط.
  6. أدخل في حامل عينة نظام التصوير وأضف 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتصوير إلى حامل العينة. من المعقول تبادل المخزن المؤقت للتصوير على العينة كل ساعتين للحفاظ على نتائج متسقة.
  7. قم بتغطية حامل العينة بالبارافيلم لتقليل التفاعل الجوي مع بيئة الغرفة.
  8. ضع حامل العينة في معدات التصوير للتصوير.
  9. جلب العينة في التركيز باستخدام توجيهات الشركة المصنعة.
  10. صورة العينة وفقا لتقنية فائقة الدقة المستخدمة. تأكد من ضبط ظروف التصوير لتحسين الإشارة مع تقليل التنشيط المتزامن للفلوروفورات القابلة للتبديل بالصور.

    ملاحظة هامة: تعتمد ظروف التصوير على العينة وتختلف وفقا للحاجة التجريبية. تجربة نموذجية باستخدام اليكسا 647 تهيئة بكفاءة إلى حالتها المظلمة في المخزن المؤقت التصوير يمكن بعد ذلك أن تكون الصورة تنشيط من خلال تطبيق 405 نانومتر ضوء الأشعة فوق البنفسجية. يتم الحصول على الصور من خلال مجموعة فرعية متناثرة مثيرة من جزيئات Alexa 647 داخل عينة ذات علامات كثيفة وتوطين كل فلوروفور بدقة محدودة في المقام الأول بعدد الضوئيات التي تم جمعها. يتم تكرار هذا الإجراء بشكل متكرر من قبل البرنامج حتى يحدث العدد المطلوب من دورات الاستحواذ. يجب أن يكون لدى المجرب هذا الإعداد يرتبط بكل فلوروفور في العينة بعد أن تم تبييض الصورة.
  11. عند الانتهاء من التصوير، أغلق معدات التصوير وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة. قد يترك البرنامج مفتوحا لتحليل البيانات.
  12. ويعتمد تحليل البيانات اعتمادا كبيرا على التجربة؛ ومع ذلك ، في جميع الحالات تحديد الفيروسات من خلال عرضها الكامل في نصف الحد الأقصى ، وهو ما يقارن إلى أبعاد الفيروسات المعروفة ، مع التأكد من أن تأخذ في الاعتبار حجم إضافي من التسميات الفلورية.
  13. للحصول على تصور أفضل، يمكنك عرض العينات باستخدام خيار تقديم Isosurface أو خيار التقديم الحجمي، وكلاهما موجود عادة في برنامج التصوير فائق الدقة.

Representative Results

التصوير أحادي ال virion باستخدام AFM:

تم استخدام بروتوكول إعداد العينة المبين أعلاه في تثبيت virions نوع البرية إلى السطح الزجاجي. VSV virions هي رصاصة على شكل 180 نانومتر في الطول وقطرها 80 نانومتر. كما أن هناك مجموعة متنوعة من virions التي يمكن تطبيق هذه التقنية، كما يتضح هذا المفهوم هنا على الخرز 36 نانومتر البيوتينية كذلك. تظهر تجارب AFM الناتجة في الشكل 1. من المهم ملاحظة أن VIRIONS VSV لديها معامل يونغ أقل (100 MPa) مقارنة مع الفيروسات غير المفلوثة (GPa). تم الحصول على صور خاصة من VSV virion واحد تحت وضع التنصت في الظروف المحيطة مع cantilever قاسية. وكان الهدف هو تشويه الفيروس لدرجة أن كثافة البروتين الإضافية داخل الفيروس تصبح مرئية كعثرة داخل صورة AFM. وتستخدم هذه الطريقة للكشف عن كثافة البروتين اضافية داخل تجويف الفيروس19.

تصوير أحادي الدقة فائق الدقة:

تم استخدام الأجسام المضادة ALEXA 647 المسمى VSV-G لمعطف مغلف virions VSV الفردية للتجارب فائقة الدقة باستخدام الطريقة 5A. لإظهار كثافة الربط وربط غير محدد منخفضة، يتم عرض مسح كبير للعينة في الشكل 2A. يظهر استرداد المغلف الفيروسي على virion تمثيلي في الشكل 2B (الأزرق isosurface).

Figure 1

الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 AFM التصوير من الخرز وVSV على سطح PEGG وظيفية. AFM مسح 36 نانومتر الخرز البيوتينية(A, B)وVIRION VSV (C) راسية على السطح مع الأجسام المضادة VSVG البيوتينية. تم إجراء AFM في وضع مسح تضاريس الهواء AC. نصف قطر الطرف هو <25 نانومتر وأجريت القياسات تحت تعديل القوة والتنصت الخفيف. وكان الطرف ثابت قوة 3 N / m والتردد الرنانة 75 كيلوهرتز مع عدم اليقين من 15 كيلوهرتز. في حين احتفظت الخرز بطولها أثناء فحص AFM ، فإن VIRION VSV يحتوي على معامل أصغر بكثير للشباب ومشوه بشكل كبير في الطول. في هذه الصورة تم تصوير virion على وجه التحديد مع cantilever قاسية في وضع التنصت التي أنتجت التواء xy صغيرة (تستخدم لتحديد طرف مقابل نهاية حادة من الفيروس) ويتم استخدام فرق الارتفاع بين طرف ونهاية حادة من الفيروس للكشف عن كثافة البروتين اضافية في نهاية حادة من الفيروس19.

Figure 2
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم التصوير القائم على الفلورسينس من virions VSV على سطح PEGG وظيفية. أ)virions VSV المؤتلف شلت على سطح PEGG باستخدام الأجسام المضادة VSVG البيوتينية المصورة في مجال واسع مضان. ب)إعادة بناء مضان عالية الدقة من مغلف VSV تعلق على سطح PEGG من خلال جسم مضاد VSVG البيوتينية وزينت مع اليكسا 647 وصفت الأجسام المضادة VSVG (تم استخدام الطريقة 5A لخلق هذه الصور). السطح الأزرق هو إسقاط 2D isosurface. يظهر اليسار نموذجا للفيروس على شكل رصاصة. 

حجم غطاء الغطاء مائع
40 ملم 65 ميكرولتر
35 ملم 50 ميكرولتر
30 ملم 36 ميكرولتر
25 ملم 25 ميكرولتر
20 ملم 16 ميكرولتر

الجدول 1 - الجداول السائل aliquots وفقا لحجم الغطاء.

Discussion

يمكن استخدام التصوير أحادي الفيروسات باستخدام AFM والتصوير الفلوري عالي الدقة كمنهجية بديلة للتصوير المقطعي CryoEM. ولكل منهجية من هذه المنهجيات نقاط قوتها المحددة. على سبيل المثال يمكن القيام به AFM على virions WT مع عدم وجود شرط على وضع علامات على العينة أو البروتينات الفيروسية الداخلية. موقع الهياكل الفيروسية هو deconvolved من مساهماتها في خصائص مرنة من virion.

واحد virion فائقة الدقة التصوير في تركيبة مع النهج الوراثية الفيروسية العكسية وضعت حديثا يصبح تقنية قوية لتوطين انخفاض عدد نسخة البروتينات الفيروسية20. يمكن إجراء الفيروسات المؤتلفة مع استبدال بروتيناتها مع البروتينات المنصهرة في البروتينات الفلورية وتنقيتها باستخدام هذه النهج الوراثية العكسية. على الرغم من أن التصوير فائق الدقة له خصوصية ويرجع ذلك جزئيا إلى وضع العلامات الجينية ، فإنه يتطلب استخدام الفيروسات المتحولة.

AFM والتصوير فائق الدقة هي أساليب مجانية تستخدم استعدادات عينة مشابهة جدا. الأساليب المبينة في هذه الورقة، والتي اعتمدت شكل في وقت سابق من مقايسات التصوير جزيء واحد، تسمح ترسيخ virions واحد مع آثار قليلة على طوبولوجيا virions.

Disclosures

ولا توجد مصالح مالية متنافسة للمؤلفين في هذه الورقة.

Acknowledgments

نشكر الدكتور تيل بوكينغ على بروتوكول إعداد الجزيء الواحد الأصلي. تم دعم هذا العمل من قبل NSF منحة 1121972 (SS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass coverslips (fPALM) Electron Microscopy Services 72225-01 25 mm Coverslips
PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)  SuSoS - Stock: 0.5 mg/ml in PBS
NeutrAvidin biotin-binding protein Invitrogen A2666 Stock: 0.25 mg/ml in PBS
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)  Invitrogen A21245 1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer
α-VSV-G  Invitrogen ab34774 1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer
Gluox Sigma G2133-250KU Glucose oxidase type seven from Aspergillius 
Catalase Sigma C40-100mg Catalase from Bovine liver 
MEA Sigma 30070-10G Cysteamine (MEA
Stock Buffer 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 10 mM NaCl + 10% glucose
NTE 10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA
Slide-A-Lyzer, mini dialysis unit Thermo Scientific 10,000 MW
Microscope Cover Glass: 35 CIRCLE #1 Fisherbrand 35 CIRCLE #1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pang, H. -B., et al. Virion stiffness regulates immature HIV-1 entry. Retrovirology. 10, 4 (2013).
  2. Kol, N., et al. A Stiffness Switch in Human Immunodeficiency Virus. Biophys. J. 92, 1777-1783 (2007).
  3. Ortega-Esteban, A., et al. Minimizing tip–sample forces in jumping mode atomic force microscopy in liquid. Ultramicroscopy. 114, 56-61 (2012).
  4. Ortega-Esteban, A., et al. Monitoring dynamics of human adenovirus disassembly induced by mechanical fatigue. Sci. Rep. 3, (2013).
  5. Hernando-Pérez, M., et al. Physical Virology: Direct Measurement of Phage. phi29 Stiffness Provides Evidence of Internal Pressure (Small 15/2012). Small. 8, 2365-2365 (2012).
  6. Carrasco, C., et al. DNA-mediated anisotropic mechanical reinforcement of a virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13706-13711 (2006).
  7. Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption. Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).
  8. Visnapuu, M. -L., Duzdevich, D., Greene, E. C. The importance of surfaces in single-molecule bioscience. Mol. Biosyst. 4, 394-403 (2008).
  9. Elenko, M. P., Szostak, J. W., Van Oijen, A. M. Single-molecule binding experiments on long time scales. Rev. Sci. Instrum. 81, (2010).
  10. van Oijen, A. M., et al. Single-Molecule Kinetics of λ Exonuclease Reveal Base Dependence and Dynamic Disorder. Science. 301, 1235-1238 (2003).
  11. Böcking, T., Aguet, F., Harrison, S. C., Kirchhausen, T. Single-molecule analysis of a molecular disassemblase reveals the mechanism of Hsc70-driven clathrin uncoating. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 295-301 (2011).
  12. Cocucci, E., Aguet, F., Boulant, S., Kirchhausen, T. The First Five Seconds in the Life of a Clathrin-Coated Pit. Cell. 150, 495-507 (2012).
  13. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. 3, 793-795 (2006).
  14. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  15. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy. Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).
  16. Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat. Methods. 5, 527-529 (2008).
  17. Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. Actin, Spectrin, and Associated Proteins Form a Periodic Cytoskeletal Structure in Axons. Science. 339, 452-456 (2013).
  18. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
  19. Hodges, J., et al. Asymmetric packaging of polymerases within vesicular stomatitis virus. Biochemical and Biophysical Research Communications. 440, 271-276 (2013).
  20. Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).

Tags

البروتوكول الأساسي، العدد 83، AFM، التصوير الفلوري فائق الدقة، تصوير فيروس واحد، fPALM، dSTORM، PALM
إعداد عينة للفحص المجهري للقوة الذرية Virion واحد والتصوير الفلوري فائقة الدقة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hodges, J. A., Saffarian, S. Sample… More

Hodges, J. A., Saffarian, S. Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging. J. Vis. Exp. (83), e51366, doi:10.3791/51366 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter