Summary
Fastgørelse af virioner på en overflade er et krav for enkelt virion imaging ved Super-opløsning fluorescens imaging eller atomare kraft mikroskopi (AFM). Her demonstrerer vi en prøveforberedelsesmetode til kontrolleret vedhæftning af virions til glasoverflader, der er egnede til brug i AFM og fluorescensbilleddannelse i superopløsning.
Abstract
Immobilisering af virions til glasoverflader er et kritisk skridt i enkelt virion imaging. Her præsenterer vi en teknik, der er vedtaget fra enkeltmolekyle billeddiagnostiske assays, som gør det muligt vedhæftning af enkelt virions til glasoverflader med specificitet. Dette præparat er baseret på podning af glassets overflade med en blanding af PLL-g-PEG og PLL-g-PEG-Biotin, tilsætning af et lag af avidin og endelig oprettelse af virionsankre gennem fastgørelse af biotinylerede virusspecifikke antistoffer. Vi har anvendt denne teknik på tværs af en række eksperimenter, herunder atomare kraft mikroskopi (AFM) og super-opløsning fluorescens imaging. Denne prøveforberedelsesmetode resulterer i en kontrol vedhæftning af virionerne til overfladen.
Introduction
Afgiftsbaserede uspecifikke interaktioner anvendes rutinemæssigt til vedhæftning af virioner i atomkraftmikroskopi1,2. Disse teknikker fungerer især godt, når de bruges på ikke-virioner med meget stive kapitler3-6. Selv om disse teknikker er meget effektive til at immobilisere prøven, forhindrer de ikke uspecifik binding af proteiner til overfladen. Den uspecifikke binding kan skabe et problem, når du forsøger at afbilde virions med AFM og superopløsnings fluorescensteknikker, der kræver inkubationer af prøven med forskellige antistoffer. Her skitserer vi en prøveforberedelsesmetode til specifik immobilisering af virions.
Poly(ethylenglycol) (PEG) podet til poly(L-lysin) (PLL) og adsorberet på en glasoverflade giver en betydelig blok for de elektrostatiske interaktioner mellem proteiner med glas7. Enkelt molekyle assays, som kræver immobilisering af enkelt molekyler på glasoverflader har draget fordel af denne egenskab og brugt den til at skabe en specifik PEG baseret enkelt molekyle immobilisering teknik8-10. Dette præparat blev også brugt til at immobilisere clathrinbure på glasoverfladen11 samt skabe en homogen fibronectinbelægning til kontrolcelle vedhæftning 12.
Vi har vedtaget prøveforberedelsesmetoden baseret på PLL-g-PEG-adsorption til glasoverflader fra enkeltmolekylebilleddannelsesmetoder og anvendt den på billeddannelse af enkelt virions af vesikulær stomatitisvirus (VSV). Disse enkelt virions blev afbildet ved hjælp af atomare kraft mikroskopi (AFM). Lignende eksperimenter blev også udført på funktionaliserede perler som en kontrol. Virionerne blev også afbildet af superopløsnings fluorescensmikroskopi, hvor et VSV-G-antistof mærket med Alexa 647 blev brugt til at skabe et billede af konvolutten af enkelt virions. Fluorescerende billeddannelse med høj opløsning bruger lokalisering af enkelte molekyler til at oprette et billede13-15. fPALM bi-planar imaging gør det muligt at lokalisere enkelte molekyler med 20 nm i plan og 50 nm opløsning langs den optiske akse15,16. Denne to-planar teknik blev brugt til at billedet super-opløsning fluorescerende billeder til stede i denne undersøgelse. En alternativ teknik, der har lignende resultater, er STORM13,17,18.
Både AFM- og superopløsningsfluorescerende billeder af VSV forankret i glasset ved de procedurer, der er skitseret i dette dokument, viste specifik binding af virions til glasset med minimale uspecifikke interaktioner19. Her præsenterer vi prøveforberedelsesprotokollerne til AFM- og superopløsnings-fluorescerende billedeksperimenter. Kort sagt: Rene glasovertræk er funktionaliseret ved adsorbering en blanding af PLL-g-PEG og PLL-g-PEG-biotin. Det er typisk for denne tynde film, der skal manipuleres til at give mellem 15-25% funktionaliseret biotin på en belagt overflade. Coverlips inkuberes yderligere med tetramerisk avidin. Et biotinyleret viralt antistof bruges derefter til at skabe et unikt bindingssted for virionerne. Binding af antistoffet kan gøres på to måder.
Den første metode er optimeret til AFM, men den forbliver velegnet til fluorescensbilleddannelse i superopløsning. I denne metode behandles den avidinbelagte overflade med biotinyleret antistof før viral vedhæftning. De immobiliserede virions behandles med Alexa 647 mærket antistof til at dække konvolutten og tillade superopløsning fluorescens billeddannelse af virions.
Den anden metode er at angribe virus i opløsning med det biotinylerede antistof og Alexa 647 mærket antistof, før viraene klæbes til den avidinbehandlede overflade; denne metode er optimeret til fluorescensbilledeksperimenter i superopløsning, hvor det er vigtigt at gendanne den virale konvolut. Denne metode har den fordel, at den tillader ensartet antistofbelægning på den virale overflade. Det biotinylerede antistof kan blandes med Alexa 647-mærkede virale antistoffer i forhold, der giver mulighed for tilstrækkelig adsorption af virusset til den avidinbehandlede overflade, samtidig med at der opretholdes en høj koncentration af fluorescerende etiket på ydersiden af den virale kuvert. Disse Alexa 647-mærkede virale antistoffer biotinyleres ikke, og deres overskud kan skylles væk for at reducere baggrundsstøj.
Protocol
1. Kemi forberedelse
- Forberedelse og opbevaring af PLL-g-PEG-Biotin og avidin:
- Polymeren PLL-g-PEG-biotin opløses i PBS-buffer i henhold til producentens anvisninger i en koncentration på 1,0 mg/ml.
- Aliquot efter dækslets størrelse (se tabel 1)og opbevares ved -80 °C i op til et år.
- Forberedelse og opbevaring af Avidin/NeutrAvidin
- Den umærkede Avidin/NeutrAvidin opløses i PBS-buffer i henhold til fabrikantens anvisninger i en koncentration på 1,0 mg/ml.
- Aliquot efter dækslets størrelse (se tabel 1)og opbevares ved -20 °C i op til 3 år.
- Virusprøveforberedelse: Forbered virusprøver i henhold til eksperimentelt behov og laboratorieprotokol forud for denne analyse. Brug trin 1.3.1 til metode 5A eller 1.3.2 til metode 5B.
- Forbered virusprøver til metode 5A forud for fase 2. Der anvendes tilberedte virusprøver senest 1-2 dage efter tilberedningen eller i henhold til dækslets glidestørrelse (se tabel 1),og der føres derefter fryse i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C i op til et år. Når optøet, brug straks.
- Der fremstilles virusprøver til metode 5B svarende til 1.3.1. Aliquots af virus opødes før 5B og opbevares ved 4 °C højst 24 timer inden blanding med antistoffer.
- Forbered passende biotinylerede antistoffer til forsøget.
2. Coverlip Rengøring som forberedelse til kemisk behandling
- Placer coverlips i en passende størrelse Teflon coverslip rack, der holder dem i lodret retning og nedsænke dem i et bægerglas fyldt med filtreret (0,2 μm) ethylalkohol (190 bevis).
- Sonicate coverlips i den filtrerede ethylalkohol (190 bevis) i 30 min.
- Fjern coverslips fra alkohol og skyl coverslips omfattende med ultrapure vand.
- Placer skyllede coverslips i en separat ren Teflon rack og bægerglas fyldt med 1 M NaOH.
- Sonicate coverlips i 1 M NaOH i 30 min.
- Fjern coverslips fra NaOH og skyl dem meget med ultrapure vand.
- Tør de skyllede coverslips med en nitrogenstrøm, og læg dem i et rent, tørt Teflon rack.
- Undersøg coverlips for synlige film eller partikler, der forbliver på coverlip. Hvis der er synligt materiale tilbage, er coverlip'en ikke blevet ordentligt rengjort og skyllet. Hvis ikke korrekt rengjort gentage trin 2.1-2.7.
- Rengør coverslips med ilt-plasma i 2 min. Dette trin er valgfrit, men anbefales.
3. Dannelse af PLL-g-PEG tyndfilmslag
- Umiddelbart efter tørring i nitrogenstrømmen (eller det valgfrie iltplasma) anbringes et coverlip vandret i en steril petriskål. Pipet i midten af dækslet en passende mængde optøet PBS buffered PLL-g-PEG-biotin (se tabel 1).
- Placer en anden renset coverslip oven på væsken i en sandwich metode. Bemærk, at denne metode består i at have to coverslips inkubere deres kemiske film ved at orientere deres kemisk behandlede "aktive ansigter" mod hinanden, kun adskilt af det nuværende kemiske lag. Sørg for, at der er tilstrækkelig væske til, at lydstyrken mellem de to coverlips er helt fyldt med væske, men at der ikke siver væske ud mellem dækslerne (se tabel 1). Den "aktive ansigt" fremover betegner coverslip ansigter, som har været i kontakt med væsken i sandwich konfiguration.
- Læg låget af Petri parabol over coverslip sandwich og inkubere på RT i 45-60 min.
- Fjern låget af Petri parabol og afhente sandwich med et par pincet. Pas på ikke at klemme overskydende væske ud. Brug tommelfingeren og pegefingeren til at klemme sandwichen let og skub coverlips i modsatte retninger vandret i forhold til hinanden, og adskil derefter de to coverlips fra hinanden uden at røre ved de aktive ansigter.
- Skyl begge aktive ansigter med ultrapure vand ved at pipette 25 ml ultrapure vand over det aktive ansigt 2-4x, og tør derefter coverlips med en nitrogenstrøm. Sørg for at bemærke, hvilke coverslip-flader der er aktive.
- Udnyt coverlips straks, eller opbevar O / N med den aktive ansigt op i en steril Petri parabol placeret i en støvfri lav luftfugtighed miljø.
4. Avidin bindende forbedring
- Placer en PLL-g-PEG behandlet coverslip med aktivt ansigt op i en steril petriskål.
- Pipetter en passende mængde optøet avidin i buffer (tilberedt i trin 1.2) på midten af det aktive ansigt.
- Placer en anden coverslip (aktiv ansigt nedad) oven på væsken i sandwich metode. Bemærk den aktive ansigt coverlips. Det er vigtigt, at de aktive ansigter er i kontakt med væsken under inkubationen (se trin 3.2).
- Læg låget af petriskålen over coverslip sandwich og inkuber på RT i 25-30 min.
- Fjern petriskålens låg og adskil de to coverslips som beskrevet i trin 3.4, og sørg for at holde styr på og ikke røre ved de aktive ansigter.
- Skyl begge aktive ansigter med ultrapure vand ved at pipette 25 ml ultrapure vand over det aktive ansigt 2-4x og tør derefter coverlips med en nitrogenstrøm. Bemærk den aktive ansigt coverlips. Brug straks til næste fase.
VIGTIG BEMÆRKNING: Der findes to forskellige metoder til at afslutte prøveforberedelsen afhængigt af den type analyse, som forsøget indebærer. Forsøgsbehandleren skal fortsætte med fase 5A, hvor virusset er forankret i glasset, før der tilsættes yderligere antistofbehandling, der kræves til billeddannelse i superopløsning. 5B beskriver en alternativ metode til mærkning af virus i opløsning, før forankring det til glasset. De repræsentative data i dette manuskript udarbejdes ved hjælp af 5A. Der bør vælges en passende metode efter forsøgsanalysetype.
5A. Aktivt ansigtsantistof tøjr
- Umiddelbart efter tørring med en nitrogenstrøm i fase 4.6, placere en ivrig behandlet coverslip aktiv med billedsiden op i en steril Petri parabol.
- Der pipettes en passende mængde optøet biotinyleret antistof i buffer på midten af det aktive ansigt (se tabel 1).
- Placer en anden coverslip (aktiv ansigt nedad) oven på væsken i en sandwich metode. Bemærk den aktive ansigt coverlips, er det vigtigt de aktive ansigter er i kontakt med væsken til inkubation (se trin 3.2.).
- Læg låget af Petri parabol over coverslip sandwich og inkubere på RT i 45-60 min.
- Fjern petriskålens låg og adskil de to coverslips som beskrevet i trin 3.4, og sørg for at holde styr på og ikke røre ved de aktive ansigter.
- Skyl begge aktive flader med PBS ved at pipetter 25 ml PBS over det aktive ansigt 2-4x, tør ikke og brug det samme. Sørg for at holde styr på, hvilke coverslip-flader der er aktive.
- Placer et antistofbehandlet coverlip aktivt med forsiden nedad i en steril petriskål, og pipette en passende mængde optøet virus i buffer på midten af det aktive ansigt.
- Placer en anden coverslip (aktiv ansigt nedad) oven på væsken i en sandwich metode. Bemærk det aktive ansigt, da det er vigtigt, at de aktive ansigter er i kontakt med væsken til inkubation (se trin 3.2.).
- Læg låget af Petri parabol over coverslip sandwich og inkubere på RT i 45-60 min.
- Fjern petriskålens låg og adskil de to coverslips som beskrevet i trin 3.4, og sørg for at holde styr på og ikke røre ved de aktive ansigter.
- Skyl begge aktive flader med PBS ved at pipetter 25 ml PBS over det aktive ansigt 2-4x. Tør ikke coverlips, i stedet placere dem i en Teflon rack og bægerglas fyldt med PBS straks. Sørg for at holde styr på, hvilke coverslip-flader der er aktive.
- De forberedte prøver anvendes straks eller opbevares i en passende buffer ved 4 °C i op til tre dage uden væsentlig mistede integritet.
Vigtig bemærkning: Hvis prøverne skal anvendes i en AFM-analyse, er præparatet færdigt, og de kan anvendes med det samme eller opbevares som beskrevet i trin 5A.20 - 5A.21. Hvis prøverne skal anvendes i en fluorescensbilledanalyse i superopløsning, skal du gå videre til den antistofmærkning, der er beskrevet i trin 5A.12 - 5A.19. - Placer begge virusbehandlede coverlips aktive med forsiden op i en steril petriskål og pipet nok proteinblokeringsbuffer på coverlips til at perle nok væskevolumen til at dække de centrale 95% af coverlipet uden at flyde nogen blokeringsbuffer fra coverlipet (typisk 100 - 200 μl.) Inkuber på RT i 60-90 min.
- Fjern forsigtigt blokeringsbufferen ved at fjerne coverslips en ad gangen fra petriskålen og hælde væsken ud af dækslet i et affaldsbæger. Pas på ikke at tabe coverlip.
- Skyl begge aktive flader med PBS ved at pipetter 25 ml PBS over det aktive ansigt 2-4x, tør ikke og brug det samme. Sørg for at holde styr på, hvilke coverslip-flader der er aktive.
- Placer en enkelt blokerende buffer behandlet coverslip aktiv med billedsiden op i en steril Petri parabol, og pipette en passende mængde fluorescerende mærket viral antistof i buffer på midten af det aktive ansigt.
- Placer en anden coverslip (aktiv ansigt nedad) på toppen af væsken i en sandwich metode. Bemærk, hvilket ansigt der er aktivt, det er vigtigt, at de aktive ansigter er i kontakt med væsken til inkubation (se trin 3.2).
- Læg låget af petriskålen over coverslip sandwich og inkuber på RT i 30 min.
- Fjern petriskålens låg og adskil de to coverslips som beskrevet i trin 3.4, og sørg for at holde styr på og ikke røre ved de aktive ansigter.
- Skyl begge aktive flader med PBS ved at pipetter 25 ml PBS over det aktive ansigt 2-4x, tør ikke og brug det samme. Sørg for at holde styr på, hvilke coverslip-flader der er aktive.
- Tør ikke coverlips, i stedet placere dem i en Teflon rack i et bægerglas fyldt med PBS. Sørg for at holde styr på, hvilke coverslip-flader der er aktive.
- De forberedte prøver anvendes straks eller opbevares i en passende buffer ved 4 °C i op til tre dage uden væsentlig mistede integritet.
5B. Angreb mod opløsningsantistof
Denne metode er en valgfri forbedring af mærkningsstrategien for fluorescerende billedbehandling i superopløsning. Ved at anvende i opløsning angreb, bedre antistof belægning på den virale overflade kan opnås.
- Bland antistofopløsninger i forhold efter forsøgsbehov. Eksempel 1:4-forholdet på 0,01 mg/ml biotinyleret antistof til 0,01 mg/ml fluorescerende mærket antistof vil give en god bindende affinitet og give mulighed for god kuvertgenvinding i en billedanalyse med superopløsning.
- Der blandes lige store portioner af henholdsvis antistof- og virusopløsningerne i (5B.1) og (1.3). Bland forsigtigt ved pipettering op og ned et par gange i aliquot. Denne resulterende opløsning kan opbevares, indtil det er nødvendigt i op til 24 timer ved 4 °C.
- Når trin 4.6 er afsluttet, skal du placere en ivrig behandlet coverlip med aktivt ansigt op i en steril petriskål.
- Pipetter en passende mængde virus med antistofopløsning (fremstillet i trin 5B.2) på midten af det aktive ansigt.
- Placer en anden coverslip (aktiv ansigt nedad) oven på væsken i en sandwich metode. Bemærk det aktive ansigt, da det er vigtigt, at de aktive ansigter er i kontakt med væsken til inkubation (se trin 3.2).
- Læg låget af Petri parabol over coverslip sandwich og inkubere på RT i 45-60 min.
- Fjern petriskålens låg og adskil de to coverslips som beskrevet i trin 3.4, og sørg for at holde styr på og ikke røre ved de aktive ansigter.
- Skyl begge aktive flader med PBS ved at pipetter 25 ml PBS over det aktive ansigt 2-4x. Tør ikke coverlips, i stedet placere dem i en Teflon rack og bægerglas fyldt med PBS straks. Sørg for at holde styr på, hvilke coverslip-flader der er aktive.
- Der anvendes straks eller opbevares forberedte prøver ved 4 °C i op til tre dage uden væsentlig mistede integritet.
6. Atomic Force Mikroskopi Materiale Ejendom Måling
- Tænd for AFM-laserne, og åbn AFM-softwaren. Vælg den relevante scanningstilstand for den ønskede analyse i åbningsdialogboksen. Alle nødvendige vinduer skal åbnes som standard. hvis ikke se i brugervejledningen for at åbne de ønskede vinduer.
- Vælg en cantilever, der passer til den ønskede måling, og indsæt den i udliggerhuset i overensstemmelse med producentens retningslinjer. Der er en bred vifte af betingelser og eksperimenttyper, hvor der er en række cantilevers. Eksperimentatoren bør forske cantilevers efter deres behov.
- Sæt udligningshuset i AFM-hovedet i overensstemmelse med producentens retningslinjer.
- Hvis prøven skal anvendes under våde forhold, skal prøven fjernes fra lagerbufferen og fortsættes til trin 6.7.
- Hvis prøven skal anvendes under omgivende (tørre) forhold, skal prøven tages ud af opbevaringsbufferen og skylles kortvarigt ved at dyppe den i et bægerglas ultrapurt vand. Bemærk: Dette vil efterlade et tyndt hydreringslag på prøven, som kan fremkalde kapillær attraktion med cantilevers med en lav fjederkonstant.
- Hvis prøven skal anvendes under omgivende (tørre) forhold, skal prøven forsigtigt tørres med en nitrogenstrøm.
- Tør forsigtigt bagsiden af coverlipet med et støvfrit filterpapir, og sørg for ikke at røre prøvens aktive ansigt.
- Prøven anbringes i den relevante AFM-prøveholder, og prøven anbringes derefter på AFM-stadiet.
- Hvis prøven skal afbildes under våde forhold, pipettes en lille mængde buffer på prøveemnets midte (~10 μl).
- Placer AFM-hovedet over prøven.
- Hvis prøven er våd, skal du sørge for, at cantilever og AFM spids trænger ind i overfladelaget, og at der ikke er bobler mellem cantilever og cantilever boliger.
- Juster AFM-laseren med udkragede i overensstemmelse med producentens anbefalinger for at opnå det optimale signal.
- Mål cantilever resonansfrekvensen, og indstil scanningsfrekvensen efter eksperimenttype.
- Sænk AFM-spidsen til overfladen, og optimer signalindstillingerne.
- Udfør en 20 μm firkantet AFM-scanning i den tilstand, du vælger. Trykningstilstand (AC) blev brugt til at generere repræsentative data. Identificer viruskandidater efter omtrentlig højde, som typisk kan ses som skarpe pigge på glasoverfladen.
- Vælg en viruskandidat, og centrer scanningshovedet over det.
- Udfør en 250 nm firkantet scanning (eller passende scanning med superopløsning) om den valgte virus for at få dens topologi og retning.
- Vælg et punkt på virussen til måling af materialeegenskaben(f.eks. midten af en sfærisk virus til en Youngs modulus-måling), og udfør målingen i henhold til producentens anvisninger.
7. Billedbehandlingsmetode i superopløsning
- Åbn billedbehandlingssoftwaren i superopløsning, og kalibrer softwaren i overensstemmelse med producentens retningslinjer.
- Kalibrere superopløsningsbilledbehandlingsudstyret i overensstemmelse med producentens anvisninger ved hjælp af lysstofrør.
- Prøvebilledbufferen samles fra lagrene lige før billeddannelse ved at kombinere 50 μl 1 M MEA og 100 μl 10x Gloxy til 850 μl lagerbuffer. Hold billedbufferen på is under hele forsøget.
- Fjern en forberedt coverslip med prøve fra opbevaringsbufferen, og skyl den 5x ved at dyppe den i et bægerglas ultrapure vand.
- Tør den ikke-aktive coverslip ansigt ved hjælp af en støvfri filterpapir. Sørg for ikke at røre det aktive ansigt.
- Sæt den i en prøveholder til billedbehandlingssystemet, og tilfør prøveholderen 250 μl billedbuffer. Det er rimeligt at udskifte billedbufferen på prøven hver 2. time for at opretholde ensartede resultater.
- Dæk prøveholderen med parafilm for at mindske atmosfærisk interaktion med rummiljøet.
- Sæt prøveholderen i billedbehandlingsudstyret til billedbehandling.
- Bring prøven i fokus ved hjælp af producentens anvisninger.
- Billede prøven i henhold til super-opløsning teknik, der anvendes. Sørg for at justere billedforholdene for at optimere signalet, samtidig med at samtidige aktiveringer af foto-switchable fluorophores reduceres.
VIGTIGT: Billedbehandlingsbetingelserne er prøveafhængige og varierer efter forsøgsbehov. Et typisk eksperiment, der bruger Alexa 647, initialiseres effektivt til deres mørke tilstand i billedbufferen, kan derefter fotoaktiveres ved anvendelse af 405 nm UV-lys. Billeder opnås ved spændende en sparsom delmængde af Alexa 647 molekyler i en tæt mærket prøve og lokalisere hver fluorophore med en præcision, der primært er begrænset af antallet af indsamlede fotoner. Denne procedure gentages gentagne gange af softwaren, indtil et ønsket antal erhvervelsescyklusser er sket. Forsøgsforsøget skal have denne indstilling korreleret med, at hver fluorrør i prøven er blevet fotobleget. - Når billedbehandling er afsluttet, skal du lukke billedbehandlingsudstyret i henhold til producentens anvisninger. Softwaren kan være åben for dataanalyse.
- Dataanalyse er stærkt afhængig af eksperiment; I alle tilfælde identificeres virus imidlertid ved deres fulde bredde ved et halvt maksimum, hvilket sammenlignes med de kendte virusdimensioner, idet der tages hensyn til den ekstra størrelse af fluorescerende etiketter.
- For bedre visualisering kan du se eksempler ved at bruge enten Isosurface-gengivelsesindstillingen eller den volumetriske gengivelsesindstilling, som begge typisk findes i billedbehandlingssoftware i superopløsning.
Representative Results
Enkelt virion imaging ved hjælp af AFM:
Den ovenfor beskrevne prøveforberedelsesprotokol blev anvendt til forankring af vilde type virions til glasoverfladen. VSV virions er kugleformede 180 nm i længden og 80 nm i diameter. Da der er en række virioner, for hvilke denne teknik kan anvendes, er konceptet også demonstreret her på biotinylerede 36 nm perler også. De resulterende AFM-eksperimenter er vist i figur 1. Det er vigtigt at bemærke, at VSV virions har en lavere Young's modulus (100 MPa) i forhold til nonenveloped virus (GPa). De særlige billeder af single virion VSV blev opnået under aflytningstilstand under omgivende forhold med en stiv cantilever. Målet har været at deformere virus til det punkt, at den ekstra proteintæthed i virus bliver synlig som en bule i AFM billedet. Denne metode anvendes til at detektere den ekstra proteintæthed i virushulen19.
Billedbehandling med en enkelt virion-superopløsning:
Alexa 647 mærket VSV-G antistoffer blev brugt til at belægge kuverten af individuelle VSV virions for super-opløsning eksperimenter ved hjælp af metode 5A. For at påvise tøjringstætheden og den lave uspecifikke binding vises en stor scanning af prøven i figur 2A. Genvindingen af den virale kuvert på en repræsentativ virion er vist i figur 2B (blå isosurface).
Figur 1. AFM billeddannelse af perler og VSV på den funktionaliserede PEGG overflade. AFM-scanning af 36 nm biotinylerede perler (A, B) og en VSV virion (C) forankret til overfladen med et biotinyleret VSVG-antistof. AFM blev udført i AC luft topografi scanning tilstand. Spidsen radius er < 25 nm og målinger blev udført under kraft graduering og lys aflytning. Spidsen havde en kraftkonstant på 3 N/m og resonansfrekvens 75 kHz med en usikkerhed på 15 kHz. Mens perlerne bevarede deres højde under AFM-scanningen, har VSV-virionen en betydeligt mindre ungs modulus og er betydeligt deformeret i højden. I dette billede virion blev specifikt afbildet med en stiv cantilever i trykke tilstand, som producerede en lille xy convolution (bruges til at bestemme spidsen vs stump ende af virus) og højdeforskellen mellem spidsen og stump ende af virus bruges til at opdage ekstra proteintæthed i den stumpe ende af virus19.
Figur 2. Fluorescensbaseret billeddannelse af VSV-virioner på pegg-funktionaliseret overflade. A)rekombinant VSV virions immobiliseret på PEGG overflade ved hjælp af en biotinyleret anti VSVG antistof afbildet i bred felt fluorescens. B) Fluorescensrekonstruktion i høj opløsning af den ramme af VSV, der er fastgjort til PEGG-overfladen gennem et biotinyleret anti VSVG-antistof og dekoreret med Alexa 647-mærkede anti-VSVG-antistoffer (metode 5A blev brugt til at skabe disse billeder). Den blå overflade er en 2D isosurface projektion. Venstre viser en model af kugleformet virus.
| Coverslip størrelse | væske |
| 40 mm | 65 μl |
| 35 mm | 50 μl |
| 30 mm | 36 μl |
| 25 mm | 25 μl |
| 20 mm | 16 μl |
Tabel 1. Flydende aliquots i henhold til coverslip størrelse.
Discussion
Enkelt virion imaging med AFM og høj opløsning fluorescens imaging kan bruges som en alternativ metode til CryoEM tomografi. Hver af disse metoder har deres specifikke styrker. For eksempel afm kan gøres på WT virions uden krav om mærkning af prøven eller de interne virale proteiner. Placeringen af virale strukturer er dekonvolveret fra deres bidrag til virionens elastiske egenskaber.
Enkelt virion super-opløsning billeddannelse i kombination med den nyudviklede virale omvendt genetiske tilgange bliver en kraftfuld teknik til lokalisering af lavt kopinummer virale proteiner20. Rekombinante vira med udskiftning af deres proteiner med proteiner, der er smeltet til fluorescerende proteiner, kan fremstilles og renses ved hjælp af disse omvendte genetiske tilgange. Selvom superopløsningsbilleddannelse til dels har specificitet på grund af den genetiske mærkning, kræver det brug af de mutante vira.
AFM og super-opløsning billedbehandling er gratis metoder, der udnytter meget lignende prøve præparater. De metoder, der er skitseret i dette papir, som er vedtaget danne tidligere enkelt molekyle billeddannelse assays, tillader forankring af enkelt virions med ringe effekt på topologien af virions.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser i dette papir.
Acknowledgments
Vi takker dr. Till Böcking for den oprindelige forberedelsesprotokol med et enkelt molekyle. Dette arbejde blev støttet af NSF-tilskud 1121972 (SS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslips (fPALM) | Electron Microscopy Services | 72225-01 | 25 mm Coverslips |
| PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) | SuSoS | - | Stock: 0.5 mg/ml in PBS |
| NeutrAvidin biotin-binding protein | Invitrogen | A2666 | Stock: 0.25 mg/ml in PBS |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21245 | 1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer |
| α-VSV-G | Invitrogen | ab34774 | 1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer |
| Gluox | Sigma | G2133-250KU | Glucose oxidase type seven from Aspergillius |
| Catalase | Sigma | C40-100mg | Catalase from Bovine liver |
| MEA | Sigma | 30070-10G | Cysteamine (MEA |
| Stock Buffer | 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 10 mM NaCl + 10% glucose | ||
| NTE | 10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA | ||
| Slide-A-Lyzer, mini dialysis unit | Thermo Scientific | 10,000 MW | |
| Microscope Cover Glass: 35 CIRCLE #1 | Fisherbrand | 35 CIRCLE #1 |
References
- Pang, H. -B., et al. Virion stiffness regulates immature HIV-1 entry. Retrovirology. 10, 4 (2013).
- Kol, N., et al. A Stiffness Switch in Human Immunodeficiency Virus. Biophys. J. 92, 1777-1783 (2007).
- Ortega-Esteban, A., et al. Minimizing tip–sample forces in jumping mode atomic force microscopy in liquid. Ultramicroscopy. 114, 56-61 (2012).
- Ortega-Esteban, A., et al. Monitoring dynamics of human adenovirus disassembly induced by mechanical fatigue. Sci. Rep. 3, (2013).
- Hernando-Pérez, M., et al. Physical Virology: Direct Measurement of Phage. phi29 Stiffness Provides Evidence of Internal Pressure (Small 15/2012). Small. 8, 2365-2365 (2012).
- Carrasco, C., et al. DNA-mediated anisotropic mechanical reinforcement of a virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13706-13711 (2006).
- Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption. Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).
- Visnapuu, M. -L., Duzdevich, D., Greene, E. C. The importance of surfaces in single-molecule bioscience. Mol. Biosyst. 4, 394-403 (2008).
- Elenko, M. P., Szostak, J. W., Van Oijen, A. M. Single-molecule binding experiments on long time scales. Rev. Sci. Instrum. 81, (2010).
- van Oijen, A. M., et al. Single-Molecule Kinetics of λ Exonuclease Reveal Base Dependence and Dynamic Disorder. Science. 301, 1235-1238 (2003).
- Böcking, T., Aguet, F., Harrison, S. C., Kirchhausen, T. Single-molecule analysis of a molecular disassemblase reveals the mechanism of Hsc70-driven clathrin uncoating. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 295-301 (2011).
- Cocucci, E., Aguet, F., Boulant, S., Kirchhausen, T. The First Five Seconds in the Life of a Clathrin-Coated Pit. Cell. 150, 495-507 (2012).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. 3, 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy. Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).
- Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat. Methods. 5, 527-529 (2008).
- Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. Actin, Spectrin, and Associated Proteins Form a Periodic Cytoskeletal Structure in Axons. Science. 339, 452-456 (2013).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Hodges, J., et al. Asymmetric packaging of polymerases within vesicular stomatitis virus. Biochemical and Biophysical Research Communications. 440, 271-276 (2013).
- Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).
