Summary
Vedlegg av virioner til en overflate er et krav for enkel virionavbildning ved superoppløselig fluorescensavbildning eller atomkraftmikroskopi (AFM). Her demonstrerer vi en prøveprepareringsmetode for kontrollert vedheft av virioner til glassoverflater som er egnet for bruk i AFM og superoppløselig fluorescensavbildning.
Abstract
Immobilisering av virioner til glassoverflater er et kritisk skritt i enkelt virionavbildning. Her presenterer vi en teknikk vedtatt fra enkeltmolekylavbildningsanalyser som gjør det mulig å vedheft av enkeltvisjoner til glassflater med spesifisitet. Dette preparatet er basert på podning av overflaten av glasset med en blanding av PLL-g-PEG og PLL-g-PEG-Biotin, legger til et lag av avidin, og til slutt skaper virionankere gjennom vedlegg av biotinylerte virusspesifikke antistoffer. Vi har brukt denne teknikken på tvers av en rekke eksperimenter, inkludert atomkraftmikroskopi (AFM) og superoppløselig fluorescensavbildning. Denne prøveforberedelsesmetoden resulterer i en kontrolladhesjon av virionene til overflaten.
Introduction
Ladningsbaserte ikke-spesifikke interaksjoner brukes rutinemessig til vedheft av virioner i atomkraftmikroskopi1,2. Disse teknikkene fungerer spesielt bra når de brukes på ikke-utviklede virioner med svært stive capsids3-6. Selv om disse teknikkene er svært effektive for å immobilisere prøven, forhindrer de ikkespesifikk binding av proteiner til overflaten. Den ikke-spesifikke bindingen kan skape et problem når du prøver å bilde virions med AFM og super-oppløsning fluorescensteknikker som krever inkubasjoner av prøven med ulike antistoffer. Her skisserer vi en prøveforberedelsesmetode for spesifikk immobilisering av virioner.
Poly(etylenglykol) (PEG) podet til poly (L-lysin) (PLL) og adsorbert på en glassoverflate gir en betydelig blokk for elektrostatiske interaksjoner av proteiner med glass7. Enkeltmolekylanalyser som krever immobilisering av enkeltmolekyler på glassflater, har utnyttet denne egenskapen og brukt den til å lage en bestemt PEG-basert enkeltmolekyl immobiliseringsteknikk8-10. Dette preparatet ble også brukt til å immobilisere klarrinbur på glassoverflaten11, samt skape et homogent fibronectinbelegg for kontrollcelleadhesjon 12.
Vi har tatt i bruk prøveprepareringsmetoden basert på PLL-g-PEG-adsorpsjon til glassoverflater fra enkeltmolekylavbildningsmetoder og brukt den på avbildning av enkeltvisjoner av vesikulær stomatittvirus (VSV). Disse enkeltvirionene ble avbildet ved hjelp av atomkraftmikroskopi (AFM). Lignende eksperimenter ble også utført på funksjonaliserte perler som en kontroll. Virionene ble også avbildet av superoppløselig fluorescensmikroskopi var et VSV-G antistoff merket med Alexa 647 ble brukt til å lage et bilde av konvolutten av enkle virioner. Høyoppløselig fluorescerende avbildning benytter lokalisering av enkeltmolekyler for å lage et bilde13-15. fPALM bi-planar avbildning tillater lokalisering av enkeltmolekyler med 20 nm i plan og 50 nm oppløsning langs den optiskeaksen 15,16. Denne toplanarteknikken ble brukt til å avbilde fluorescerende bilder med superoppløsning som finnes i denne studien. En alternativ teknikk som har lignende resultater er STORM13,17,18.
Både AFM og superoppløselige fluorescerende bilder av VSV forankret til glasset ved prosedyrene som er skissert i dette papiret, viste spesifikk binding av virioner til glasset med minimum ikke-spesifikke interaksjoner19. Her presenterer vi prøveforberedelsesprotokollene for AFM og superoppløselige fluorescerende bildebehandlingseksperimenter. Kort sagt: Rene glassdeksler er funksjonalisert ved å adsorbe en blanding av PLL-g-PEG og PLL-g-PEG-biotin. Det er typisk for denne tynne filmen å bli konstruert for å gi mellom 15-25% funksjonalisert biotin på en belagt overflate. Dekslene inkuberes ytterligere med tetramerisk avidin. Et biotinylert viralt antistoff brukes deretter til å lage et unikt bindingssted for virionene. Binding av antistoffet kan gjøres på to måter.
Den første metoden er optimalisert for AFM, men den er fortsatt egnet for fluorescensavbildning med superoppløsning. I denne metoden behandles den avidinbelagte overflaten med biotinylert antistoff før viral vedheft. De immobiliserte virionene behandles med Alexa 647-merket antistoff for å dekke konvolutten og tillate fluorescensavbildning av virionene med superoppløsning.
Den andre metoden er å angripe viruset i løsning med biotinylert antistoff og Alexa 647 merket antistoff før du overholder virusene til den avidinbehandlede overflaten; denne metoden er optimalisert for fluorescensavbildningseksperimenter med superoppløsning der gjenoppretting av viral konvolutt er viktig. Denne metoden har fordelen av å tillate ensartet antistoffbelegg på virusoverflaten. Det biotinylerte antistoffet kan blandes med Alexa 647-merkede virale antistoffer i forhold som gir tilstrekkelig adsorpsjon av viruset til den avidinbehandlede overflaten samtidig som en høy konsentrasjon av fluorescerende etikett opprettholdes på utsiden av viral konvolutt. Disse Alexa 647-merkede virale antistoffene er ikke biotinylerte, og overskuddet kan skylles bort for å redusere bakgrunnsstøy.
Protocol
1. Kjemi Forberedelse
- Tilberedning og lagring av PLL-g-PEG-Biotin og avidin:
- Løs opp polymeren PLL-g-PEG-biotin i PBS-buffer i henhold til produsentens retninger i en konsentrasjon på 1,0 mg/ml.
- Aliquot i henhold til coverlip størrelse (se tabell 1) og lagre ved -80 °C i opptil ett år.
- Tilberedning og lagring av Avidin/NeutrAvidin
- Løs opp den umerkede Avidin/NeutrAvidin i PBS-bufferen i henhold til produsentens anvisninger i en konsentrasjon på 1,0 mg/ml.
- Aliquot i henhold til coverlip størrelse (se tabell 1) og oppbevar ved -20 °C i opptil 3 år.
- Virusprøvepreparering: Forbered virusprøver i henhold til eksperimentelt behov og laboratorieprotokoll før denne analysen. Bruk trinn 1.3.1 for metode 5A, eller 1.3.2 for metode 5B.
- Klargjør virusprøver for metode 5A i forkant av trinn 2. Bruk forberedte virusprøver innen 1-2 dager etter tilberedning, eller aliquot i henhold til dekselglidningstørrelse (se tabell 1) og blitsfrysing i flytende nitrogen og oppbevar ved -80 °C i opptil ett år. Når den er tint, bruk umiddelbart.
- Klargjør virusprøver for metode 5B lik 1.3.1. Tine aliquots av virus i forkant av 5B og lagre ved 4 °C ikke mer enn 24 timer før blanding med antistoffer.
- Forbered passende biotinylerte antistoffer for eksperimentet.
2. Dekslerlip rengjøring i forberedelse til kjemisk behandling
- Plasser deksler i et teflon-dekslestativ i riktig størrelse som holder dem i vertikal retning og senk dem ned i et beger fylt med filtrert (0,2 μm) etylalkohol (190 bevis).
- Soniker dekslene i den filtrerte etylalkoholen (190 bevis) i 30 min.
- Fjern deksler fra alkohol og skyll deksler mye med ultrarent vann.
- Legg skyllede deksler i et separat rent Teflon-stativ og beger fylt med 1 M NaOH.
- Soniker dekslene i 1 M NaOH i 30 min.
- Fjern deksler fra NaOH og skyll dem mye med ultrarent vann.
- Tørk de skyllede dekslene med en nitrogenstrøm, og legg dem i et rent, tørt Teflon-stativ.
- Inspiser dekslene for synlig film eller partikler som forblir på dekslene. Hvis noe synlig materiale forblir, har dekslene ikke blitt ordentlig rengjort og skyllet. Gjenta trinn 2.1-2.7 hvis den ikke er ordentlig rengjort.
- Rengjør dekslene med oksygen-plasma i 2 min. Dette trinnet er valgfritt, men anbefales.
3. Dannelse av PLL-g-PEG tynt filmlag
- Umiddelbart etter tørking i nitrogenstrømmen (eller det valgfrie oksygenplasmaet), plasser en dekslelip horisontalt i en steril Petri-tallerken. Pipet i midten av dekslenelip en passende mengde tint PBS bufret PLL-g-PEG-biotin (se tabell 1).
- Legg en annen rengjort dekslerlip på toppen av væsken i en sandwich metode. Merk at denne metoden består av å ha to coverlips inkubere sine kjemiske filmer ved å orientere sine kjemisk behandlede "aktive ansikter" mot hverandre, skilt bare av det nåværende kjemiske laget. Pass på at det er tilstrekkelig væske slik at volumet mellom de to dekslene er helt fylt med væske, men at det ikke lekker væske ut fra mellom dekslene (se tabell 1). Det "aktive ansiktet" betegner heretter deksler som har vært i kontakt med væsken i sandwichkonfigurasjonen.
- Legg lokket på Petri-retten over dekslene og inkuber på RT i 45-60 min.
- Fjern lokket på Petri-tallerkenen og plukk opp smørbrødet med et par pinsett. Vær forsiktig så du ikke klemmer ut overflødig væske. Bruk tommelen og pekefingeren til å klemme smørbrødet lett og skyv dekslene i motsatte retninger horisontalt med hensyn til hverandre, og skill deretter de to dekslene fra hverandre uten å berøre de aktive ansiktene.
- Skyll begge de aktive ansiktene med ultrarent vann ved å pipettere 25 ml ultrarent vann over det aktive ansiktet 2-4x, og tørk deretter dekslene med en nitrogenstrøm. Pass på å merke seg hvilke deksler som er aktive.
- Bruk dekslene umiddelbart, eller oppbevar O/N med det aktive ansiktet opp i en steril Petri-tallerken plassert i et støvfritt miljø med lav luftfuktighet.
4. Avidin Binding Ekstrautstyr
- Legg en PLL-g-PEG-behandlet deksler med aktivt ansikt opp i en steril Petri-tallerken.
- Pipette en passende mengde tint avidin i buffer (fremstilt i trinn 1.2) på midten av det aktive ansiktet.
- Plasser en annen deksleslip (aktiv ansikt nedover) på toppen av væsken i sandwichmetoden. Legg merke til den aktive forsiden av dekslene. Det er viktig at de aktive ansiktene kommer i kontakt med væsken under inkubasjonen (se trinn 3.2).
- Legg lokket på Petri-retten over dekslene og inkuber på RT i 25-30 min.
- Fjern Petri-lokket og skill de to dekslene som beskrevet i trinn 3.4, sørg for å holde styr på og ikke berøre de aktive ansiktene.
- Skyll begge de aktive ansiktene med ultrarent vann ved å pipettere 25 ml ultrarent vann over det aktive ansiktet 2-4x og tørk deretter dekslene med en nitrogenstrøm. Legg merke til den aktive forsiden av dekslene. Brukes umiddelbart til neste trinn.
VIKTIG MERKNAD: Det er to forskjellige metoder for å fullføre prøvepreparering avhengig av hvilken type analyse eksperimentet innebærer. Eksperimentet bør fortsette med trinn 5A der viruset er forankret til glasset før ytterligere antistoffbehandling som kreves for superoppløsningsavbildning tilsettes. 5B beskriver en alternativ metode for å merke viruset i oppløsning før du forankrer det til glasset. De representative dataene i dette manuskriptet er utarbeidet ved hjelp av 5A. En passende metode bør velges i henhold til eksperimentell analysetype.
5A. Aktiv ansikts antistoff Tether
- Umiddelbart etter tørking med en nitrogenstrøm i trinn 4.6, legg en ivrig behandlet dekslerlip aktiv ansikt opp i en steril Petri-tallerken.
- Pipette en passende mengde tint biotinylert antistoff i buffer på midten av det aktive ansiktet (se tabell 1).
- Plasser en annen deksleslip (aktiv ansikt nedover) på toppen av væsken i en sandwichmetode. Legg merke til det aktive ansiktet på dekslene, det er viktig at de aktive ansiktene er i kontakt med væsken for inkubasjon (se trinn 3.2.).
- Legg lokket på Petri-retten over dekslene og inkuber på RT i 45-60 min.
- Fjern Petri-lokket og skill de to dekslene som beskrevet i trinn 3.4, sørg for å holde styr på og ikke berøre de aktive ansiktene.
- Skyll begge de aktive ansiktene med PBS ved å pipettere 25 ml PBS over det aktive ansiktet 2-4x, ikke tørk og bruk det umiddelbart. Pass på å holde oversikt over hvilke deksler som er aktive.
- Legg et antistoffbehandlet deksler med aktivt ansikt opp i en steril Petri-tallerken, og pipette en passende mengde tint virus i buffer på midten av det aktive ansiktet.
- Plasser en annen deksleslip (aktiv ansikt nedover) på toppen av væsken i en sandwichmetode. Legg merke til det aktive ansiktet, da det er viktig at de aktive ansiktene er i kontakt med væsken for inkubasjon (se trinn 3.2.).
- Legg lokket på Petri-retten over dekslene og inkuber på RT i 45-60 min.
- Fjern Petri-lokket og skill de to dekslene som beskrevet i trinn 3.4, sørg for å holde styr på og ikke berøre de aktive ansiktene.
- Skyll begge de aktive ansiktene med PBS ved å pipettere 25 ml PBS over det aktive ansiktet 2-4x. Ikke tørk dekslene, legg dem i stedet i et Teflon-stativ og beger fylt med PBS umiddelbart. Pass på å holde oversikt over hvilke deksler som er aktive.
- Bruk de forberedte prøvene umiddelbart eller oppbevar dem i en passende buffer ved 4 °C i opptil tre dager uten betydelig tap av integritet.
Viktig MERKNAD: Hvis prøver skal brukes i en AFM-analyse, er preparatet fullført, og de kan brukes umiddelbart eller lagres som beskrevet i trinn 5A.20 - 5A.21. Hvis prøver skal brukes i en fluorescensanalyse med superoppløsning, går du videre til antistoffmerkingen som er beskrevet i trinn 5A.12 - 5A.19. - Plasser begge virusbehandlede deksler aktive med ansiktet opp i en steril Petri-tallerken og pipet nok proteinblokkeringsbuffer på dekslene til å ligge nok væskevolum til å dekke de sentrale 95% av dekslene uten å strømme noen blokkeringsbuffer av dekslene (vanligvis 100 - 200 μl.) Inkuber på RT i 60-90 min.
- Fjern forsiktig blokkeringsbufferen ved å fjerne dekslene en om gangen fra Petri-parabolen og hell væsken av dekslene i et avfallsbeger. Pass på at du ikke slipper dekslene.
- Skyll begge de aktive ansiktene med PBS ved å pipettere 25 ml PBS over det aktive ansiktet 2-4x, ikke tørk og bruk det umiddelbart. Pass på å holde oversikt over hvilke deksler som er aktive.
- Plasser en enkelt blokkerende bufferbehandlet deksler som er aktive med forsiden opp i en steril Petri-tallerken, og pipette en passende mengde fluorescerende merket viralt antistoff i bufferen på midten av det aktive ansiktet.
- Plasser en annen deksleslip (aktiv ansikt nedover) på toppen av væsken i en sandwichmetode. Legg merke til hvilket ansikt som er aktivt, det er viktig at de aktive ansiktene er i kontakt med væsken for inkubasjon (se trinn 3.2).
- Legg lokket på Petri-retten over dekslene og inkuber på RT i 30 minutter.
- Fjern Petri-lokket og skill de to dekslene som beskrevet i trinn 3.4, sørg for å holde styr på og ikke berøre de aktive ansiktene.
- Skyll begge de aktive ansiktene med PBS ved å pipettere 25 ml PBS over det aktive ansiktet 2-4x, ikke tørk og bruk det umiddelbart. Pass på å holde oversikt over hvilke deksler som er aktive.
- Ikke tørk dekslene, legg dem i stedet i et Teflon-stativ i et beger fylt med PBS. Pass på å holde oversikt over hvilke deksler som er aktive.
- Bruk de forberedte prøvene umiddelbart eller oppbevar dem i en passende buffer ved 4 °C i opptil tre dager uten betydelig tap av integritet.
5B. I løsning antistoff angrep
Denne metoden er en valgfri forbedring av merkingsstrategien for fluorescerende bildebehandling med superoppløsning. Ved å påføre i løsningsangrepet kan bedre antistoffbelegg på virusoverflaten oppnås.
- Bland antistoffløsninger i forhold i henhold til eksperimenter behov. Eksempel 1:4-forholdet på 0,01 mg/ml biotinylert antistoff til 0,01 mg/ml fluorescerende merket antistoff vil gi en god bindingsaffinitet og muliggjøre god konvoluttgjenvinning i en bildeanalyse med superoppløsning.
- Bland like deler av antistoff- og virusløsningene som er tilberedt i (5B.1) og (1.3). Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned et par ganger i aliquot. Denne resulterende oppløsningen kan lagres til det er nødvendig i opptil 24 timer ved 4 °C.
- Etter ferdigstillelse av trinn 4.6, plasser en ivrig behandlet dekslerlip med aktivt ansikt opp i en steril Petri-tallerken.
- Pipette en passende mengde virus med antistoffoppløsning (fremstilt i trinn 5B.2) på midten av det aktive ansiktet.
- Plasser en annen deksleslip (aktiv ansikt nedover) på toppen av væsken i en sandwichmetode. Legg merke til det aktive ansiktet, da det er viktig at de aktive ansiktene er i kontakt med væsken for inkubasjon (se trinn 3.2).
- Legg lokket på Petri-retten over dekslene og inkuber på RT i 45-60 min.
- Fjern Petri-lokket og skill de to dekslene som beskrevet i trinn 3.4, sørg for å holde styr på og ikke berøre de aktive ansiktene.
- Skyll begge de aktive ansiktene med PBS ved å pipettere 25 ml PBS over det aktive ansiktet 2-4x. Ikke tørk dekslene, legg dem i stedet i et Teflon-stativ og beger fylt med PBS umiddelbart. Pass på å holde oversikt over hvilke deksler som er aktive.
- Bruk forberedte prøver umiddelbart eller oppbevar ved 4 °C i opptil tre dager uten betydelig tap av integritet.
6. Måling av mikroskopimikroskopimateriale
- Slå på AFM-laserne og åpne AFM-programvaren. Velg riktig skannemodus for ønsket analyse fra åpningsdialogboksen. Alle nødvendige vinduer skal åpnes som standard. hvis du ikke konsulterer brukerhåndboken for å åpne de ønskede vinduene.
- Velg en cantilever som passer til ønsket måling, og sett den inn i cantileverhuset i henhold til produsentens retningslinjer. Det er et bredt spekter av forhold og eksperimenttyper som det finnes en rekke cantilevers for. Eksperimentet bør forske på cantilevers etter deres behov.
- Sett cantileverhuset inn i AFM-hodet i henhold til produsentens retningslinjer.
- Hvis prøven skal brukes under våte forhold, fjerner du prøven fra lagringsbufferen og går videre til trinn 6.7.
- Hvis prøven skal brukes under omgivelsesforhold (tørr), fjerner du prøven fra lagringsbufferen og skyller den kort ved å dyppe i et beger med ultrarent vann. Merk: Dette vil etterlate et tynt hydreringslag på prøven som kan indusere kapillær tiltrekning med cantilevers som har en lav vårkonstant.
- Hvis prøven skal brukes under omgivelsesforhold (tørre forhold), tørker du forsiktig prøven med en nitrogenstrøm.
- Tørk forsiktig baksiden av dekslene med et støvfritt filterpapir, og pass på at du ikke berører den aktive ansiktet på prøven.
- Plasser prøven i riktig AFM-prøveholder, og plasser deretter prøven på AFM-stadiet.
- Hvis prøven skal avbildes under våte forhold, pipette en liten mengde buffer på midten av prøven (~10 μl).
- Plasser AFM-hodet over prøven.
- Hvis prøven er våt, må du sørge for at cantilever- og AFM-spissen trenger inn i overflatelaget, og at det ikke er noen bobler mellom cantilever- og cantilever-huset.
- Juster AFM-laseren etter cantilever i samsvar med produsentens anbefalinger for å oppnå det optimale signalet.
- Mål cantilever resonansfrekvens og still inn skannefrekvensen i henhold til eksperimenttype.
- Senk AFM-spissen til overflaten og optimaliser signalinnstillingene.
- Utfør en 20 μm firkantet AFM-skanning i den modusen du velger. Trykkingsmodus (AC) ble brukt til å generere representative data. Identifiser viruskandidater med omtrentlig høyde, som vanligvis kan ses på som skarpe pigger på glassoverflaten.
- Velg en viruskandidat og sentrer skannehodet over det.
- Utfør en 250 nm firkantet skanning (eller passende superoppløsningsskanning) om det valgte viruset for å få sin topologi og orientering.
- Velg et punkt på viruset for måling av materialegenskap(f.eks. midten av et sfærisk virus for en Youngs modulusmåling) og utfør målingen i henhold til produsentens anvisninger.
7. Imaging-metode med superoppløsning
- Åpne bildebehandlingsprogramvaren med superoppløsning og kalibrer programvaren i henhold til produsentens retningslinjer.
- Kalibrer bildeutstyret med superoppløsning i henhold til produsentens anvisninger ved hjelp av fluorescerende perler.
- Monter prøveavbildningsbufferen fra aksjer like før avbildning ved å kombinere 50 μl 1 M MEA og 100 μl 10x Gloxy til 850 μl lagerbuffer. Hold bildebufferen på is så lenge eksperimentet varer.
- Fjern en forberedt deksleslip med prøve fra lagringsbufferen og skyll den 5x ved å dyppe den i et beger med ultrarent vann.
- Tørk det ikke-aktive dekslene med et støvfritt filterpapir. Pass på at du ikke berører det aktive ansiktet.
- Sett inn i en bildebehandlingssystemprøveholder og tilsett 250 μl bildebuffer i prøveholderen. Det er rimelig å bytte bildebufferen på prøven hver annen time for å opprettholde konsistente resultater.
- Dekk prøveholderen med parafilm for å redusere atmosfærisk interaksjon med rommiljøet.
- Plasser prøveholderen i bildeutstyret for avbildning.
- Ta prøven i fokus ved hjelp av produsentens anvisninger.
- Bilde prøven i henhold til superoppløsningsteknikken som brukes. Sørg for å justere bildeforholdene for å optimalisere signalet samtidig som du reduserer samtidige aktiveringer av fotobyttebare fluoroforer.
VIKTIG MERKNAD: Bildeforholdene er utvalgsavhengige og varierer etter eksperimentelt behov. Et typisk eksperiment som bruker Alexa 647 effektivt initialisert til mørk tilstand i bildebufferen, kan deretter foto aktiveres ved bruk av 405 nm UV-lys. Bilder oppnås ved å spennende en sparsom undergruppe av Alexa 647-molekyler i en tett merket prøve og lokalisere hver fluorofor med en presisjon som hovedsakelig begrenses av antall innsamlede fotoner. Denne prosedyren er iterated gjentatte ganger av programvaren til et ønsket antall oppkjøpssykluser har skjedd. Eksperimentet bør ha denne innstillingen korrelere med hver fluorofor i prøven etter å ha blitt fotobleket. - Når bildebehandlingen er fullført, slår du av bildeutstyret i henhold til produsentens anvisninger. Programvaren kan være åpen for dataanalyse.
- Dataanalyse er sterkt avhengig av eksperiment; I alle tilfeller identifiserer imidlertid virus med full bredde på halv maksimum, som sammenlignes med de kjente virusdimensjonene, og sørger for å ta hensyn til den ekstra størrelsen på fluorescerende etiketter.
- Hvis du vil ha bedre visualisering, kan du vise eksempler ved å bruke gjengivelsesalternativet Isosurface eller alternativet for volumetrisk gjengivelse, som begge vanligvis finnes i bildebehandlingsprogramvaren med superoppløsning.
Representative Results
Enkel virionavbildning ved hjelp av AFM:
Prøveprepareringsprotokollen som er skissert ovenfor, ble brukt til forankring av villtypevisjoner til glassoverflaten. VSV-virioner er kuleformede 180 nm i lengde og 80 nm i diameter. Siden det finnes en rekke virioner som denne teknikken kan brukes på, er konseptet også demonstrert her på biotinylerte 36 nm perler også. De resulterende AFM-eksperimentene vises i figur 1. Det er viktig å merke seg at VSV-virionene har en lavere Youngs modulus (100 MPa) sammenlignet med de ikke-utviklede virusene (GPa). De spesielle bildene av enkelt virion VSV ble oppnådd under tappemodus under omgivelsesforhold med en stiv cantilever. Målet har vært å deformere viruset til det punktet at den ekstra proteintettheten i viruset blir synlig som en bump i AFM-bildet. Denne metoden brukes til å oppdage den ekstra proteintettheten i virushulen19.
Bildebehandling med superoppløsning med én virion:
Alexa 647-merkede VSV-G-antistoffer ble brukt til å belegge konvolutten til individuelle VSV-virioner for eksperimenter med superoppløsning ved hjelp av metode 5A. For å demonstrere festetettheten og den lave uspesifiserte bindingen, vises en stor skanning av prøven i figur 2A. Gjenvinning av viral konvolutt på en representativ virion er vist i figur 2B (blå isosurface).
Figur 1. AFM-avbildning av perler og VSV på den funksjonaliserte PEGG-overflaten. AFM-skanning av 36 nm biotinylerte perler (A, B) og en VSV-virion (C) forankret til overflaten med et biotinylert VSVG-antistoff. AFM ble gjort i AC lufttopografi skannemodus. Spissradiusen er <25 nm og målinger ble utført under kraftmodulering og lett tapping. Spissen hadde en kraftkonstant på 3 N/m og resonansfrekvens 75 kHz med usikkerhet på 15 kHz. Mens perlene beholdt sin høyde under AFM-skanningen, har VSV-virionen en betydelig mindre ung modulus og er betydelig deformert i høyden. I dette bildet ble virion spesielt avbildet med en stiv cantilever i tappemodus som produserte en liten xy convolution (brukes til å bestemme spissen vs stump ende av viruset) og høydeforskjellen mellom spissen og den stumpe enden av viruset brukes til å oppdage ekstra proteintetthet i den stumpe enden av viruset19.
Figur 2. Fluorescensbasert avbildning av VSV-virioner på PEGG-funksjonalisert overflate. A) rekombinante VSV-virsjoner immobilisert på PEGG-overflaten ved hjelp av et biotinylert anti VSVG-antistoff avbildet i vidfeltfluorescens. B) Høyoppløselig fluorescensrekonstruksjon av konvolutten til VSV festet til PEGG-overflaten gjennom et biotinylert anti VSVG-antistoff og dekorert med Alexa 647-merkede anti-VSVG-antistoffer (metode 5A ble brukt til å lage disse bildene). Den blå overflaten er en 2D isosurface projeksjon. Venstre viser en modell av det punktformede viruset.
| Størrelse på omslag | væske |
| 40 mm | 65 μl |
| 35 mm | 50 μl |
| 30 mm | 36 μl |
| 25 mm | 25 μl |
| 20 mm | 16 μl |
Tabell 1. Væske aliquots i henhold til coverlip størrelse.
Discussion
Enkel virionavbildning med AFM og høyoppløselig fluorescensavbildning kan brukes som en alternativ metodikk for CryoEM-tomografi. Hver av disse metodene har sine spesifikke styrker. For eksempel kan AFM gjøres på WT-virioner uten krav om merking av prøven eller de interne virusproteinene. Plasseringen av virale strukturer er dekonvolvert fra deres bidrag til virionens elastiske egenskaper.
Enkel virion superoppløselig avbildning i kombinasjon med de nyutviklede virale omvendte genetiske tilnærmingene blir en kraftig teknikk for lokalisering av lav kopinummer virale proteiner20. Rekombinante virus med utskifting av proteiner med proteiner smeltet til fluorescerende proteiner kan lages og renses ved hjelp av disse omvendte genetiske tilnærmingene. Selv om superoppløsningsavbildning delvis har spesifisitet på grunn av genetisk merking, krever det bruk av mutantvirusene.
AFM og superoppløsningsavbildning er gratis metoder som bruker svært like prøvepreparater. Metodene skissert i dette papiret, som er vedtatt form tidligere enkeltmolekyl bildeanalyser, tillater forankring av enkeltvirkninger med liten effekt på virionenes topologi.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser i denne artikkelen.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Till Böcking for den originale enkeltmolekylforberedelsesprotokollen. Dette arbeidet ble støttet av NSF grant 1121972(SS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslips (fPALM) | Electron Microscopy Services | 72225-01 | 25 mm Coverslips |
| PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) | SuSoS | - | Stock: 0.5 mg/ml in PBS |
| NeutrAvidin biotin-binding protein | Invitrogen | A2666 | Stock: 0.25 mg/ml in PBS |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21245 | 1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer |
| α-VSV-G | Invitrogen | ab34774 | 1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer |
| Gluox | Sigma | G2133-250KU | Glucose oxidase type seven from Aspergillius |
| Catalase | Sigma | C40-100mg | Catalase from Bovine liver |
| MEA | Sigma | 30070-10G | Cysteamine (MEA |
| Stock Buffer | 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 10 mM NaCl + 10% glucose | ||
| NTE | 10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA | ||
| Slide-A-Lyzer, mini dialysis unit | Thermo Scientific | 10,000 MW | |
| Microscope Cover Glass: 35 CIRCLE #1 | Fisherbrand | 35 CIRCLE #1 |
References
- Pang, H. -B., et al. Virion stiffness regulates immature HIV-1 entry. Retrovirology. 10, 4 (2013).
- Kol, N., et al. A Stiffness Switch in Human Immunodeficiency Virus. Biophys. J. 92, 1777-1783 (2007).
- Ortega-Esteban, A., et al. Minimizing tip–sample forces in jumping mode atomic force microscopy in liquid. Ultramicroscopy. 114, 56-61 (2012).
- Ortega-Esteban, A., et al. Monitoring dynamics of human adenovirus disassembly induced by mechanical fatigue. Sci. Rep. 3, (2013).
- Hernando-Pérez, M., et al. Physical Virology: Direct Measurement of Phage. phi29 Stiffness Provides Evidence of Internal Pressure (Small 15/2012). Small. 8, 2365-2365 (2012).
- Carrasco, C., et al. DNA-mediated anisotropic mechanical reinforcement of a virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13706-13711 (2006).
- Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption. Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).
- Visnapuu, M. -L., Duzdevich, D., Greene, E. C. The importance of surfaces in single-molecule bioscience. Mol. Biosyst. 4, 394-403 (2008).
- Elenko, M. P., Szostak, J. W., Van Oijen, A. M. Single-molecule binding experiments on long time scales. Rev. Sci. Instrum. 81, (2010).
- van Oijen, A. M., et al. Single-Molecule Kinetics of λ Exonuclease Reveal Base Dependence and Dynamic Disorder. Science. 301, 1235-1238 (2003).
- Böcking, T., Aguet, F., Harrison, S. C., Kirchhausen, T. Single-molecule analysis of a molecular disassemblase reveals the mechanism of Hsc70-driven clathrin uncoating. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 295-301 (2011).
- Cocucci, E., Aguet, F., Boulant, S., Kirchhausen, T. The First Five Seconds in the Life of a Clathrin-Coated Pit. Cell. 150, 495-507 (2012).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. 3, 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy. Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).
- Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat. Methods. 5, 527-529 (2008).
- Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. Actin, Spectrin, and Associated Proteins Form a Periodic Cytoskeletal Structure in Axons. Science. 339, 452-456 (2013).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Hodges, J., et al. Asymmetric packaging of polymerases within vesicular stomatitis virus. Biochemical and Biophysical Research Communications. 440, 271-276 (2013).
- Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).
