Summary
ההחזקה של virions על פני השטח היא דרישה להדמיית virion יחיד על ידי הדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה סופר או מיקרוסקופיה כוח אטומי (AFM). כאן אנו מדגימים שיטת הכנה לדוגמה להדבקה מבוקרת של virions למשטחי זכוכית המתאימים לשימוש AFM והדמיה פלואורסצנטית ברזולוציה סופר.
Abstract
קיבוע של virions למשטחי זכוכית הוא צעד קריטי בהדמיית virion יחיד. כאן אנו מציגים טכניקה שאומצה ממבחני הדמיה של מולקולה אחת המאפשרת הידבקות של ויראליות בודדות למשטחי זכוכית עם ספציפיות. הכנה זו מבוססת על השתלת פני השטח של הזכוכית עם תערובת של PLL-g-PEG ו- PLL-g-PEG-Biotin, הוספת שכבה של avidin, ולבסוף יצירת עוגני virion באמצעות התקשרות של נוגדנים ספציפיים וירוס biotinylated. יישמנו טכניקה זו במגוון ניסויים, כולל מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM) והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה. שיטת הכנת מדגם זו גורמת הידבקות שליטה של virions על פני השטח.
Introduction
אינטראקציות לא ספציפיות המבוססות על טעינה משמשות באופן שגרתי להדבקה של ויראליות במיקרוסקופיה של כוח אטומי1,2. טכניקות אלה במיוחד לעבוד היטב כאשר נעשה שימוש על virions nonenveloped עם capsids נוקשה מאוד3-6. למרות טכניקות אלה יעילים מאוד בשיתוק המדגם, הם אינם מונעים כריכה לא ספציפית של חלבונים על פני השטח. הכריכה הלא ספציפית יכולה ליצור בעיה בעת ניסיון לדמיין virions עם AFM וטכניקות פלואורסצנטיות ברזולוציה סופר הדורשים דגירה של המדגם עם נוגדנים שונים. כאן אנו מתארים שיטת הכנה לדוגמה לשיתוק ספציפי של virions.
פולי(אתילן גליקול) (PEG) מושתל פולי (L-ליצין) (PLL) וספג על משטח זכוכית מספק בלוק משמעותי עבור אינטראקציות אלקטרוסטטיות של חלבונים עםזכוכית 7. בדיקות מולקולה אחת הדורשות קיבוע של מולקולות בודדות על משטחי זכוכית ניצלו תכונה זו והשתמשו בה כדי ליצור טכניקת קיבוע מולקולה אחת מבוססת PEG ספציפית8-10. הכנה זו שימשה גם כדי לשתק כלובי clathrin על משטח הזכוכית11, כמו גם יצירת ציפוי פיברונצ'ין הומוגני עבור הידבקות תא בקרה 12.
אימצנו את שיטת ההכנה לדוגמה המבוססת על ספיחה PLL-g-PEG למשטחי זכוכית ממתודולוגיות הדמיה של מולקולה אחת ויישמנו אותה להדמיית וירונים בודדים של וירוס stomatitis שלפוחית השתן (VSV). נגיףים יחידים אלה צולמו באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM). ניסויים דומים בוצעו גם על חרוזים פונקציונליים כפקד. virions צולמו גם על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ברזולוציה סופר היו נוגדן VSV-G שכותרתו עם Alexa 647 שימש ליצירת תמונה של המעטפה של virions יחיד. הדמיה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה משתמשת בלוקליזציה של מולקולות בודדות כדי ליצור תמונה13-15. הדמיה דו-מישורית של fPALM מאפשרת לוקליזציה של מולקולות בודדות עם 20 ננומטר במישור ורזולוציה של 50 ננומטר לאורך הציר האופטי15,16. טכניקה דו-מישורית זו שימשה לתמונות פלואורסצנטיות ברזולוציית-על הקיימות במחקר זה. טכניקה חלופית אשר יש תוצאות דומות היא STORM13,17,18.
הן AFM והן תמונות פלואורסצנטיות ברזולוציה סופר של VSV מעוגנות לזכוכית על ידי ההליכים המתוארים במאמר זה, הראו כריכה ספציפית של virions לזכוכית עם אינטראקציות מינימליות לא ספציפיות19. כאן אנו מציגים את פרוטוקולי ההכנה לדוגמה עבור AFM וניסויי הדמיה פלואורסצנטית ברזולוציה סופר. בקצרה: כיסויי זכוכית נקייה מתפקדים על ידי ספיחה של תערובת של PLL-g-PEG ו- PLL-g-PEG-ביוטין. זה אופייני עבור סרט דק זה להיות מהונדס לספק בין 15-25% ביוטין פונקציונלי על משטח מצופה. הכיסויים הם דגירה נוספת עם אבידין טטרמרי. נוגדן ויראלי biotinylated משמש לאחר מכן כדי ליצור אתר מחייב ייחודי עבור virions. כריכת הנוגדן יכולה להיעשות בשתי דרכים.
השיטה הראשונה ממוטבת עבור AFM אולם היא נשארת מתאימה להדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציית-על. בשיטה זו המשטח מצופה אבידין מטופל בנוגדן biotinylated לפני הידבקות ויראלית. virions משותק מטופלים עם אלקסה 647 שכותרתו נוגדן כדי לכסות את המעטפה ולאפשר הדמיה פלואורסצנטית ברזולוציה סופר של virions.
השיטה השנייה היא לתקוף את הנגיף בתמיסה עם הנוגדן biotinylated ו Alexa 647 שכותרתו נוגדן לפני הדבקת הנגיפים על פני השטח שטופלו אבידין; שיטה זו ממוטבת לניסויי הדמיה פלואורסצנטיים ברזולוציית-על שבהם ההתאוששות של המעטפה הנגיפית חשובה. לשיטה זו יש יתרון במתן ציפוי נוגדנים אחיד על פני השטח הנגיפיים. הנוגדן biotinylated עשוי להיות מעורבב עם Alexa 647 שכותרתו נוגדנים ויראליים ביחסים המאפשרים ספיחה מספקת של הנגיף על פני השטח שטופלו אבידין תוך שמירה על ריכוז גבוה של תווית פלואורסצנטית בצד החיצוני של המעטפה הנגיפית. נוגדנים ויראליים אלה של Alexa 647 אינם ביו-טיניליים וניתן לשטוף את העודף שלהם כדי להפחית את רעשי הרקע.
Protocol
1. הכנת כימיה
- הכנה ואחסון של PLL-g-PEG-ביוטין ואבידין:
- להמיס את פולימר PLL-g-PEG-ביוטין במאגר PBS על פי הוראות היצרן בריכוז של 1.0 מ"ג / מיליליטר.
- Aliquot על פי גודל כריכה (ראה טבלה 1)ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס עד שנה אחת.
- הכנה ואחסון של אבידין/נויטרבידין
- ממיסים את Avidin/NeutrAvidin ללא תווית במאגר PBS בהתאם להנחיות היצרן בריכוז של 1.0 מ"ג/מ"ל.
- Aliquot על פי גודל coverslip (ראה טבלה 1)ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס עד 3 שנים.
- הכנת דגימת וירוס: הכינו דגימות וירוסים לפי צורך ניסיוני ופרוטוקול מעבדה לפני ההסמכה הזו. השתמש בשלב 1.3.1 עבור שיטה 5A, או 1.3.2 עבור שיטה 5B.
- הכינו דגימות וירוסים לשיטה 5A לקראת שלב 2. השתמש דגימות ויראליות מוכנות בתוך 1-2 ימים של הכנה, או aliquot על פי גודל להחליק כיסוי (ראה טבלה 1) ואז להקפיא פלאש בחנקן נוזלי ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס עד שנה אחת. כאשר מופשרים, יש להשתמש מיד.
- הכן דגימות וירוסים לשיטה 5B בדומה ל- 1.3.1. להפשיר aliquots של וירוס מראש של 5B ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס לא יותר מ 24 שעות לפני ערבוב עם נוגדנים.
- הכינו נוגדנים ביו-טינילציה מתאימים לניסוי.
2. ניקוי כריכות כהכנה לטיפול כימי
- מניחים כיסויים בארון תקשורת טפלון בגודל מתאים שמחזיק אותם בכיוון אנכי ומכניסים אותם לעגלה מלאה באלכוהול אתיל מסונן (0.2 מיקרומטר) (190 הוכחה).
- Sonicate את הכיסויים באלכוהול אתיל מסונן (190 הוכחה) במשך 30 דקות.
- הסר כיסויים מאלכוהול ולשטוף כיסויים בהרחבה עם מים אולטרה-דקים.
- מניחים כיסויים שטפים בארון תקשורת טפלון נקי נפרד וזכוכית מלאה 1 M NaOH.
- סוניק את הכיסויים ב 1 M NaOH במשך 30 דקות.
- הסר כיסויים מ NaOH ולשטוף אותם בהרחבה עם מים אולטרה סגולים.
- יבשו את הכיסויים השטפים בזרם חנקן, והניחו אותם בארון תקשורת טפלון נקי ויבש.
- בדוק את הכיסויים עבור כל סרט או חלקיקים גלויים שנותרו על העטיפה. אם נשאר חומר נראה לעין, הכיסוי לא נוקה כראוי ושטוף. אם לא ניקו כראוי את שלבי החזרה 2.1-2.7.
- נקה את הכיסויים עם חמצן-פלזמה במשך 2 דקות. שלב זה הוא אופציונלי אך מומלץ.
3. היווצרות שכבת הסרט הדק PLL-g-PEG
- מיד לאחר ייבוש בזרם החנקן (או פלזמת החמצן האופציונלית), מניחים כיסוי אחד אופקית בצלחת פטרי סטרילית. פיפט במרכז הכיסויים כמות מתאימה של PBS מופשר אגירה PLL-g-PEG-ביוטין (ראה טבלה 1).
- מניחים עוד כיסויים מנוקים על גבי הנוזל בשיטת כריך. שים לב כי שיטה זו מורכבת משני כיסויים להדגיר את הסרטים הכימיים שלהם על ידי התמצאות שלהם כימית מטופלים "פרצופים פעילים" אחד כלפי השני, מופרדים רק על ידי השכבה הכימית הנוכחית. ודא שיש מספיק נוזלים כך שהנפח בין שני הכיסויים מלא לחלוטין בנוזל, אך אין נוזל דולף החוצה בין הכיסויים (ראה טבלה 1). "הפנים הפעילות" מעתה ואילך מייעדות פרצופי כיסוי שהיו במגע עם הנוזל בתצורת הכריך.
- מניחים את המכסה של צלחת פטרי מעל כריך כריכה ודגרת ב RT במשך 45-60 דקות.
- מוציאים את המכסה של צלחת פטרי ומרימים את הכריך עם זוג פינצטה. היזהר לא לצבוט נוזלים עודפים. השתמש באגודל ובאצבע המורה כדי לצבוט את הכריך קלות ולהחליק את הכיסויים בכיוונים מנוגדים אופקית ביחס זה לזה, ולאחר מכן להפריד את שני כריכות אחד מהשני מבלי לגעת בפנים הפעילים.
- יש לשטוף את שני הפרצופים הפעילים במים אולטרה-דקים על ידי הזרמת 25 מ"ל של מים אולטרה-דקים על הפנים הפעילות 2-4x, ולאחר מכן לייבש את הכיסויים עם זרם חנקן. הקפד לציין אילו פרצופי כיסוי פעילים.
- יש להשתמש בכיסויים באופן מיידי, או לאחסן את O/N עם הפנים הפעילות כלפי מעלה בצלחת פטרי סטרילית הממוקמת בסביבת לחות נמוכה נטולת אבק.
4. שיפור מחייב אבידין
- מניחים כיסויים שטופלו ב-PLL-g-PEG עם פנים כלפי מעלה בצלחת פטרי סטרילית.
- פיפט כמות מתאימה של אבידין מופשר במאגר (מוכן בשלב 1.2) על אמצע הפנים הפעילים.
- מניחים כיסוי נוסף (פנים פעילות כלפי מטה) על גבי הנוזל בשיטת הכריך. שים לב לפנים הפעילות של התוויות. חשוב שהפרצופים הפעילים יהיו במגע עם הנוזל במהלך הדגירה (ראו שלב 3.2).
- מניחים את המכסה של צלחת פטרי מעל כריך כריכה ודגרת ב RT במשך 25-30 דקות.
- הסר את מכסה צלחת פטרי ולהפריד את שני coverslips כמתואר בשלב 3.4, הקפד לעקוב ולא לגעת בפנים הפעילים.
- יש לשטוף את שני הפרצופים הפעילים במים אולטרה-דקים על ידי הזרמת 25 מ"ל של מים אולטרה-דקים על הפנים הפעילות 2-4x ולאחר מכן לייבש את הכיסויים עם זרם חנקן. שים לב לפנים הפעילות של התוויות. יש להשתמש באופן מיידי לשלב הבא.
הערה חשובה: ישנן שתי שיטות נפרדות להשלמת הכנת מדגם בהתאם לסוג הבדיקה שהניסוי כרוך בה. על הנסיין להמשיך בשלב 5A שבו הנגיף מעוגן לזכוכית לפני הוספת טיפול נוגדנים נוסף הנדרש להדמיית סופר-רזולוציה. 5B מתאר שיטה חלופית של תיוג הנגיף בתמיסה לפני עיגון אותו לזכוכית. הנתונים הייצוגיים בכתב יד זה מוכנים באמצעות 5A. יש לבחור שיטה מתאימה בהתאם לסוג מבחנים ניסיוניים.
5A. קשר נוגדן פנים פעיל
- מיד לאחר ייבוש עם זרם חנקן בשלב 4.6, מניחים כיסויים שטופלו באבידור עם הפנים כלפי מעלה בצלחת פטרי סטרילית.
- פיפט כמות מתאימה של נוגדן biotinylated מופשר במאגר על אמצע הפנים הפעילים (ראה טבלה 1).
- מניחים כיסוי נוסף (פנים פעילות כלפי מטה) על גבי הנוזל בשיטת כריך. שים לב לפנים הפעילות של הכותרות, חשוב שהפרצופים הפעילים נמצאים במגע עם הנוזל להדגירה (ראה שלב 3.2).
- מניחים את המכסה של צלחת פטרי מעל כריך כריכה ודגרת ב RT במשך 45-60 דקות.
- הסר את מכסה צלחת פטרי ולהפריד את שני coverslips כמתואר בשלב 3.4, הקפד לעקוב ולא לגעת בפנים הפעילים.
- יש לשטוף את שני הפרצופים הפעילים ב-PBS על ידי צנרת של 25 מ"ל של PBS על הפנים הפעילות 2-4x, לא להתייבש ולהשתמש בהם באופן מיידי. הקפד לעקוב אחר אילו פרצופי כריכה פעילים.
- מניחים כיסויים מטופלים נוגדנים עם הפנים הפעילות כלפי מעלה בצלחת פטרי סטרילית, ופיפט כמות מתאימה של וירוס מופשר במאגר על אמצע הפנים הפעילות.
- מניחים כיסוי נוסף (פנים פעילות כלפי מטה) על גבי הנוזל בשיטת כריך. שימו לב לפנים הפעילות, שכן חשוב שהפרצופים הפעילים נמצאים במגע עם הנוזל להדגירה (ראו שלב 3.2).
- מניחים את המכסה של צלחת פטרי מעל כריך כריכה ודגרת ב RT במשך 45-60 דקות.
- הסר את מכסה צלחת פטרי ולהפריד את שני coverslips כמתואר בשלב 3.4, הקפד לעקוב ולא לגעת בפנים הפעילים.
- יש לשטוף את שני הפרצופים הפעילים עם PBS על-ידי צנרת של 25 מ"ל של PBS על הפנים הפעילות 2-4x. אין לייבש את הכיסויים, במקום זאת מניחים אותם בארון תקשורת טפלון וזכוכית מלאה PBS מיד. הקפד לעקוב אחר אילו פרצופי כריכה פעילים.
- יש להשתמש בדגימות המוכנות באופן מיידי או לאחסן במאגר מתאים ב-4 מעלות צלזיוס למשך עד שלושה ימים ללא אובדן משמעותי של שלמות.
הערה חשובה: אם יש להשתמש בדגימות ב- AFM assay, ההכנה הושלמה וניתן להשתמש בהן באופן מיידי או לאחסן אותן כמתואר בשלב 5A.20 - 5A.21. אם יש להשתמש בדגימות בהדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציית-על, המשך לתיוג הנוגדנים המתואר בשלבים 5A.12 - 5A.19. - מניחים את שני הכיסויים שטופלו בווירוס עם הפנים כלפי מעלה בצלחת פטרי סטרילית ומאגר חסימת חלבונים מספיק על המכפלות כדי לחרוז מספיק נפח נוזלים כדי לכסות את 95% המרכזיים של הכיסוי מבלי להזרים כל חיץ חסימה מהכיסוי (בדרך כלל 100 - 200 μl.) דגירה ב RT במשך 60-90 דקות.
- בזהירות להסיר חיץ חסימה על ידי הסרת coverslips אחד בכל פעם מצלחת פטרי לשפוך את הנוזל של כיסוי לתוך פסולת. היזהר לא להפיל את הכיסוי.
- יש לשטוף את שני הפרצופים הפעילים ב-PBS על ידי צנרת של 25 מ"ל של PBS על הפנים הפעילות 2-4x, לא להתייבש ולהשתמש בהם באופן מיידי. הקפד לעקוב אחר אילו פרצופי כריכה פעילים.
- מניחים חיץ חסימה יחיד מטופל coverslip פעיל פנים כלפי מעלה בצלחת פטרי סטרילית, פיפטה כמות מתאימה של נוגדן ויראלי שכותרתו פלואורסצנטית במאגר על אמצע הפנים הפעילים.
- מניחים כיסוי נוסף (פנים פעילות כלפי מטה) על גבי הנוזל בשיטת כריך. שים לב איזה פרצוף פעיל, חשוב כי הפנים הפעילים נמצאים במגע עם הנוזל עבור דגירה (ראה שלב 3.2).
- מניחים את המכסה של צלחת פטרי מעל כריך כריכה ודגרת ב RT במשך 30 דקות.
- הסר את מכסה צלחת פטרי ולהפריד את שני coverslips כמתואר בשלב 3.4, הקפד לעקוב ולא לגעת בפנים הפעילים.
- יש לשטוף את שני הפרצופים הפעילים ב-PBS על ידי צנרת של 25 מ"ל של PBS על הפנים הפעילות 2-4x, לא להתייבש ולהשתמש בהם באופן מיידי. הקפד לעקוב אחר אילו פרצופי כריכה פעילים.
- אין לייבש את הכיסויים, במקום זאת מניחים אותם בארון תקשורת טפלון בתוך זכוכית מלאה PBS. הקפד לעקוב אחר אילו פרצופי כריכה פעילים.
- יש להשתמש בדגימות המוכנות באופן מיידי או לאחסן במאגר מתאים ב-4 מעלות צלזיוס למשך עד שלושה ימים ללא אובדן משמעותי של שלמות.
5B. בפתרון התקפת נוגדנים
שיטה זו היא שיפור אופציונלי של אסטרטגיית התיוג עבור ההדמיה הפלואורסצנטית ברזולוציית-על. על ידי החלת התקפת הפתרון, ניתן להשיג ציפוי נוגדנים טוב יותר על פני השטח הנגיפיים.
- מערבבים פתרונות נוגדנים ביחסים לפי הצורך בניסויים. דוגמה 1:4 יחס של 0.01 מ"ג / מ"ל נוגדן biotinylated ל 0.01 מ"ג / מיליליטר פלואורסצנטי שכותרתו נוגדן ייתן זיקה מחייבת טובה ולאפשר התאוששות מעטפה טובה במדורי הדמיה ברזולוציה סופר.
- מערבבים חלקים שווים של פתרונות הנוגדנים והווירוסים שהוכנו בהתאמה (5B.1) ו- (1.3). מערבבים בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה כמה פעמים aliquot. פתרון זה וכתוצאה מכך ניתן לאחסן עד הצורך עד 24 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
- עם השלמת שלב 4.6, מניחים כיסויים מטופלים אבידין עם פנים פעיל למעלה בצלחת פטרי סטרילית.
- פיפטה כמות מתאימה של וירוס עם פתרון נוגדנים (מוכן בשלב 5B.2) על אמצע הפנים הפעילים.
- מניחים כיסוי נוסף (פנים פעילות כלפי מטה) על גבי הנוזל בשיטת כריך. שימו לב לפנים הפעילות, שכן חשוב שהפרצופים הפעילים נמצאים במגע עם הנוזל להדגירה (ראו שלב 3.2).
- מניחים את המכסה של צלחת פטרי מעל כריך כריכה ודגרת ב RT במשך 45-60 דקות.
- הסר את מכסה צלחת פטרי ולהפריד את שני coverslips כמתואר בשלב 3.4, הקפד לעקוב ולא לגעת בפנים הפעילים.
- יש לשטוף את שני הפרצופים הפעילים עם PBS על-ידי צנרת של 25 מ"ל של PBS על הפנים הפעילות 2-4x. אין לייבש את הכיסויים, במקום זאת מניחים אותם בארון תקשורת טפלון וזכוכית מלאה PBS מיד. הקפד לעקוב אחר אילו פרצופי כריכה פעילים.
- יש להשתמש בדגימות מוכנות באופן מיידי או לאחסן ב-4 מעלות צלזיוס למשך עד שלושה ימים ללא אובדן משמעותי של שלמות.
6. מדידת מאפיין חומר מיקרוסקופי כוח אטומי
- הפעל את לייזרים AFM ולפתוח את תוכנת AFM. בחרו במצב הסריקה המתאים לתקנון הרצוי מתיאו-שיח הפתיחה. כל החלונות הדרושים צריכים להיפתח כברירת מחדל; אם אינך מתייעץ עם המדריך למשתמש כדי לפתוח את החלונות הרצויים.
- בחר cantilever המתאים למדידה הרצויה ולהכניס אותו לתוך דיור cantilever על פי הנחיות היצרן. ישנם מגוון רחב של תנאים וסוגי ניסויים שעבורם יש מגוון של cantilevers. הנסיינית צריכה לחקור את הניסויים בהתאם לצורך שלהם.
- הכנס את דיור cantilever לתוך ראש AFM על פי הנחיות היצרן.
- אם יש להשתמש במדגם בתנאים רטובים, הסר את הדגימה ממאגר האחסון והמשך לשלב 6.7.
- אם יש להשתמש במדגם בתנאי סביבה (יבשים), הסר את הדגימה ממאגר האחסון שלה ושטוף אותה לזמן קצר על ידי טבילה בעגלה של מים אולטרה-דקים. הערה: זה ישאיר שכבת לחות דקה על המדגם אשר עלול לגרום משיכה נימי עם cantilevers בעל קבוע באביב נמוך.
- אם יש להשתמש במדגם בתנאי סביבה (יבשים), יבש בעדינות את הדגימה עם זרם חנקן.
- ייבש בעדינות את הצד האחורי של העטיפה בנייר סינון ללא אבק, וודא שלא ייגע בפנים הפעילות של הדגימה.
- הנח את הדגימה במחזיק מדגם AFM המתאים ולאחר מכן מקם את המדגם על שלב AFM.
- אם המדגם הוא להיות בתמונה בתנאים רטובים, פיפטה כמות קטנה של חוצץ על מרכז המדגם (~ 10 μl).
- הנח את ראש AFM מעל הדגימה.
- אם המדגם רטוב, ודא כי קצה cantilever ו- AFM לחדור את שכבת פני השטח, וכי אין בועות בין cantilever ו cantilever דיור.
- ליישר את לייזר AFM עם cantilever בהתאם להמלצות היצרן על מנת לקבל את האות האופטימלי.
- למדוד את תדירות התדהודה ולהגדיר את תדירות הסריקה לפי סוג הניסוי.
- הנמך את קצה AFM לפני השטח ומטב את הגדרות האות.
- בצע סריקת AFM מרובעת של 20 מיקרומטר במצב שתבחר. נעשה שימוש במצב הקשה (AC) ביצירת נתונים מייצגים. לזהות מועמדים וירוס לפי גובה משוער, אשר בדרך כלל ניתן לראות קוצים חדים על פני השטח זכוכית.
- בחר מועמד וירוס ומרכז את ראש הסריקה שמעליו.
- בצע סריקה מרובעת של 250 ננומטר (או סריקה מתאימה ברזולוציית-על) אודות הווירוס הנבחר על מנת להשיג את הטופולוגיה והכיוון שלו.
- בחר נקודה על הנגיף למדידת רכוש החומר(למשל מרכזו של וירוס כדורי למדידת מודולוס של יאנג) ובצע את המדידה בהתאם להוראות היצרן.
7. שיטת הדמיה ברזולוציה גבוהה במיוחד
- פתח את תוכנת ההדמיה ברזולוציית-על וכייל את התוכנה בהתאם להנחיות היצרן.
- כייל את ציוד ההדמיה ברזולוציית-על בהתאם להנחיות היצרן תוך שימוש חרוזים פלואורסצנטיים.
- להרכיב את מאגר ההדמיה מדגם מן המניות רק לפני ההדמיה על ידי שילוב של 50 μl של 1 M MEA ו 100 μl של 10x Gloxy כדי 850 μl של מאגר מלאי. שמור חיץ הדמיה על קרח למשך הניסוי.
- הסר כיסוי מוכן עם מדגם ממאגר האחסון שלו ולשטוף אותו 5x על ידי טבילת אותו בעגלה של מים אולטרה.
- יבש את פני הכיסוי הלא פעילים תוך שימוש בנייר סינון ללא אבק. הקפד לא לגעת בפנים הפעילות.
- הכנס למחזיק דגימת מערכת דימות והוסף 250 מיקרומטר של מאגר דימות למחזיק הדגימה. סביר להחליף את מאגר ההדמיה במדגם כל שעתיים כדי לשמור על תוצאות עקביות.
- מכסים את מחזיק הדגימה בפרפילם כדי להפחית את האינטראקציה האטמוספרית עם סביבת החדר.
- הנח את מחזיק הדגימה בציוד ההדמיה להדמיה.
- הכניסו את הדגימה למיקוד תוך ניצול הוראות היצרן.
- תמונה המדגם על פי טכניקת רזולוציית העל בשימוש. הקפד להתאים את תנאי ההדמיה כדי למטב את האות תוך הפחתת הפעלות בו-זמניות של פלואורופורים הניתנים להחלפה בתמונה.
הערה חשובה: תנאי ההדמיה תלויים במדגם ומשתנים בהתאם לצורך הניסיוני. ניסוי טיפוסי ניצול Alexa 647 אותחל ביעילות למצב הכהה שלהם במאגר ההדמיה לאחר מכן ניתן להפעיל צילום באמצעות יישום של 405 ננומטר אור UV. תמונות מתקבלות על ידי תת קבוצה דלילה מרגשת של מולקולות Alexa 647 בתוך מדגם שכותרתו בצפיפות לוקליזציה כל פלואורופור עם דיוק מוגבל בעיקר על ידי מספר הפוטונים שנאספו. הליך זה חוזר על כך שוב ושוב על-ידי התוכנה עד להתרחשות מספר רצוי של מחזורי רכישה. הנסיין צריך הגדרה זו לתאם עם כל פלואורופור במדגם לאחר מולבן צילום. - לאחר השלמת ההדמיה, כבה את ציוד ההדמיה בהתאם להנחיות היצרן. ייתכן שהתוכנה תישאר פתוחה לניתוח נתונים.
- ניתוח נתונים תלוי במידה רבה בניסוי; עם זאת, בכל המקרים לזהות וירוסים על ידי רוחב מלא שלהם בחצי מקסימום, אשר מושווה לממדי וירוס ידוע, הקפד לקחת בחשבון את הגודל הנוסף של תוויות פלואורסצנטיות.
- לקבלת תצוגה חזותית טובה יותר, הצג דוגמאות על-ידי שימוש באפשרות עיבוד Isosurface או באפשרות עיבוד אמצעי האחסון, ששניהם נמצאים בדרך כלל בתוכנת דימות ברזולוציית-על.
Representative Results
הדמיית ויריון יחיד באמצעות AFM:
פרוטוקול ההכנה לדוגמה שתואר לעיל שימש לעיגון וירונים מסוג בר למשטח הזכוכית. ויראלי VSV הם בצורת כדור 180 ננומטר אורך ו 80 ננומטר קוטר. כפי שיש מגוון של virions אשר טכניקה זו עשויה להיות מיושמת, הרעיון מודגם גם כאן על חרוזי biotinylated 36 ננומטר גם כן. ניסויי AFM המתקבלים מוצגים באיור 1. חשוב לציין כי virions VSV יש מודולוס של יאנג נמוך יותר (100 MPa) לעומת וירוסים nonenveloped (GPa). התמונות הספציפיות של VSV virion יחיד התקבלו במצב הקשה בתנאי הסביבה עם cantilever נוקשה. המטרה הייתה לעוות את הנגיף עד כדי כך שצפיפות החלבון הנוספת בתוך הנגיף הופכת גלויה כמו בליטה בתוך תמונת AFM. שיטה זו משמשת לגילוי צפיפות החלבון הנוספת בתוך חלל הנגיף19.
הדמיה ברזולוציית-על של virion יחיד:
אלקסה 647 שכותרתו נוגדני VSV-G שימשו כדי לצפות את המעטפה של virions VSV בודדים עבור ניסויים ברזולוציה סופר באמצעות שיטה 5A. כדי להדגים את צפיפות הרצועה ואת הכריכה הלא ספציפית הנמוכה, סריקה גדולה של המדגם מוצגת באיור 2A. ההתאוששות של המעטפה הנגיפית על ויריון מייצג מוצגת באיור 2B (פני isosurface כחולים).
איור 1. הדמיית AFM של חרוזים ו VSV על פני השטח PEGG פונקציונלי. סריקת AFM של 36 ננומטר חרוזים ביוטינילציה (A, B) ו- VSV virion (C) מעוגן על פני השטח עם נוגדן VSVG biotinylated. AFM נעשה במצב סריקה של טופוגרפיית אוויר AC. רדיוס הקצה הוא <25 ננומטר ומדידות בוצעו תחת אפנון כוח והקשה קלה. הקצה היה קבוע כוח של 3 N / m ותדר מהדהד 75 kHz עם אי ודאות של 15 kHz. בעוד החרוזים שמרו על גובהם במהלך סריקת AFM, ויריון VSV יש מודולוס של צעיר קטן משמעותית והוא מעוות באופן משמעותי בגובה. בתמונה זו virion היה בתמונה במיוחד עם cantilever נוקשה במצב הקשה אשר הפיק קונבולוציה xy קטן (משמש כדי לקבוע את קצה לעומת קצה קהה של הנגיף) ואת הפרש הגובה בין קצה קצה בוטה של הנגיף משמש כדי לזהות צפיפות חלבון נוספת בקצה הקהה של הנגיף19.
איור 2. הדמיה מבוססת פלואורסצנטיות של ויראליות VSV על פני השטח התפקודיים של PEGG. A) ויראלי VSV רקומביננטי משותק על פני השטח PEGG באמצעות נוגדן אנטי VSVG biotinylated בתמונה פלואורסצנטיות שדה רחב. B) שחזור פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה של מעטפת VSV המחוברת למשטח ה- PEGG באמצעות נוגדן אנטי VSVG ביוטינילציה ומעוצבת בנוגדנים של Alexa 647 הנקראים נוגדנים נגד VSVG (שיטה 5A שימשה ליצירת תמונות אלה). המשטח הכחול הוא הקרנת isosurface דו-ממדית. משמאל מוצג דגם של הווירוס בצורת תבליט.
| גודל כיסוי | נוזל |
| 40 מ"מ | 65 מיקרול |
| 35 מ"מ | 50 מיקרול |
| 30 מ"מ | 36 מיקרול |
| 25 מ"מ | 25 מיקרול |
| 20 מ"מ | 16 מיקרול |
שולחן 1. אלציטוטים נוזליים לפי גודל ה-coverslip.
Discussion
הדמיית ויריון יחיד עם AFM והדמיה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה יכולה לשמש כמתודולוגיה חלופית לטומוגרפיה של CryoEM. לכל אחת מהמתודולוגיות האלה יש את החוזקות הספציפיות שלהן. לדוגמה AFM יכול להיעשות על virions WT ללא דרישה על תיוג המדגם או חלבונים ויראליים פנימיים. המיקום של מבנים ויראליים הוא deconvolved מתרומתם לתכונות אלסטיות של virion.
הדמיה ברזולוציה-על של virion יחיד בשילוב עם הגישות הגנטיות ההפוכות הנגיפיות שפותחו לאחרונה הופכת לטכניקה רבת עוצמה ל לוקליזציה של מספר עותק נמוך של חלבונים ויראליים20. וירוסים רקומביננטיים עם החלפת החלבונים שלהם בחלבונים מותכים לחלבונים פלואורסצנטיים יכולים להיעשות ומטוהרים באמצעות גישות גנטיות הפוכות אלה. למרות שלהדמיה ברזולוציית-על יש ספציפיות בין השאר בשל התיוג הגנטי, היא דורשת שימוש בווירוסים המוטנטיים.
AFM והדמיה ברזולוציית-על הן שיטות משלימות המשתמשות בהכנות מדגמיות דומות מאוד. השיטות המתוארות במאמר זה, אשר מאומצות טופס מוקדם יותר מולקולה אחת הדמיה מבחנים, לאפשר עיגון של virions יחיד עם השפעות מועטות על הטופולוגיה של virions.
Disclosures
למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים במאמר זה.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר טיל בקינג על פרוטוקול הכנת המולקולה הבודדת המקורי. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NSF 1121972(SS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslips (fPALM) | Electron Microscopy Services | 72225-01 | 25 mm Coverslips |
| PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) | SuSoS | - | Stock: 0.5 mg/ml in PBS |
| NeutrAvidin biotin-binding protein | Invitrogen | A2666 | Stock: 0.25 mg/ml in PBS |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21245 | 1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer |
| α-VSV-G | Invitrogen | ab34774 | 1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer |
| Gluox | Sigma | G2133-250KU | Glucose oxidase type seven from Aspergillius |
| Catalase | Sigma | C40-100mg | Catalase from Bovine liver |
| MEA | Sigma | 30070-10G | Cysteamine (MEA |
| Stock Buffer | 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 10 mM NaCl + 10% glucose | ||
| NTE | 10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA | ||
| Slide-A-Lyzer, mini dialysis unit | Thermo Scientific | 10,000 MW | |
| Microscope Cover Glass: 35 CIRCLE #1 | Fisherbrand | 35 CIRCLE #1 |
References
- Pang, H. -B., et al. Virion stiffness regulates immature HIV-1 entry. Retrovirology. 10, 4 (2013).
- Kol, N., et al. A Stiffness Switch in Human Immunodeficiency Virus. Biophys. J. 92, 1777-1783 (2007).
- Ortega-Esteban, A., et al. Minimizing tip–sample forces in jumping mode atomic force microscopy in liquid. Ultramicroscopy. 114, 56-61 (2012).
- Ortega-Esteban, A., et al. Monitoring dynamics of human adenovirus disassembly induced by mechanical fatigue. Sci. Rep. 3, (2013).
- Hernando-Pérez, M., et al. Physical Virology: Direct Measurement of Phage. phi29 Stiffness Provides Evidence of Internal Pressure (Small 15/2012). Small. 8, 2365-2365 (2012).
- Carrasco, C., et al. DNA-mediated anisotropic mechanical reinforcement of a virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13706-13711 (2006).
- Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption. Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).
- Visnapuu, M. -L., Duzdevich, D., Greene, E. C. The importance of surfaces in single-molecule bioscience. Mol. Biosyst. 4, 394-403 (2008).
- Elenko, M. P., Szostak, J. W., Van Oijen, A. M. Single-molecule binding experiments on long time scales. Rev. Sci. Instrum. 81, (2010).
- van Oijen, A. M., et al. Single-Molecule Kinetics of λ Exonuclease Reveal Base Dependence and Dynamic Disorder. Science. 301, 1235-1238 (2003).
- Böcking, T., Aguet, F., Harrison, S. C., Kirchhausen, T. Single-molecule analysis of a molecular disassemblase reveals the mechanism of Hsc70-driven clathrin uncoating. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 295-301 (2011).
- Cocucci, E., Aguet, F., Boulant, S., Kirchhausen, T. The First Five Seconds in the Life of a Clathrin-Coated Pit. Cell. 150, 495-507 (2012).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. 3, 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy. Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).
- Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat. Methods. 5, 527-529 (2008).
- Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. Actin, Spectrin, and Associated Proteins Form a Periodic Cytoskeletal Structure in Axons. Science. 339, 452-456 (2013).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Hodges, J., et al. Asymmetric packaging of polymerases within vesicular stomatitis virus. Biochemical and Biophysical Research Communications. 440, 271-276 (2013).
- Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).
