Summary
Virionların yüzeye bağlanması, Süper çözünürlüklü floresan görüntüleme veya atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) ile tek virion görüntüleme için bir gerekliliktir. Burada, VIRIONların AFM ve süper çözünürlüklü floresan görüntülemede kullanıma uygun cam yüzeylere kontrollü yapışıklık için örnek bir hazırlama yöntemi gösteriyoruz.
Abstract
Virionların cam yüzeylere hareketsiz hale getirilmesi tek virion görüntülemede kritik bir adımdır. Burada, tek moleküllü görüntüleme testlerinden benimsenen ve tek virionların cam yüzeylere özgüllükle yapışmasını sağlayan bir teknik sunuyoruz. Bu preparat, camın yüzeyinin PLL-g-PEG ve PLL-g-PEG-Biotin karışımı ile aşılanmasına, bir avidin tabakası eklenmesine ve son olarak biyotinillenmiş virüs spesifik antikorların bağlanması yoluyla virion ankrajları oluşturulmasına dayanmaktadır. Bu tekniği atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) ve süper çözünürlüklü floresan görüntüleme dahil olmak üzere çeşitli deneylerde uyguladık. Bu örnek hazırlama yöntemi, virionların yüzeye kontrol yapışıklığının ortaya çıkmasıyla sonuçlanır.
Introduction
Atomik kuvvet mikroskopisinde virionların yapışması için düzenli olarak yük bazlı spesifik olmayan etkileşimler kullanılır1,2. Bu teknikler özellikle çok sert kapsidlere sahip gelişmemiş virionlarda kullanıldığında iyi çalışır3-6. Bu teknikler numunenin hareketsiz hale gelirken çok etkili olmasına rağmen, proteinlerin yüzeye spesifik olmayan bağlanmasını engellemez. Spesifik olmayan bağlama, çeşitli antikorlarla numunenin inkübasyonlarını gerektiren AFM ve süper çözünürlüklü floresan teknikleri ile virionları görüntülemeye çalışırken bir sorun yaratabilir. Burada virionların spesifik hareketsizleştirilmesi için örnek bir hazırlama yöntemini özetliyorum.
Poli(L-lizin) (PLL) aşılanan ve cam yüzeye adsorbe edilen poli(etilen glikol) (PEG), proteinlerin cam7ile elektrostatik etkileşimleri için önemli bir blok sağlar. Cam yüzeylerdeki tek moleküllerin hareketsizleştirilmesini gerektiren tek molekül tahlilleri bu özellikten yararlanmış ve8-10özel bir PEG tabanlı tek molekül immobilizasyon tekniği oluşturmak için kullanmıştır. Bu preparat ayrıca clathrin kafeslerini cam yüzey11'e hareketsiz hale getirmek ve kontrol hücresi yapışması için homojen bir fibronektin kaplaması oluşturmak için de kullanılmıştır 12.
Tek moleküllü görüntüleme metodolojilerinden cam yüzeylere PLL-g-PEG adsorpsiyonu esas alınarak örnek hazırlama yöntemini benimsedik ve veziküler stomatit virüsünün (VSV) tek virionlarının görüntülenmesine uyguladık. Bu tek virionlar atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) kullanılarak görüntülenmiştir. Benzer deneyler kontrol olarak fonksiyonelleştirilmiş boncuklar üzerinde de yapıldı. Virionlar ayrıca süper çözünürlüklü floresan mikroskopi ile de görüntülendi Alexa 647 ile etiketlenmiş bir VSV-G antikoru tek virion zarfının görüntüsünü oluşturmak için kullanıldı. Yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme,13-15görüntü oluşturmak için tek moleküllerin lokalizasyonunu kullanır. fPALM bi-düzlemsel görüntüleme, düzlemde 20 nm ve optik eksen boyunca 50 nm çözünürlüğe sahip tek moleküllerin lokalizasyonuna izin verir15,16. Bu iki düzlemsel teknik, bu çalışmada bulunan süper çözünürlüklü floresan görüntüleri görüntülemek için kullanılmıştır. Benzer sonuçlara sahip alternatif bir teknik STORM13,17,18 'dir.
Bu makalede özetlenen prosedürlerle cama tutturulmuş VSV'nin hem AFM hem de süper çözünürlüklü floresan görüntüleri, virionların minimum spesifik olmayan etkileşimlerle cama özel olarak bağlanmasını gösterdi19. Burada AFM ve süper çözünürlüklü floresan görüntüleme deneyleri için örnek hazırlama protokollerini sunuyoruz. Kısacası: Temiz cam kapaklar PLL-g-PEG ve PLL-g-PEG-biotin karışımı adsorbe ederek işlevsel hale getirilir. Bu ince filmin kaplamalı bir yüzeyde% 15-25 işlevselleştirilmiş biyotin sağlayacak şekilde tasarlanmış olması tipiktir. Kapaklar tetramerik avidin ile daha da inkübe edilir. Biyotinillenmiş viral antikor daha sonra virionlar için benzersiz bir bağlayıcı bölge oluşturmak için kullanılır. Antikorun bağlanması iki şekilde yapılabilir.
İlk yöntem AFM için optimize edilmiştir, ancak süper çözünürlüklü floresan görüntüleme için uygun olmaya devam etmektedir. Bu yöntemde avidin kaplı yüzey viral yapıştırma öncesinde biyotinillenmiş antikor ile tedavi edilir. Hareketsiz virionlar, zarfı örtmek ve virionların süper çözünürlüklü floresan görüntülemesine izin vermek için Alexa 647 etiketli antikor ile tedavi edilir.
İkinci yöntem, virüsleri avidinle tedavi edilen yüzeye yapıştırmadan önce biyotinillenmiş antikor ve Alexa 647 etiketli antikor ile çözelti içinde virüse saldırmaktır; bu yöntem, viral zarfın kurtarılmasının önemli olduğu süper çözünürlüklü floresan görüntüleme deneyleri için optimize edilmiştir. Bu yöntem, viral yüzeyde tek tip antikor kaplamasına izin verme avantajına sahiptir. Biyotinillenmiş antikor, viral zarfın dış tarafında yüksek miktarda floresan etiket tutarken, virüsün hevesli işlem görmüş yüzeye yeterli adsorpsiyonuna izin veren oranlarda Alexa 647 etiketli viral antikorlarla karıştırılabilir. Bu Alexa 647 etiketli viral antikorlar biyotinilasyonlu değildir ve arka plan gürültüsünü azaltmak için fazlalıkları durulanabilir.
Protocol
1. Kimya Hazırlama
- PLL-g-PEG-Biotin ve avidin hazırlanması ve depolanmasını:
- PLL-g-PEG-biotin polimerini PBS tamponunda üreticinin talimatlarına göre 1,0 mg/ml konsantrasyonda çözün.
- Kapak boyutuna göre aliquot (bkz. Tablo 1)ve bir yıla kadar -80 °C'de saklayın.
- Avidin/NeutrAvidin'in hazırlanması ve depolanmasının
- Etiketsiz Avidin/NeutrAvidin'i PBS tamponunda üreticinin talimatlarına göre 1,0 mg/ml konsantrasyonda çözün.
- Kapak boyutuna göre aliquot (bkz. Tablo 1)ve 3 yıla kadar -20 ° C'de saklayın.
- Virüs numunesi hazırlama: Bu test öncesinde virüs örneklerini deneysel ihtiyada ve laboratuvar protokolüne göre hazırlayın. Yöntem 5A için adım 1.3.1'i veya yöntem 5B için 1.3.2'yi kullan.
- Aşama 2'den önce yöntem 5A için virüs örnekleri hazırlayın. Hazırlanan viral numuneleri hazırlandıklarından sonraki 1-2 gün içinde veya kapak kayması boyutuna göre aliquot'u (bkz. Tablo 1)kullandı, ardından sıvı nitrojende flaş dondurma yapın ve bir yıla kadar -80 °C'de saklayın. Çözdürüldüğünde, hemen kullanın.
- Virüs örneklerini 1.3.1'e benzer şekilde 5B yöntemi için hazırlayın. 5B'den önce virüs aliquotlarını çözün ve antikorlarla karıştırmadan önce en fazla 24 saat 4 °C'de depolayın.
- Deney için uygun biyotinillenmiş antikorlar hazırlayın.
2. Kimyasal Arıtmaya Hazırlıkta Kapak Temizliği
- Kapakları dikey yönde tutan uygun büyüklükte bir Teflon kapak rafı içine yerleştirin ve filtrelenmiş (0,2 μm) etil alkol (190 prova) ile dolu bir behere batırın.
- Filtrelenmiş etil alkoldeki kapakları (190 prova) 30 dakika boyunca sonicate edin.
- Kapakları alkolden çıkarın ve kapak örtülerini ultra saf suyla yoğun bir şekilde durulayın.
- Durulanmış kapakları ayrı bir temiz Teflon rafa ve 1 M NaOH ile doldurulmuş behere yerleştirin.
- 1 M NaOH'daki kapakları 30 dakika boyunca sonicate edin.
- Kapakları NaOH'dan çıkarın ve ultra saf suyla yoğun bir şekilde durulayın.
- Durulanmış kapakları azot akışı ile kurutun ve temiz, kuru bir Teflon rafa yerleştirin.
- Kapakları, kapak kapağında kalan görünür film veya parçacıklar için inceleyin. Görünür herhangi bir malzeme kalırsa, kapak kapağı düzgün bir şekilde temizlenmiş ve durulamamıştır. Düzgün temizlenmezse, 2.1-2.7 adımlarını yineleyin.
- Kapakları oksijen-plazma ile 2 dakika boyunca temizleyin. Bu adım isteğe bağlıdır, ancak önerilir.
3. PLL-g-PEG İnce Film Tabakasının Oluşumu
- Azot akışında (veya isteğe bağlı oksijen plazmasında) kuruduktan hemen sonra, steril bir Petri kabına yatay olarak bir kapak yerleştirin. Kapak kapağının ortasındaki pipet, uygun miktarda çözülmüş PBS tamponlanmış PLL-g-PEG-biotin (bkz. Tablo 1).
- Bir sandviç yönteminde sıvının üzerine başka bir temizlenmiş kapak yerleştirin. Bu yöntemin, iki kapak kapağının kimyasal olarak işlenmiş "aktif yüzlerini" sadece mevcut kimyasal tabaka ile ayırarak birbirlerine doğru yönlendirerek kimyasal filmlerini kuluçkaya yatırmalarından oluştuğunu unutmayın. İki kapak arasındaki hacmin tamamen sıvı ile doldurulması, ancak kapak örtüleri arasından sıvı sızmaması için yeterli sıvı olduğundan emin olun (bkz. Tablo 1). Bundan böyle "aktif yüz", sandviç konfigürasyonunda sıvı ile temas etmiş kapak yüzlerini belirler.
- Petri kabının kapağını kapaklı sandviçin üzerine yerleştirin ve RT'de 45-60 dakika kuluçkaya yatırın.
- Petri kabının kapağını çıkarın ve sandviçi bir çift cımbızla alın. Fazla sıvıyı çimdiklememeye dikkat edin. Sandviçi hafifçe sıkıştırmak için başparmak ve işaret parmağını kullanın ve kapakları birbirine göre yatay olarak zıt yönlere kaydırın, ardından aktif yüzlere dokunmadan iki örtünün birbirinden ayrılması.
- Aktif yüzün üzerine 25 ml ultra saf su pipetleme ile her iki aktif yüzü de ultra saf su ile durulayın ve ardından kapakları bir azot akışı ile kurutun. Hangi kapak yüzlerinin etkin olduğunu not edin.
- Kapakları hemen kullanın veya O/N'yi aktif yüzü tozsuz düşük nem ortamına yerleştirilmiş steril bir Petri kabında saklayın.
4. Avidin Bağlama Geliştirme
- PLL-g-PEG ile işlenmiş bir kapak kapağının aktif yüzü steril bir Petri kabına yerleştirin.
- Aktif yüzün ortasına tamponda (adım 1.2'de hazırlanmış) uygun miktarda çözülmüş avidin pipet.
- Sandviç yönteminde sıvının üzerine başka bir kapak kılıfı (aktif yüz aşağı) yerleştirin. Kapak örtülerinin aktif yüzüne dikkat edin. Aktif yüzlerin inkübasyon sırasında sıvı ile temas halinde olması önemlidir (bkz. adım 3.2).
- Petri kabının kapağını kapaklı sandviçin üzerine yerleştirin ve RT'de 25-30 dakika kuluçkaya yatırın.
- Petri kabının kapağını çıkarın ve iki kapak kapağını adım 3.4'te açıklandığı gibi ayırın, aktif yüzleri takip etmeyi ve dokunmayı unutmayın.
- Aktif yüzün üzerine 25 ml ultra saf su pipetleme yaparak her iki aktif yüzü de ultra saf su ile durulayın ve ardından kapakları bir azot akışı ile kurutun. Kapak örtülerinin aktif yüzüne dikkat edin. Bir sonraki aşama için hemen kullanın.
Önemlİ NOT: Deneyin gerektirdiği test türüne bağlı olarak numune hazırlamayı tamamlamak için iki farklı yöntem vardır. Deneyci, süper çözünürlüklü görüntüleme için gerekli herhangi bir ek antikor tedavisi eklenmeden önce virüsün cama tutturulduğı 5A aşamasına geçmelidir. 5B, virüsü cama tutturmadan önce çözelti içinde etiketlemenin alternatif bir yöntemini açıklar. Bu makaledeki temsili veriler 5A kullanılarak hazırlanmıştır. Deneysel tahlil türüne göre uygun bir yöntem seçilmelidir.
5A. Aktif Yüz Antikor Tether
- Aşama 4.6'da bir azot akışı ile kuruduktan hemen sonra, steril bir Petri kabına hevesli bir işlem görmüş kapak akıntısı aktif yüzünü yerleştirin.
- Pipet aktif yüzün ortasına tamponda uygun miktarda çözülmüş biyotinillenmiş antikor (bkz. Tablo 1).
- Bir sandviç yönteminde sıvının üzerine başka bir kapak kılıfı (aktif yüz aşağı) yerleştirin. Kapakların aktif yüzüne dikkat edin, aktif yüzlerin inkübasyon için sıvı ile temas halinde olması önemlidir (bkz. adım 3.2.).
- Petri kabının kapağını kapaklı sandviçin üzerine yerleştirin ve RT'de 45-60 dakika kuluçkaya yatırın.
- Petri kabının kapağını çıkarın ve iki kapak kapağını adım 3.4'te açıklandığı gibi ayırın, aktif yüzleri takip etmeyi ve dokunmayı unutmayın.
- Her iki aktif yüzü de 25 ml PBS'yi aktif yüze 2-4x pipetleterek PBS ile durulayın, kurumasın ve hemen kullanmayın. Hangi kapak yüzlerinin etkin olduğunu takip etmeyi unutmayın.
- Steril bir Petri kabına antikorla işlenmiş bir kapak aktif yüzü yerleştirin ve aktif yüzün ortasına tamponda uygun miktarda çözülmüş virüs pipet yerleştirin.
- Bir sandviç yönteminde sıvının üzerine başka bir kapak kılıfı (aktif yüz aşağı) yerleştirin. Aktif yüzü not edin, çünkü aktif yüzlerin inkübasyon için sıvı ile temas halinde olması önemlidir (bkz. adım 3.2.).
- Petri kabının kapağını kapaklı sandviçin üzerine yerleştirin ve RT'de 45-60 dakika kuluçkaya yatırın.
- Petri kabının kapağını çıkarın ve iki kapak kapağını adım 3.4'te açıklandığı gibi ayırın, aktif yüzleri takip etmeyi ve dokunmayı unutmayın.
- Aktif yüzün 2-4x üzerine 25 ml PBS pipetleme yaparak her iki aktif yüzü PBS ile durulayın. Kapakları kurutmayın, bunun yerine hemen PBS ile doldurulmuş bir Teflon rafa ve behere yerleştirin. Hangi kapak yüzlerinin etkin olduğunu takip etmeyi unutmayın.
- Hazırlanan numuneleri hemen kullanın veya önemli bir bütünlük kaybı olmadan üç güne kadar 4 °C'de uygun bir tamponda saklayın.
Önemli NOT: Numuneler bir AFM testinde kullanılacaksa, hazırlık tamamlanır ve hemen kullanılabilir veya 5A.20 - 5A.21 adımında açıklandığı gibi saklanabilir. Örnekler süper çözünürlüklü bir floresan görüntüleme testinde kullanılacaksa, 5A.12 - 5A.19 adımlarında açıklanan antikor etiketlemesine geçin. - Her iki virüs işlem görmüş kapak kapağını da steril bir Petri kabına yerleştirin ve kapakların üzerine, kapaktan herhangi bir engelleme tamponu akmadan örtünün merkezi% 95'ini kaplayacak kadar sıvı hacmini kaplayacak kadar protein bloke tamponu yerleştirin (tipik olarak 100 - 200 μl.) RT'de 60-90 dakika kuluçkaya yatır.
- Kapakları Petri kabından teker teker çıkararak ve kapak kapağındaki sıvıyı atık bir kabın içine dökerek engelleme tamponunu dikkatlice çıkarın. Kapak kapağını düşürmemeye dikkat edin.
- Her iki aktif yüzü de 25 ml PBS'yi aktif yüze 2-4x pipetleterek PBS ile durulayın, kurumasın ve hemen kullanmayın. Hangi kapak yüzlerinin etkin olduğunu takip etmeyi unutmayın.
- Steril bir Petri kabına tek bir bloke tampon işlem görmüş kapak aktif yüzü yerleştirin ve aktif yüzün ortasına tamponda uygun miktarda floresan etiketli viral antikor pipet yerleştirin.
- Bir sandviç yönteminde sıvının üzerine başka bir kapak kılıfı (aktif yüz aşağı) yerleştirin. Hangi yüzün aktif olduğunu unutmayın, aktif yüzlerin inkübasyon için sıvı ile temas halinde olması önemlidir (bkz. adım 3.2).
- Petri kabının kapağını kapaklı sandviçin üzerine yerleştirin ve RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- Petri kabının kapağını çıkarın ve iki kapak kapağını adım 3.4'te açıklandığı gibi ayırın, aktif yüzleri takip etmeyi ve dokunmayı unutmayın.
- Her iki aktif yüzü de 25 ml PBS'yi aktif yüze 2-4x pipetleterek PBS ile durulayın, kurumasın ve hemen kullanmayın. Hangi kapak yüzlerinin etkin olduğunu takip etmeyi unutmayın.
- Kapakları kurutmayın, bunun yerine PBS ile dolu bir beher içindeki bir Teflon rafa yerleştirin. Hangi kapak yüzlerinin etkin olduğunu takip etmeyi unutmayın.
- Hazırlanan numuneleri hemen kullanın veya önemli bir bütünlük kaybı olmadan üç güne kadar 4 °C'de uygun bir tamponda saklayın.
5B. Çözümde Antikor Saldırısı
Bu yöntem, süper çözünürlüklü floresan görüntüleme için etiketleme stratejisinin isteğe bağlı bir geliştirmesi. Çözelti atağı uygulanarak viral yüzeyde daha iyi antikor kaplaması elde edilebilir.
- Antikor çözeltilerini deney ihtiyacına göre oranlarda karıştırın. Örnek 1:4 0.01 mg/ml biyotinillenmiş antikorun 0.01 mg/ml floresan etiketli antikora oranı iyi bir bağlayıcı yakınlık sağlayacak ve süper çözünürlüklü bir görüntüleme testinde iyi bir zarf iyileşmesine izin verecektir.
- (5B.1) ve (1.3) olarak hazırlanan antikor ve virüs çözeltilerinin eşit kısımlarını karıştırın. Aliquot'ta birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak hafifçe karıştırın. Bu sonuç çözeltisi 4 °C'de 24 saate kadar ihtiyaç duyulana kadar saklanabilir.
- 4.6. adımın tamamlanmasından sonra, steril bir Petri kabına aktif yüzlü hevesli bir işlem görmüş kapak kılıfı yerleştirin.
- Aktif yüzün ortasına antikor çözeltisi (adım 5B.2'de hazırlanmış) ile uygun miktarda virüs pipet.
- Bir sandviç yönteminde sıvının üzerine başka bir kapak kılıfı (aktif yüz aşağı) yerleştirin. Aktif yüzü not edin, çünkü aktif yüzlerin inkübasyon için sıvı ile temas halinde olması önemlidir (bkz. adım 3.2).
- Petri kabının kapağını kapaklı sandviçin üzerine yerleştirin ve RT'de 45-60 dakika kuluçkaya yatırın.
- Petri kabının kapağını çıkarın ve iki kapak kapağını adım 3.4'te açıklandığı gibi ayırın, aktif yüzleri takip etmeyi ve dokunmayı unutmayın.
- Aktif yüzün 2-4x üzerine 25 ml PBS pipetleme yaparak her iki aktif yüzü PBS ile durulayın. Kapakları kurutmayın, bunun yerine hemen PBS ile doldurulmuş bir Teflon rafa ve behere yerleştirin. Hangi kapak yüzlerinin etkin olduğunu takip etmeyi unutmayın.
- Hazırlanan numuneleri hemen kullanın veya önemli bir bütünlük kaybı olmadan üç güne kadar 4 °C'de saklayın.
6. Atomik Kuvvet Mikroskopi Malzeme Özelliği Ölçümü
- AFM lazerlerini açın ve AFM yazılımını açın. Açılış iletişim kutusundan istediğiniz test için uygun tarama modunu seçin. Gerekli tüm pencereler varsayılan olarak açılmalıdır; istediğiniz pencereleri açmak için kullanım kılavuzuna başvurmazsanız.
- İstenilen ölçüme uygun bir kantilever seçin ve üretici yönergelerine göre kantilever muhafazasına yerleştirin. Çeşitli cantilevers olan çok çeşitli koşullar ve deney türleri vardır. Deneyci, ihtiyaçlarına göre cantilevers araştırmalıdır.
- Üreticinin yönergelerine göre cantilever muhafazasını AFM kafasına yerleştirin.
- Örnek ıslak koşullarda kullanılacaksa, örneği depolama arabelleğinden çıkarın ve 6.7 adımına geçin.
- Numune ortam (kuru) koşullarında kullanılacaksa, numuneyi depolama tamponundan çıkarın ve bir beher ultra saf suya batırarak kısa bir süre durulayın. Not: Bu, numune üzerinde ince bir hidrasyon tabakası bırakacak ve bu da düşük yay sabitine sahip kantilerlerle kılcal damar cazibesine neden olabilir.
- Numune ortam (kuru) koşullarında kullanılacaksa, numuneyi bir azot akışı ile hafifçe kurulayın.
- Örtünün arka tarafını tozsuz bir filtre kağıdı ile hafifçe kurulayın, numunenin aktif yüzüne dokunmamaya dikkat edin.
- Numuneyi uygun AFM numune tutucusuna yerleştirin, ardından numuneyi AFM aşamasına yerleştirin.
- Numune ıslak koşullarda görüntülenecekse, numunenin ortasına az miktarda tampon (~10 μl) pipet takın.
- AFM kafasını numunenin üzerine yerleştirin.
- Örnek ıslaksa, dokunsal ve AFM ucunun yüzey tabakasına nüfuz ettiğinden ve dokunsal ve cantilever muhafazası arasında kabarcık olmadığından emin olun.
- En uygun sinyali elde etmek için AFM lazeri üretici önerilerine uygun olarak makineci ile hizalayın.
- Kantilever rezonans frekansını ölçün ve tarama frekansını deney tipine göre ayarlayın.
- AFM ucunu yüzeye üfleyin ve sinyal ayarlarını optimize edin.
- Seçtiğiniz modda 20 μm kare AFM taraması yapın. Temsili veri oluşturmada dokunma (AC) modu kullanıldı. Virüs adaylarını, genellikle cam yüzeyinde keskin sivri uçlar olarak görülebilen yaklaşık yüksekliğe göre tanımlayın.
- Bir virüs adayı seçin ve tarama kafasını bunun üzerine ortala.
- Topolojisini ve yönünü elde etmek için seçilen virüs hakkında 250 nm kare tarama (veya uygun süper çözünürlüklü tarama) gerçekleştirin.
- Malzeme özelliği ölçümü için virüs üzerinde bir nokta seçin(örneğin, Young modülü ölçümü için küresel bir virüsün merkezi) ve ölçümü üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirin.
7. Süper Çözünürlüklü Görüntüleme Yöntemi
- Süper çözünürlüklü görüntüleme yazılımını açın ve yazılımı üreticinin yönergelerine göre kalibre edin.
- Süper çözünürlüklü görüntüleme ekipmanını floresan boncuklar kullanarak üreticinin talimatlarına uygun olarak kalibre edin.
- 50 μl 1 M MEA ve 100 μl 10x Gloxy ile 850 μl stok tamponunu birleştirerek görüntülemeden hemen önce numune görüntüleme tamponunu stoklardan monte edin. Deney süresince görüntüleme tamponu buzda tutun.
- Hazırlanan bir kapak kapağını depolama tamponundan numune ile çıkarın ve bir kap ultra saf suya batırarak 5x durulayın.
- Tozsuz filtre kağıdı kullanarak aktif olmayan kapak yüzünü kurutun. Aktif yüze dokunmamaya dikkat edin.
- Bir görüntüleme sistemi numune tutucusuna yerleştirin ve numune tutucusuna 250 μl görüntüleme tamponu ekleyin. Tutarlı sonuçlar elde etmek için numunedeki görüntüleme tamponunu her 2 saatte bir değiştirmek mantıklıdır.
- Oda ortamıyla atmosferik etkileşimi azaltmak için numune tutucuyu parafilm ile örtün.
- Numune tutucuyu görüntüleme için görüntüleme ekipmanına yerleştirin.
- Üreticinin talimatlarını kullanarak numuneyi odak noktasına getirin.
- Numuneyi kullanılan süper çözünürlüklü tekniğe göre görüntüleyin. Fotoğraf değiştirilebilir floroforların eşzamanlı aktivasyonlarını azaltırken sinyali optimize etmek için görüntüleme koşullarını ayarladığından emin olun.
Önemlİ NOT: Görüntüleme koşulları örneğe bağlıdır ve deneysel ihtiyada göre değişir. Alexa 647'yi kullanarak görüntüleme tamponundaki karanlık durumlarına verimli bir şekilde başlatılan tipik bir deney, daha sonra 405 nm UV ışığı uygulamasıyla fotoğrafla etkinleştirilebilir. Görüntüler, Alexa 647 moleküllerinin seyrek bir alt kümesini yoğun etiketli bir örnek içinde heyecanlandırarak ve her floroforu öncelikle toplanan foton sayısıyla sınırlı bir hassasiyetle yerelleştirerek elde edilir. Bu yordam, istenen sayıda alım döngüsü gerçekleşene kadar yazılım tarafından tekrar tekrar tekrar tekrarlanır. Deneyci, bu ayarın fotoğraf ağartılmış örnekteki her floroforla ilişkili olmasını sağlamalıdır. - Görüntüleme tamamlandığında, görüntüleme ekipmanını üreticinin talimatlarına göre kapatın. Yazılım veri analizi için açık bırakılabilir.
- Veri analizi büyük ölçüde deneye bağlıdır; bununla birlikte, her durumda, virüsleri bilinen virüs boyutlarıyla karşılaştırıldığında maksimum yarı genişliğinde tam genişliklerine göre tanımlar ve floresan etiketlerin ek boyutunu dikkate almayı unutmayın.
- Daha iyi görselleştirme için, her ikisi de genellikle süper çözünürlüklü görüntüleme yazılımında bulunan Isosurface işleme seçeneğini veya hacimsel işleme seçeneğini kullanarak örnekleri görüntüleyin.
Representative Results
AFM kullanarak tek virion görüntüleme:
Yukarıda özetlenen örnek hazırlama protokolü, vahşi tip virionların cam yüzeye tutturulmasında kullanılmıştır. VSV virionları 180 nm uzunluğunda ve 80 nm çapında mermi şeklindedir. Bu tekniğin uygulanabileceği çeşitli virionlar olduğu için, kavram burada biyotinillenmiş 36 nm boncuklar üzerinde de gösterilmiştir. Elde eden AFM deneyleri Şekil 1'de gösterilmiştir. VSV virionlarının gelişmemiş virüslere (GPa) kıyasla daha düşük bir Young modülüne (100 MPa) sahip olduğunu belirtmek önemlidir. Tek virion VSV'nin belirli görüntüleri, sert bir kavi ile ortam koşullarında dokunma modunda elde edildi. Amaç, virüsü, virüs içindeki ekstra protein yoğunluğunun AFM görüntüsünde bir tümsek olarak görünür hale geldiği noktaya kadar deforme etmek olmuştur. Bu yöntem, virüs boşluğu içindeki ekstra protein yoğunluğunu tespit etmek için kullanılır19.
Tek virion süper çözünürlüklü görüntüleme:
Alexa 647 etiketli VSV-G antikorları, 5A yöntemini kullanarak süper çözünürlüklü deneyler için bireysel VSV virionlarının zarfını kaplamak için kullanıldı. Bağlama yoğunluğunu ve düşük belirsiz bağlamayı göstermek için, numunenin büyük bir taraması Şekil 2A'da gösterilmiştir. Temsili bir virion üzerindeki viral zarfın geri kazanımı Şekil 2B'de (mavi izosurface) gösterilmiştir.
Şekil 1. fonksiyonelleştirilmiş PEGG yüzeyinde boncukların ve VSV'nin AFM görüntülemesi. 36 nm biyotinillenmiş boncuk(A, B)ve vsv virion(C)afm taraması biyotinilasyonlu VSVG antikor ile yüzeye tutturulmuş. AFM AC hava topografyası tarama modunda yapıldı. Uç yarıçapı <25 nm'dir ve ölçümler kuvvet modülasyonu ve ışık dokunma altında gerçekleştirildi. Ucun kuvvet sabiti 3 N/m ve rezonans frekansı 75 kHz ve 15 kHz belirsizlik vardı. Boncuklar AFM taraması sırasında yüksekliklerini korurken, VSV virion önemli ölçüde daha küçük bir genç modülüne sahiptir ve yüksekliği önemli ölçüde deforme olmuştur. Bu görüntüde virion özellikle küçük bir xy konvolüzyon üreten dokunma modunda sert bir şekerleterek görüntülenmiştir (virüsün ucu vs künt ucunu belirlemek için kullanılır) ve virüsün künt ucundaki ekstra protein yoğunluğunu tespit etmek için virüsün ucu ve künt ucu arasındaki yükseklik farkıkullanılır 19.
Şekil 2. PEGG fonksiyonelleştirilmiş yüzeyde VSV virionlarının floresan bazlı görüntülenmesi. A)geniş alan floresanında görüntülenmiş biyotinilize anti VSVG antikoru kullanılarak PEGG yüzeyinde hareketsiz hale getirilen rekombinant VSV virionları. B)Biyotinillenmiş anti VSVG antikoru ile PEGG yüzeyine tutturulmuş ve Alexa 647 etiketli anti-VSVG antikorları ile süslenmiş VSV zarfının yüksek çözünürlüklü floresan rekonstrüksiyonu (Bu görüntülerin oluşturulmasında Yöntem 5A kullanılmıştır). Mavi yüzey 2D izosurface projeksiyonudur. Solda mermi şeklindeki virüsün bir modeli görülüyor.
| Kapak Boyutu | akışkan |
| 40 mm | 65 μl |
| 35 mm | 50 μl |
| 30 mm | 36 μl |
| 25 mm | 25 μl |
| 20 mm | 16 μl |
Tablo 1. Kapak boyutuna göre sıvı aliquots.
Discussion
AFM ve Yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme ile tek virion görüntüleme CryoEM tomografisine alternatif bir metodoloji olarak kullanılabilir. Bu metodolojilerin her birinin kendi güçlü yanları vardır. Örneğin AFM, numuneyi veya iç viral proteinleri etiketlemeye gerek kalmadan WT virionlarında yapılabilir. Viral yapıların konumu, virionun elastik özelliklerine katkılarından arındırılmıştır.
Yeni geliştirilen viral ters genetik yaklaşımlarla birlikte tek virion süper çözünürlüklü görüntüleme, düşük kopya sayısı viral proteinleri lokalize etmek için güçlü bir teknik haline gelir20. Proteinlerinin floresan proteinlere kaynaşmış proteinlerle değiştirilmesi ile rekombinant virüsler bu ters genetik yaklaşımlar kullanılarak yapılabilir ve saflaştırılabilir. Süper çözünürlüklü görüntüleme kısmen genetik etiketleme nedeniyle özgüllüğe sahip olsa da, mutant virüslerin kullanılmasını gerektirir.
AFM ve süper çözünürlüklü görüntüleme, çok benzer numune preparatlarını kullanan ücretsiz yöntemlerdir. Bu makalede özetlenen ve daha önce tek moleküllü görüntüleme testlerini oluşturan yöntemler, virionların topolojisi üzerinde çok az etkisi olan tek virionların tutturulmasına izin verir.
Disclosures
Yazarların bu makalede rakip finansal çıkarları yoktur.
Acknowledgments
Dr. Till Böcking'e orijinal tek molekül hazırlama protokolü için teşekkür ederiz. Bu çalışma NSF grant 1121972 (SS) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslips (fPALM) | Electron Microscopy Services | 72225-01 | 25 mm Coverslips |
| PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) | SuSoS | - | Stock: 0.5 mg/ml in PBS |
| NeutrAvidin biotin-binding protein | Invitrogen | A2666 | Stock: 0.25 mg/ml in PBS |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21245 | 1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer |
| α-VSV-G | Invitrogen | ab34774 | 1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer |
| Gluox | Sigma | G2133-250KU | Glucose oxidase type seven from Aspergillius |
| Catalase | Sigma | C40-100mg | Catalase from Bovine liver |
| MEA | Sigma | 30070-10G | Cysteamine (MEA |
| Stock Buffer | 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 10 mM NaCl + 10% glucose | ||
| NTE | 10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA | ||
| Slide-A-Lyzer, mini dialysis unit | Thermo Scientific | 10,000 MW | |
| Microscope Cover Glass: 35 CIRCLE #1 | Fisherbrand | 35 CIRCLE #1 |
References
- Pang, H. -B., et al. Virion stiffness regulates immature HIV-1 entry. Retrovirology. 10, 4 (2013).
- Kol, N., et al. A Stiffness Switch in Human Immunodeficiency Virus. Biophys. J. 92, 1777-1783 (2007).
- Ortega-Esteban, A., et al. Minimizing tip–sample forces in jumping mode atomic force microscopy in liquid. Ultramicroscopy. 114, 56-61 (2012).
- Ortega-Esteban, A., et al. Monitoring dynamics of human adenovirus disassembly induced by mechanical fatigue. Sci. Rep. 3, (2013).
- Hernando-Pérez, M., et al. Physical Virology: Direct Measurement of Phage. phi29 Stiffness Provides Evidence of Internal Pressure (Small 15/2012). Small. 8, 2365-2365 (2012).
- Carrasco, C., et al. DNA-mediated anisotropic mechanical reinforcement of a virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13706-13711 (2006).
- Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption. Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).
- Visnapuu, M. -L., Duzdevich, D., Greene, E. C. The importance of surfaces in single-molecule bioscience. Mol. Biosyst. 4, 394-403 (2008).
- Elenko, M. P., Szostak, J. W., Van Oijen, A. M. Single-molecule binding experiments on long time scales. Rev. Sci. Instrum. 81, (2010).
- van Oijen, A. M., et al. Single-Molecule Kinetics of λ Exonuclease Reveal Base Dependence and Dynamic Disorder. Science. 301, 1235-1238 (2003).
- Böcking, T., Aguet, F., Harrison, S. C., Kirchhausen, T. Single-molecule analysis of a molecular disassemblase reveals the mechanism of Hsc70-driven clathrin uncoating. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 295-301 (2011).
- Cocucci, E., Aguet, F., Boulant, S., Kirchhausen, T. The First Five Seconds in the Life of a Clathrin-Coated Pit. Cell. 150, 495-507 (2012).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. 3, 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy. Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).
- Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat. Methods. 5, 527-529 (2008).
- Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. Actin, Spectrin, and Associated Proteins Form a Periodic Cytoskeletal Structure in Axons. Science. 339, 452-456 (2013).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Hodges, J., et al. Asymmetric packaging of polymerases within vesicular stomatitis virus. Biochemical and Biophysical Research Communications. 440, 271-276 (2013).
- Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).
