Summary
표면에 비리온의 부착은 슈퍼 해상도 형광 화상 진찰 또는 원자력 현미경 검사법 (AFM)에 의한 단일 virion 화상 진찰을 위한 요구 사항입니다. 여기서 우리는 AFM 및 초분해능 형광 이미징에 사용하기에 적합한 유리 표면에 대한 비온의 제어 접착을 위한 샘플 준비 방법을 시연한다.
Abstract
유리 표면에 비온의 고정은 단일 virion 이미징에서 중요한 단계입니다. 여기서 우리는 특이성을 가진 유리 표면에 단 하나 비약의 접착을 허용하는 단 하나 분자 화상 진찰 소사에서 채택된 기술을 제시합니다. 이러한 제제는 PLL-g-PEG 와 PLL-g-PEG-Biotin의 혼합물로 유리 표면을 접목하고, 아비딘층을 추가하고, 마지막으로 생체화 바이러스 특이적 항체의 부착을 통해 비리온 앵커를 만드는 것을 기반으로 한다. 우리는 원자력 현미경 검사법 (AFM) 및 초해상도 형광 화상 진찰을 포함하여 실험의 범위에 이 기술을 적용했습니다. 이 샘플 준비 방법은 표면에 대한 비온의 제어 접착을 초래한다.
Introduction
충전 기반비특이적 상호 작용은 원자력 현미경검사법 1,2에서비온의 유착을 위해 일상적으로 사용된다. 이러한 기술은 매우 뻣뻣한 캡시드3-6과비 봉투 된 virions에 사용할 때 특히 잘 작동합니다. 이러한 기술은 시료를 고정하는 데 매우 효과적이지만 표면에 단백질의 비특이적 결합을 방지하지는 않습니다. 비특이적 결합은 다양한 항체를 가진 견본의 잠양을 요구하는 AFM 및 초해상도 형광 기술로 virions를 심상시도하는 때 문제를 만들 수 있습니다. 여기서 우리는 virions의 특정 고정을위한 샘플 준비 방법을 설명합니다.
폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)는 폴리(L-lysine)(PLL)에 접목되어 유리 표면에 흡착되어 유리7을가진 단백질의 정전기 상호작용을 위한 중요한 블록을 제공한다. 유리 표면에 단일 분자의 고정화를 필요로 하는 단일 분자 소는 이 특성을 이용하고 특정 PEG 기반 단일 분자 고정 기술을 만드는 데 사용되었다8-10. 이러한 제제는 또한 유리표면(11)에 클래트린 케이지를 고정하고 대조군 세포 접착을위한 균질성 섬유네틴 코팅을 만드는 데 사용되었다.
단일 분자 이미징 방법론으로부터 유리 표면에 PLL-g-PEG 흡착에 기초한 샘플 준비 방법을 채택하고 이를 VEsicular 구내염 바이러스(VSV)의 단일 바이러스 를 이미징하는 데 적용했습니다. 이 단 하나 virions는 원자력 현미경 검사법 (AFM)를 사용하여 이미지되었다. 기능성 구슬에서도 대조군으로 유사한 실험이 수행되었다. 바이러스는 또한 알렉사 647로 표지된 VSV-G 항체가 단일 바이러스의 봉투의 이미지를 생성하는 데 사용되었다는 초해상도 형광 현미경 검사법에 의해 이미지되었다. 고분해능 형광 화상 진찰은 단일 분자의 국소화를 활용하여 이미지13-15를생성한다. fPALM 쌍면 이미징은 평면에서 20 nm와 광학 축15,16을따라 50 nm 해상도로 단일 분자의 국소화를 허용합니다. 이 쌍층 기술은 이 연구에 존재하는 초해상도 형광 심상을 이미지하기 위하여 이용되었습니다. 비슷한 결과를 가지고 다른 기술은 STORM13,17,18입니다.
이 논문에 설명된 절차에 의해 유리에 고정된 VSV의 AFM 및 초해상도 형광 이미지 모두 최소 비특이적 상호작용(19)을사용하여 유리에 대한 특이적 결합을 보였다. 여기서 우리는 AFM 및 초해상도 형광 화상 진찰 실험을 위한 견본 준비 프로토콜을 제시합니다. 요약: 클린 글래스 커버립은 PLL-g-PEG와 PLL-g-PEG-비오틴의 혼합물을 흡착하여 기능화됩니다. 이 박막은 코팅 된 표면에 15-25 % 기능성 비오틴을 제공하도록 설계되는 것이 일반적입니다. 커버립은 테트라메릭 아비딘으로 더 배양됩니다. 생체화 바이러스 항체는 그 때 virions를 위한 유일한 결합 사이트를 만드는 데 이용됩니다. 항체의 결합은 두 가지 방법으로 수행 될 수있다.
첫 번째 방법은 AFM에 최적화되어 있지만 초해상도 형광 이미징에 적합합니다. 이 방법에서 아비딘 코팅 표면은 바이러스 성 접착 전에 생체 개화 항체로 처리된다. 고정 된 virions는 봉투를 커버하고 바이러스의 초해상도 형광 이미징을 허용하기 위해 Alexa 647 표지 된 항체로 처리됩니다.
두 번째 방법은 아비딘 처리된 표면에 바이러스를 부착하기 전에 생체화 항체 및 Alexa 647 표지항체를 사용하여 용액에서 바이러스를 공격하는 것이다. 이 방법은 바이러스 봉투의 회복이 중요한 초해상도 형광 화상 진찰 실험에 최적화되어 있습니다. 이 방법은 바이러스 성 표면에 균일 한 항체 코팅을 허용하는 장점이 있다. 상기 생체화 항체는 바이러스 봉투의 외부에 높은 농도의 형광 라벨을 유지하면서 아비딘 처리된 표면에 바이러스의 충분한 흡착을 허용하는 비율로 Alexa 647 표지된 바이러스 항체와 혼합될 수 있다. 이러한 Alexa 647 표지 된 바이러스 성 항체는 생체 화되지 않으며 그들의 과잉은 배경 소음을 줄이기 위해 멀리 씻어 수 있습니다.
Protocol
1. 화학 준비
- PLL-g-PEG-비오틴 및 아비딘의 준비 및 저장:
- 1.0 mg/ml의 농도에서 제조업체의 지시에 따라 PBS 버퍼에서 폴리머 PLL-g-PEG-biotin을 용해하십시오.
- 표지 슬립 크기에 따라 알리 쿼트 (표 1참조) 최대 1 년 동안 -80 °C에 저장합니다.
- 아비딘/노이트르아비딘의 준비 및 보관
- 1.0 mg/ml의 농도에서 제조업체의 지시에 따라 PBS 버퍼에서 라벨이 없는 아비딘/NeutrAvidin을 용해하십시오.
- 표지 슬립 크기에 따라 알리 쿼트 (표 1참조) 최대 3 년 동안 -20 °C에 저장합니다.
- 바이러스 샘플 준비: 이 분석 전에 실험적 필요 및 실험실 프로토콜에 따라 바이러스 샘플을 준비합니다. 방법 5A용 단계 1.3.1 또는 방법 5B의 경우 1.3.2를 활용한다.
- 2단계 전에 5A 방법에 대한 바이러스 샘플을 준비한다. 준비 후 1-2일 이내에 준비된 바이러스 성 시료를 활용하거나, 커버 슬립 크기에 따라 알리쿼트(표 1참조)를 한 다음 액체 질소에 플래시 동결하고 최대 1년 동안 -80°C에 보관하십시오. 해동 시 즉시 사용하십시오.
- 1.3.1과 유사한 방법 5B에 대한 바이러스 샘플을 준비합니다. 5B에 앞서 바이러스의 알리쿼트를 해동하고 항체와 혼합하기 전에 24 시간 이상 4 °C에 저장하십시오.
- 실험에 적합한 생체 개화 항체를 준비하십시오.
2. 화학 적 치료 준비에 커버 슬립 청소
- 커버립을 수직 방향으로 잡고 여과(0.2 μm) 에틸 알코올(190 증거)으로 채워진 비커에 담는 적절한 크기의 테플론 커버슬립 랙에 커버립을 놓습니다.
- 30 분 동안 여과 된 에틸 알코올 (190 증거)에서 커버립을 초음파 처리합니다.
- 알코올에서 커버립을 제거하고 초순수물로 커버립을 광범위하게 헹구습니다.
- 헹구는 커버립을 별도의 깨끗한 테플론 랙에 놓고 1M NaOH로 채워진 비커를 놓습니다.
- 1 M NaOH에서 30분 동안 커버립을 초음파 처리합니다.
- NaOH에서 커버립을 제거하고 초순수물로 광범위하게 헹구습니다.
- 헹구는 커버를 질소 스트림으로 말리고 깨끗하고 건조한 테플론 랙에 넣습니다.
- 커버슬립에 남아 있는 눈에 보이는 필름이나 파티클에 대해 커버립을 검사합니다. 눈에 보이는 재료가 남아 있으면 커버슬립이 제대로 세척되지 않고 헹구지 않았습니다. 제대로 청소하지 않은 경우 반복 단계 2.1-2.7.
- 2 분 동안 산소 플라즈마로 커버립을 청소하십시오. 이 단계는 선택 사항이지만 권장됩니다.
3. PLL-g-PEG 박막 층 형성
- 질소 스트림(또는 선택적 산소 플라즈마)에서 건조한 직후, 멸균 페트리 접시에 뚜껑을 수평으로 놓습니다. 커버의 중심에 파이프슬립 해동 된 PBS 의 적절한 양의 PLL-g-PEG-비오틴을 버퍼링 (표 1참조).
- 또 다른 청소 커버 슬립을 샌드위치 방법으로 유체 위에 놓습니다. 이 방법은 현재 화학 층으로만 분리된 화학적 처리된 "활성 면"을 서로 방향으로 향하여 화학 필름을 배양하는 두 개의 커버립을 갖는 것으로 구성됩니다. 두 커버립 사이의 부피가 완전히 유체로 채워지지만 커버립 사이에 유체가 누출되지 않도록 충분한 유체가 있는지 확인하십시오(표 1참조). "액티브 페이스"는 이제부터 샌드위치 구성의 유체와 접촉한 커버슬립 면을 지정합니다.
- 페트리 접시 뚜껑을 커버슬립 샌드위치 위에 놓고 RT에서 45-60분 동안 배양합니다.
- 페트리 접시 뚜껑을 제거하고 핀셋으로 샌드위치를 집어 들세요. 과도한 액체를 꼬집어하지 않도록주의하십시오. 엄지와 검지 손가락을 사용하여 샌드위치를 가볍게 꼬집어 서로 반대로 커버립을 수평으로 밀어 넣은 다음 활성 면을 건드리지 않고 두 개의 커버립을 서로 분리합니다.
- 활성 면 25ml를 액티브 페이스 2-4배 위에 파이프로 파이프를 한 다음 질소 스트림으로 커버립을 건조시켜 두 활성 면을 초순수물로 헹구십시오. 어떤 커버슬립 면이 활성화되어 있는지 주의해야 합니다.
- 커버립을 즉시 활용하거나, 활성 면을 먼지가 없는 낮은 습도 환경에 배치한 멸균 페트리 접시에 활성 면을 업하여 O/N을 보관하십시오.
4. 아비딘 바인딩 향상
- PLL-g-PEG 처리 커버슬립을 활성 페이스업에 멸균 페트리 접시에 올려 놓습니다.
- 파이펫은 활성 면의 중간에 버퍼(1.2단계에서 준비)에 적절한 양의 해동 아비딘을 적당히 적어 보입니다.
- 샌드위치 방법의 유체 위에 다른 커버슬립(액티브 페이스 아래쪽)을 놓습니다. 커버립의 활성 면을 기록합니다. 활성 면이 인큐베이션 중에 유체와 접촉하는 것이 중요합니다(단계 3.2 참조).
- 페트리 접시 뚜껑을 커버슬립 샌드위치 위에 놓고 RT에서 25-30분 동안 배양합니다.
- 페트리 접시 뚜껑을 제거하고 3.4 단계에서 설명한 대로 두 개의 커버립을 분리하여 활성 면을 추적하고 만지지 않도록 합니다.
- 활성 면 25ml를 활성 면에 2-4배 파이프로 파이프로 헹구고 질소 스트림으로 커버립을 건조시다. 커버립의 활성 면을 기록합니다. 다음 단계에 즉시 사용하십시오.
중요 사항: 실험이 수반하는 분석의 유형에 따라 샘플 준비를 완료하기 위한 두 가지 방법이 있습니다. 실험자는 초해상도 이미징에 필요한 추가 항체 치료가 추가되기 전에 바이러스가 유리에 고정되는 단계 5A를 진행해야합니다. 5B는 유리에 고정하기 전에 용액에 바이러스를 라벨링하는 다른 방법을 설명합니다. 이 원고의 대표 데이터는 5A를 사용하여 준비됩니다. 실험 분석 유형에 따라 적절한 방법을 선택해야 합니다.
5A. 액티브 페이스 항체 테더
- 4.6 단계에서 질소 스트림으로 건조한 직후, 아비딘 처리 커버슬립 활성 면을 멸균 페트리 접시에 올려 놓습니다.
- 파이펫활성면의 중간에 완충되어 적정량의 해동된 생체화 항체(표 1참조).
- 다른 커버슬립(액티브 페이스 아래쪽)을 샌드위치 방법으로 유체 위에 놓습니다. 커버립의 활성 면을 참고, 활성 면이 인큐베이션용 유체와 접촉하는 것이 중요하다(단계 3.2.참조).
- 페트리 접시 뚜껑을 커버슬립 샌드위치 위에 놓고 RT에서 45-60분 동안 배양합니다.
- 페트리 접시 뚜껑을 제거하고 3.4 단계에서 설명한 대로 두 개의 커버립을 분리하여 활성 면을 추적하고 만지지 않도록 합니다.
- 액티브 페이스 2-4배 위에 PBS 25ml를 피펫팅하여 PBS로 두 활성 면을 헹구고 건조하지 않고 즉시 사용하십시오. 어떤 커버슬립 얼굴이 활성화되어 있는지 추적해야 합니다.
- 항체 처리 커버슬립 활성 면을 멸균 페트리 접시에 올려 놓고, 파이펫은 활성 면의 중간에 버퍼에 적절한 양의 해동 바이러스를 놓습니다.
- 다른 커버슬립(액티브 페이스 아래쪽)을 샌드위치 방법으로 유체 위에 놓습니다. 활성 면은 배양을 위한 유체와 접촉하는 것이 중요하기 때문에 활성 면을 유의하십시오(단계 3.2 참조).
- 페트리 접시 뚜껑을 커버슬립 샌드위치 위에 놓고 RT에서 45-60분 동안 배양합니다.
- 페트리 접시 뚜껑을 제거하고 3.4 단계에서 설명한 대로 두 개의 커버립을 분리하여 활성 면을 추적하고 만지지 않도록 합니다.
- 액티브 페이스 2-4x에 PBS 25ml를 피펫팅하여 PBS로 두 활성 면을 헹구습니다. 커버립을 말리지 말고, 대신 테플론 랙에 놓고 PBS로 채워진 비커를 즉시 배치하십시오. 어떤 커버슬립 얼굴이 활성화되어 있는지 추적해야 합니다.
- 준비된 샘플을 즉시 활용하거나 4°C에서 적절한 버퍼에 보관하여 무결성을 크게 잃지 않고 최대 3일 동안 보관하십시오.
중요 참고: 샘플이 AFM 분석에서 사용되는 경우, 준비는 완료되고 즉시 활용되거나 5A.20 - 5A.21 단계에 설명된 대로 저장될 수 있다. 샘플이 초분해능 형광 이미징 분석에서 활용되어야 하는 경우, 5A.12 - 5A.19 단계에 기재된 항체 라벨링을 진행한다. - 두 바이러스 처리 커버립을 멸균 페트리 접시에 활성 면과 커버슬립의 중앙 95%를 커버하기에 충분한 유체 부피를 구사할 수 있는 충분한 단백질 차단 버퍼를 커버슬립(일반적으로 100-200 μl)에 배치합니다. 60-90 분 RT에서 인큐베이션하십시오.
- 페트리 접시에서 한 번에 하나씩 커버립을 제거하고 커버슬립의 액체를 폐기물 비커에 부어 차단 버퍼를 조심스럽게 제거합니다. 커버슬립을 떨어뜨리지 않도록 주의하십시오.
- 액티브 페이스 2-4배 위에 PBS 25ml를 피펫팅하여 PBS로 두 활성 면을 헹구고 건조하지 않고 즉시 사용하십시오. 어떤 커버슬립 얼굴이 활성화되어 있는지 추적해야 합니다.
- 단일 블로킹 버퍼 처리 커버슬립 활성 면을 멸균 페트리 접시에 올려 놓고, 파이펫은 활성 면의 중간에 완충제에 적절한 양의 형광라벨 바이러스 항체를 배치한다.
- 다른 커버슬립(액티브 페이스 아래쪽)을 샌드위치 방법으로 유체 위에 놓습니다. 어떤 면이 활성화되어 있는지, 활성 면이 인큐베이션용 유체와 접촉하는 것이 중요하다(3.2단계 참조).
- 페트리 접시 뚜껑을 커버슬립 샌드위치 위에 놓고 RT에서 30분 동안 인큐베이션을 합니다.
- 페트리 접시 뚜껑을 제거하고 3.4 단계에서 설명한 대로 두 개의 커버립을 분리하여 활성 면을 추적하고 만지지 않도록 합니다.
- 액티브 페이스 2-4배 위에 PBS 25ml를 피펫팅하여 PBS로 두 활성 면을 헹구고 건조하지 않고 즉시 사용하십시오. 어떤 커버슬립 얼굴이 활성화되어 있는지 추적해야 합니다.
- 커버립을 말리지 말고 PBS로 채워진 비커 내에 테플론 랙에 넣습니다. 어떤 커버슬립 얼굴이 활성화되어 있는지 추적해야 합니다.
- 준비된 샘플을 즉시 활용하거나 4°C에서 적절한 버퍼에 보관하여 무결성을 크게 잃지 않고 최대 3일 동안 보관하십시오.
5B. 용액 항체 공격에서
이 방법은 초해상도 형광 이미징을 위한 라벨링 전략의 선택적 향상입니다. 용액 공격을 가함으로써 바이러스 성 표면에 더 나은 항체 코팅을 얻을 수 있습니다.
- 실험 필요에 따라 비율로 항체 솔루션을 혼합합니다. 실시예 1:4 01 mg/ml 바이오티니졸화 항체의 0.01 mg/ml 형광 표지 항체의 비율은 좋은 결합 친화성을 제공하고 초해상도 이미징 분석에서 좋은 봉투 회복을 허용할 것이다.
- 각각 (5B.1) 및 (1.3)에 제조된 항체 및 바이러스 용액의 동등한 부분을 혼합한다. 알리쿼트에서 몇 번 위아래로 파이프를 섞어 부드럽게 섞는다. 이 결과 용액은 4°C에서 최대 24시간 동안 필요할 때까지 저장할 수 있습니다.
- 4.6 단계가 완료되면, 멸균 페트리 접시에 활성 얼굴위로 아비딘 처리 커버 슬립을 배치합니다.
- 파이펫은 활성 면의 중간에 항체 용액(5B.2 단계에서 제조)을 가진 적절한 양의 바이러스를 한다.
- 다른 커버슬립(액티브 페이스 아래쪽)을 샌드위치 방법으로 유체 위에 놓습니다. 활성 면은 활성 면이 인큐베이션용 유체와 접촉하는 것이 중요하기 때문에 주의하십시오(3.2단계 참조).
- 페트리 접시 뚜껑을 커버슬립 샌드위치 위에 놓고 RT에서 45-60분 동안 배양합니다.
- 페트리 접시 뚜껑을 제거하고 3.4 단계에서 설명한 대로 두 개의 커버립을 분리하여 활성 면을 추적하고 만지지 않도록 합니다.
- 액티브 페이스 2-4x에 PBS 25ml를 피펫팅하여 PBS로 두 활성 면을 헹구습니다. 커버립을 말리지 말고, 대신 테플론 랙에 놓고 PBS로 채워진 비커를 즉시 배치하십시오. 어떤 커버슬립 얼굴이 활성화되어 있는지 추적해야 합니다.
- 준비된 샘플을 즉시 활용하거나 무결성을 크게 잃지 않고 최대 3일 동안 4°C에 보관하십시오.
6. 원자력 현미경 물질 특성 측정
- AFM 레이저를 켜고 AFM 소프트웨어를 엽니다. 오프닝 대화 상자에서 원하는 분석에 적합한 검색 모드를 선택합니다. 필요한 모든 창은 기본적으로 열려 야 합니다. 원하는 창을 열기 위해 사용자의 설명서를 참조하지 않을 경우.
- 원하는 측정에 적합한 캔틸레버를 선택하고 제조업체 지침에 따라 캔틸레버 하우징에 삽입합니다. 다양한 캔틸레버가 있는 다양한 조건과 실험 유형이 있습니다. 실험자는 필요에 따라 캔틸레버를 연구해야 합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 캔틸레버 하우징을 AFM 헤드에 삽입합니다.
- 샘플이 젖은 조건에서 사용되는 경우 저장소 버퍼에서 샘플을 제거하고 6.7 단계로 진행합니다.
- 샘플이 주변(dry) 조건에서 사용되는 경우 저장 버퍼에서 샘플을 제거하고 초순수 수의 비커에 담그어 간단히 헹구십시오. 참고: 이것은 낮은 스프링 상수를 갖는 캔틸레버와 모세관 매력을 유도 할 수있는 샘플에 얇은 수분 층을 남길 것입니다.
- 시료가 주변(dry) 조건에서 활용되어야 하는 경우 질소 스트림으로 샘플을 부드럽게 건조시로 건조시.
- 커버슬립의 뒷면을 먼지가 없는 필터 용지로 부드럽게 말리면 시료의 활성 면을 만지지 않도록 합니다.
- 샘플을 적절한 AFM 샘플 홀더에 배치한 다음 샘플을 AFM 단계에 배치합니다.
- 샘플이 젖은 조건에서 이미지화될 경우 소량의 버퍼가 샘플(~10 μl)에 스페펫을 합니다.
- AFM 헤드를 샘플 위에 놓습니다.
- 샘플이 젖은 경우 캔틸레버와 AFM 팁이 표면 층에 침투하고 캔틸레버와 캔틸레버 하우징 사이에 거품이 없는지 확인합니다.
- 최적의 신호를 얻기 위해 제조업체권장 사항에 따라 AFM 레이저를 캔틸레버와 정렬합니다.
- 캔틸레버 공진 주파수를 측정하고 실험 유형에 따라 스캔 주파수를 설정합니다.
- AFM 팁을 표면으로 낮추고 신호 설정을 최적화합니다.
- 선택한 모드에서 20 μm 사각형 AFM 스캔을 수행합니다. 탭(AC) 모드는 대표 데이터를 생성하는 데 사용되었습니다. 일반적으로 유리 표면에 날카로운 스파이크로 볼 수 있는 대략적인 높이에 의해 바이러스 후보를 식별합니다.
- 바이러스 후보를 선택하고 검사 헤드를 그 위에 중심으로 합니다.
- 토폴로지 및 방향을 얻기 위해 선택한 바이러스에 대한 250 nm 사각형 스캔(또는 적절한 슈퍼 해상도 검사)을 수행합니다.
- 재료 특성측정(예: 영의 계수 측정을 위한 구형 바이러스의 중심)을 위해 바이러스에 대한 점을 선택하고 제조업체의 지시에 따라 측정을 수행한다.
7. 초해상도 이미징 방법
- 초해상도 이미징 소프트웨어를 열고 제조업체의 지침에 따라 소프트웨어를 보정합니다.
- 형광 구슬을 활용하는 제조업체의 지시에 따라 초해상도 이미징 장비를 교정합니다.
- 1M MEA의 50 μl과 10x Gloxy의 100 μl을 스톡 버퍼 850 μl에 결합하여 이미징 직전에 주식에서 샘플 이미징 버퍼를 조립합니다. 실험 기간 동안 얼음에 이미징 버퍼를 유지합니다.
- 저장 버퍼에서 샘플로 준비된 커버슬립을 제거하고 초순수 수의 비커에 담그어 5배 헹구세요.
- 먼지가 없는 필터 용지를 사용하여 비활성 커버슬립 페이스를 건조시다. 활성 면을 만지지 않도록 하십시오.
- 이미징 시스템 샘플 홀더에 삽입하고 샘플 홀더에 이미징 버퍼 250 μl을 추가합니다. 일관된 결과를 유지하기 위해 2시간마다 샘플에서 이미징 버퍼를 교환하는 것이 합리적입니다.
- 파라필름으로 샘플 홀더를 덮어 실내 환경과의 대기 상호 작용을 줄입니다.
- 이미징을 위해 샘플 홀더를 이미징 장비에 넣습니다.
- 제조업체의 방향을 활용하여 샘플을 집중시다.
- 사용되는 슈퍼 해상도 기술에 따라 샘플을 이미지합니다. 화상 진찰 조건을 조정하여 신호를 최적화하는 동시에 사진 전환 형광의 동시 활성화를 줄여야 합니다.
중요 참고: 이미징 조건은 샘플에 따라 다르며 실험적 필요에 따라 다릅니다. 이미징 버퍼에서 어두운 상태로 효율적으로 초기화된 Alexa 647을 활용한 전형적인 실험은 405nm UV 광의 적용을 통해 사진 활성화될 수 있다. 이미지는 조밀하게 표지된 시료 내에서 Alexa 647 분자의 스파스 하위 집합을 흥미롭고 수집된 광자의 수에 의해 주로 제한된 정밀도로 각 플루오로포어를 국소화함으로써 얻어진다. 이 절차는 원하는 수의 획득 주기가 일어날 때까지 소프트웨어에 의해 반복적으로 반복됩니다. 실험자는 이 설정이 사진 표백된 샘플의 각 불소와 상관관계가 있어야 합니다. - 이미징이 완료되면 제조업체의 지시에 따라 이미징 장비를 종료합니다. 소프트웨어는 데이터 분석을 위해 열려 있을 수 있습니다.
- 데이터 분석은 실험에 크게 의존합니다. 그러나, 모든 경우에 그들의 전체 폭으로 바이러스를 반 최대로 식별, 알려진된 바이러스 치수에 비해, 고려 하 게 형광 라벨의 추가 크기.
- 더 나은 시각화를 위해 Isosurface 렌더링 옵션 또는 볼륨 렌더링 옵션을 활용하여 샘플을 볼 수 있으며, 둘 다 일반적으로 초해상도 이미징 소프트웨어에서 찾을 수 있습니다.
Representative Results
AFM을 이용한 단일 비리온 이미징:
위에서 설명한 샘플 준비 프로토콜은 유리 표면에 야생 형 비리온을 고정하는 데 사용되었습니다. VSV 비리온은 길이 180nm, 직경 80nm의 총알 모양입니다. 이 기술이 적용될 수 있는 다양한 비리가 있기 때문에, 개념은 또한 바이오티니화 36 nm 비드에서도 여기에서 입증된다. 결과 AFM 실험은 그림 1에표시됩니다. VSV 비온은 비봉투 바이러스 (GPa)에 비해 낮은 영의 변둘루 (100 MPa)를 가지고 있음을 주의하는 것이 중요합니다. 단일 virion VSV의 특정 이미지는 경직된 캔틸레버가 있는 주변 조건에서 태핑 모드에서 획득되었습니다. 목표는 바이러스 내의 여분의 단백질 밀도가 AFM 이미지 내의 범프로 볼 수 있는 지점까지 바이러스를 변형시키는 것입니다. 이 방법은 바이러스캐비티(19)내의 여분의 단백질 밀도를 검출하는 데 사용된다.
단일 비리온 슈퍼 해상도 이미징:
알렉사 647 표지 VSV-G 항체는 방법 5A를 사용하여 초해상도 실험을 위해 개별 VSV 비온의 봉투를 코팅하는 데 사용되었다. 테더링 밀도및 낮은 비특이적 결합을 보여주기 위해 샘플의 큰 스캔이 도 2A에표시됩니다. 대표 비리온에서 바이러스 봉투의 회수는 도 2B(파란색 등색)에 도시되어 있다.
그림 1. 기능화 PEGG 표면에 구슬과 VSV의 AFM 이미징. 36nm 생체개화 구슬(A,B)과VSV 비리온(C)의 AFM 스캔은 생체분해된 VSVG 항체로 표면에 고정된다. AFM은 AC 공기 지형 검사 모드에서 수행되었습니다. 팁 반경은 <25 nm이며, 측정은 힘 변조 및 빛 도청하에 수행되었다. 팁은 3 N/m의 힘 상수와 공진 주파수 75 kHz의 불확실성으로 15kHz의 불확실성을 가지고 있었습니다. 구슬은 AFM 스캔 중에 높이를 유지했지만 VSV 비온은 젊은 사람의 계수가 현저히 작으며 높이에서 크게 변형됩니다. 본 이미지에서 비리온은 작은 xy 컨볼루션(바이러스의 팁 대 무딘 끝을 결정하는 데 사용)을 생성한 도청 모드에서 딱딱한 캔틸레버로 구체적으로 이미지화되었으며 바이러스의 팁과 무딘 끝 사이의 높이 차이는바이러스(19)의무딘 끝에서 여분의 단백질 밀도를 검출하는 데 사용된다.
그림 2. PEGG 기능화 표면에 VSV 비온의 형광 기반 이미징. A)광야 형광에서 배양된 생체화 항체를 사용하여 PEGG 표면에 고정된 재조합 VSV 바이러스. B)바이오티니징 항체를 통해 PEGG 표면에 부착된 VSV의 봉투의 고해상도 형광 재구성및 알렉사 647 라벨이 부착된 항 VSVG 항체로 장식하였다(방법 5A는 이러한 이미지를 만드는 데 사용되었다). 파란색 표면은 2D 등면 투영입니다. 왼쪽은 글머리 기호 모양 바이러스의 모델을 보여줍니다.
| 커버슬립 사이즈 | 유동체 |
| 40mm | 65 μl |
| 35mm | 50 μl |
| 30mm | 36 μl |
| 25mm | 25 μl |
| 20mm | 16 μl |
표 1. 커버 슬립 크기에 따라 유체 알리쿼트.
Discussion
AFM 및 고해상도 형광 이미징을 사용한 단일 비리온 이미징은 CryoEM 단층 촬영의 대체 방법론으로 사용될 수 있습니다. 이러한 방법론의 각각은 특정 강점을 가지고 있습니다. 예를 들어 AFM은 샘플 또는 내부 바이러스 성 단백질에 태그를 지정할 필요없이 WT virions에서 수행 할 수 있습니다. 바이러스 구조의 위치는 비리온의 탄성 특성에 대한 기여에서 감소된다.
새로 개발된 바이러스 성 역 유전 접근법과 결합된 단일 비리온 슈퍼 해상도 이미징은 낮은 카피 수 바이러스 성단백질(20)을국소화하는 강력한 기술이 된다. 형광 단백질에 융합된 단백질과 단백질을 대체하는 재조합 바이러스는 이러한 역유전적 접근법을 사용하여 만들고 정제할 수 있다. 초해상도 화상 진찰은 유전 태깅 때문에 부분적으로 특이성을 가지고 있지만, 돌연변이 바이러스의 사용을 요구합니다.
AFM 및 초해상도 이미징은 매우 유사한 샘플 제제를 활용하는 무료 방법입니다. 이 논문에 설명된 방법은, 이전 단일 분자 화상 진찰 소사 양식을 채택하는, virions의 토폴로지에 거의 효력을 가진 단 하나 바이러스의 고정을 허용합니다.
Disclosures
저자는이 논문에서 경쟁 재정적 이익이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 원래 단일 분자 준비 프로토콜에 대한 박사 틸 뵈킹 감사합니다. 이 작업은 NSF 교부금 1121972(SS)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslips (fPALM) | Electron Microscopy Services | 72225-01 | 25 mm Coverslips |
| PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) | SuSoS | - | Stock: 0.5 mg/ml in PBS |
| NeutrAvidin biotin-binding protein | Invitrogen | A2666 | Stock: 0.25 mg/ml in PBS |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21245 | 1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer |
| α-VSV-G | Invitrogen | ab34774 | 1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer |
| Gluox | Sigma | G2133-250KU | Glucose oxidase type seven from Aspergillius |
| Catalase | Sigma | C40-100mg | Catalase from Bovine liver |
| MEA | Sigma | 30070-10G | Cysteamine (MEA |
| Stock Buffer | 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 10 mM NaCl + 10% glucose | ||
| NTE | 10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA | ||
| Slide-A-Lyzer, mini dialysis unit | Thermo Scientific | 10,000 MW | |
| Microscope Cover Glass: 35 CIRCLE #1 | Fisherbrand | 35 CIRCLE #1 |
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