La coinfección humana es difícil de replicar in vitro. Sin embargo, los parásitos de la malaria humana pueden cultivarse fácilmente in vitro, al igual que las células mononucleares de sangre periférica humana recién aisladas infectadas naturalmente con el VIH. Esto proporciona un modelo excelente para estudiar las respuestas inmunitarias tempranas a los parásitos de la malaria en el contexto de la coinfección por el VIH.
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En este artículo
Resumen
Resumen
La coinfección por malaria y VIH es una prioridad sanitaria creciente. Sin embargo, la mayoría de las investigaciones sobre la malaria o el VIH se centran actualmente en cada infección individualmente. Aunque es vital comprender la dinámica de la enfermedad para cada uno de estos patógenos de forma independiente, también es importante que se investiguen y comprendan las interacciones entre estos patógenos.
Hemos desarrollado un modelo in vitro versátil de coinfección VIH-malaria para estudiar las respuestas inmunitarias del huésped a la malaria en el contexto de la infección por VIH. Nuestro modelo permite el estudio de los factores secretados en sobrenadantes celulares, superficie celular y marcadores de proteínas intracelulares, así como los niveles de expresión de ARN. El diseño experimental y los métodos utilizados limitan la variabilidad y promueven la fiabilidad y reproducibilidad de los datos.
Todos los patógenos utilizados en este modelo son patógenos humanos naturales (Plasmodium falciparum y HIV-1), y todas las células infectadas se infectan de forma natural y se utilizan frescas. Utilizamos eritrocitos humanos parasitados con P. falciparum y mantenidos en cultivo continuo in vitro. Obtenemos células mononucleares de sangre periférica recién aisladas de voluntarios infectados crónicamente por el VIH. Cada condición utilizada tiene un control apropiado (P. falciparum parasitado vs. eritrocitos normales), y cada donante infectado por VIH tiene un control no infectado por VIH, del cual se recolectan células el mismo día. Este modelo proporciona un entorno realista para estudiar las interacciones entre los parásitos del paludismo y las células inmunitarias humanas en el contexto de la infección por el VIH.
Introducción
Co-infección, la infección con múltiples infecciones concurrentes, es la norma en los ambientes naturales. Co-infección puede tener un impacto importante en la patología de la enfermedad y en el manejo clínico de cada infección. En el contexto de la co-infección, la vacuna y la eficacia del medicamento, así como las pruebas de diagnóstico, puede ser afectado negativamente (revisado en 1). Sin embargo, a pesar de su importancia, la mayoría de las investigaciones de patógenos considera infecciones solamente individuales.
La malaria y el VIH-1 (VIH) son las principales causas de morbilidad y mortalidad a nivel mundial. Áreas de la....
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Protocolo
Este protocolo requiere el reclutamiento de donantes de suero y glóbulos rojos que se utilizarán para el cultivo del parásito, y el VIH (+) y no infectados donantes para el aislamiento de PBMC. Juntas de Revisión Institucional debe aprobar todos los estudios y todos los donantes deben dar su consentimiento informado antes de la extracción de sangre.
PRECAUCIÓN: El trabajo con muestras de sangre humana y parásitos del paludismo humano requiere de medidas cautelares. Siempre use una bata de laboratorio, guantes, y trabajar en un gabinete de bioseguridad de nivel 2. En caso de exposición percutánea accidental a la malaria humana, informar a ....
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Resultados
Los gráficos representan los niveles de producción de IFN a partir de células NKT (Figura 2), utilizando CD56 + CD3 + γδ- puertas para obtener la población las células NKT (datos no mostrados). Las células se cultivaron durante 72 horas antes de la tinción. Una vez teñidos, 100.000 células CD3 + fueron adquiridas en el citómetro de flujo para obtener grandes poblaciones suficientes de NK, NKT y las células delta gamma (células de interés). Un mínimo de 5.600 células NKT se muestran en cada gráfica. Se o.......
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Discusión
Nuestro protocolo se ha optimizado con el fin de estudiar más realista co-infección por el VIH in vitro de la malaria. En primer lugar, se requiere que los eritrocitos humanos frescos y suero para la cultura parásito de la malaria. Esto es vital para obtener una población saludable de parásitos de la malaria. Lisados de parásitos no pueden ser sustituidos por parásitos vivos como la producción de citoquinas es mucho más rápida e intensa al utilizar P. en vivo falciparum infecta RBC (PfRBC) <.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
C.A.M.F. y L.S. participaron en el diseño del protocolo, la adquisición y el análisis de datos, y en la redacción del artículo.
Los autores desean agradecer al Dr. Kain, al Dr. Loutfy, al Dr. Wasmuth y al Dr. Ayi por sus contribuciones.
C.F. fue apoyada por una beca postdoctoral de CTN/Ontario HIV Treatment Network (OHTN). L.S. cuenta con el apoyo de un Premio de Desarrollo de Investigadores Junior de OHTN. El presente trabajo fue apoyado por una subvención operativa de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) (MOP-13721 y 115160), y una subvención del CIHR New Investigator Catalyst.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Anticuerpos contra alanina | Sigma | A7377 | |
| (ver otra tabla) | |||
| BD Cytofix/Cytoperm con BD GolgiPlug | BD | 555028 | incluye brefeldina A, tampón cytofix/cytoperm y tampón permanente/wash |
| BD Vacutainer ACD Solution A | BD | 364506 | |
| BD Vacutainer Heparina sódica | BD | 17-1440-02 | |
| DPBS (sin calcio, sin magnesio) | Corning | 21-031-CV | |
| Suero fetal bovino | Sigma | F1051 | inactivar el calor antes |
| de usar Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| gentamicina (10 mg/ml) | Gibco | 15710-064 | |
| Hema3 Set de tinción | Fisher | 122-911 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| hipoxantina | Sigma | H9636 | |
| Ionomicina | Sigma | I3909 | |
| MEM aminoácidos no esenciales (10 mM) | Gibco | 11140 | |
| PMA | Sigma | P8139 | |
| RPMI-1640 polvo | Life-Technologies | 31800-022 | |
| RPMI-1640 con L-glutamina y HEPES | Thermo Scientific | SH30255.01 | |
| bicarbonato de sodio (polvo, cultivo celular) | Sigma | S5761 | |
| Piruvato de sodio (100 mM) | Gibco | 11360 | |
| Tris (base de Trizma) | Sigma | T6066 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| Azul Trypan (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| BD CompBead | BD | 552843, 552845 | depende de los anticuerpos utilizados |
| Mezcla de gases parásitos | Por pedido | 3% CO2, 1% O2, equilibrio N2 | |
| Equipo | |||
| 0,2 μ unidad | |||
| Portaobjetos de vidrio Matraces | |||
| T25 Matraces | |||
| T75 | |||
| Tubos de 50 ml 24 | |||
| placas de cultivo de pocillos | |||
| desenchufadas Pipetas | |||
| taponadas Pipetas | Pasteur | ||
| transferencia estériles | |||
| hemocitómetro | |||
| citómetro de flujo (3 láseres) | |||
| anticuerpos utilizados para citometría de flujo | |||
| Anti-TNF | eBiosciences | 551487 | FITC (fluoróforo) 2 μ l |
| Anti-IFNγ | Biolegend | 506507 | PE (fluoróforo) 20 μ l |
| Anti-CD8 | Biolegend | 300914 | PE-Cy7 (fluoróforo) 1 μ l |
| Biolegend anti-CD14 | ; BD Biosciences | 325624; 551487 | Biotina (fluoróforo) 0,5 μ l Estreptavina PE-TR (fluoróforo) 0.1 μ l |
| Anti-CD56 | Biolegend | 318322 | PerCP/Cy5.5 (fluoróforo) 5 μ l |
| Anti-γ δ | Biolegend | 331212 | APC (fluoróforo) 5 μ l |
| Anti-CD3 | Biolegend | 300426 | APC-Cy7 (fluoróforo) 5 μ l |
| Anti-CD4 | Biolegend | 317424 | Azul del Pacífico (fluoróforo) 1 μ l |
Referencias
- Graham, A. L., Cattadori, I. M., Lloyd-Smith, J. O., Ferrari, M. J., Bjørnstad, O. N. Transmission consequences of coinfection: cytokines writ large. Trends in parasitology. 23 (6), 284-291 (2007).
- French, N., et al. I....
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Reimpresiones y permisos
