Introduction
Co-infección, la infección con múltiples infecciones concurrentes, es la norma en los ambientes naturales. Co-infección puede tener un impacto importante en la patología de la enfermedad y en el manejo clínico de cada infección. En el contexto de la co-infección, la vacuna y la eficacia del medicamento, así como las pruebas de diagnóstico, puede ser afectado negativamente (revisado en 1). Sin embargo, a pesar de su importancia, la mayoría de las investigaciones de patógenos considera infecciones solamente individuales.
La malaria y el VIH-1 (VIH) son las principales causas de morbilidad y mortalidad a nivel mundial. Áreas de la malaria y el VIH endemicidad comparten una amplia superposición geográfica, poniendo a millones de personas en riesgo de coinfección y consecuentemente en riesgo de enfermedad clínica más grave 2-10. Las dos enfermedades interactúan negativamente. En las personas infectadas por el VIH, las cargas virales más altas de VIH y disminuciones temporales en los recuentos de células T CD4 + se puede ver durante una infección de la malaria, mientras quecargas de parásitos de la malaria y el riesgo de malaria clínica y grave son más altos en los individuos coinfectados 2,3,5,7,8,10. Los mecanismos por los que el VIH aumenta la gravedad de la malaria no se entienden completamente y garantiza una mayor investigación.
Aquí se describe un método por el cual la malaria y la co-infección con el VIH puede ser estudiado in vitro. En concreto, este método permite el examen de las respuestas inmunitarias donde la malaria es específica en el contexto de la infección por el VIH. Nuestro protocolo describe un sistema versátil co-cultivo utilizando recién aisladas células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) aisladas de donantes crónicamente infectados por el VIH in vitro y se cultivaron P. falciparum parasitada eritrocitos (PfRBC). El impacto de la terapia antirretroviral contra el VIH en estas respuestas también puede ser examinada utilizando PBMCs recogidos prospectivamente del VIH (+) donantes antes y después de la terapia.
Hemos utilizado este sistema para investigar el impacto de la infección por VIHen la respuesta inmune innata la malaria específico 11,12, y fueron capaces de determinar que IFN y TNF respuestas donde la malaria es específica se deterioran en las células NK, células NKT, delta gamma células T de VIH (+) donantes pre y post tratamiento antirretroviral del VIH . Además, hemos sido capaces de utilizar este sistema para determinar que las funciones de monocitos también se vean afectados en donantes VIH (+), pero se recuperan después de VIH el tratamiento antirretroviral.
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Protocol
Este protocolo requiere el reclutamiento de donantes de suero y glóbulos rojos que se utilizarán para el cultivo del parásito, y el VIH (+) y no infectados donantes para el aislamiento de PBMC. Juntas de Revisión Institucional debe aprobar todos los estudios y todos los donantes deben dar su consentimiento informado antes de la extracción de sangre.
PRECAUCIÓN: El trabajo con muestras de sangre humana y parásitos del paludismo humano requiere de medidas cautelares. Siempre use una bata de laboratorio, guantes, y trabajar en un gabinete de bioseguridad de nivel 2. En caso de exposición percutánea accidental a la malaria humana, informar a la Salud y Seguridad para el tratamiento profiláctico. La consideración adicional de seguridad también debe ser puesto en marcha para trabajar con sangre (+) del VIH. Use una bata de laboratorio vuelta cerrando. Guante doble (parte superior del guante deberá látex). Realizar cualquier manipulación en un gabinete de bioseguridad de nivel 2. No utilice ningún vidrio o de objetos punzantes. No utilice un aspirador. Coloque todos los elementos contaminados en solución Virox o lejía durante un mínimo de 1 hora antes de desecharlo.Lave todas las superficies con Virox y UV durante 1 hora después del uso. Tenga en cuenta que cada institución tendrá sus propias normas específicas de bioseguridad que se deben seguir. Denuncie todos exposiciones accidentales a sangre infectada con el VIH a la Salud y Seguridad para su evaluación y consideración de posibles profilaxis post-exposición.
Nota: Las diferentes cepas de P. existen parásitos de la malaria falciparum. ITG se utilizó para estos experimentos, pero diferentes cepas se puede utilizar. Excelentes instrucciones sobre congelación y descongelación parásitos Plasmodium falciparum se encuentran disponibles en el sitio web de MR4 13.
1. Hacer RPMI-A para Parásito de la malaria Cultura
- Hacer RPMI-0 mediante la mezcla de 950 ml de ddH 2 O, 1 paquete de polvo RPMI-1640, 6 g de HEPES, 2 g de bicarbonato de sodio, y 1,35 mg de hipoxantina.
- Descongele calor inactiva suero humano de dos donantes diferentes. Donantes AB son mejores, pero ninguna se pueden utilizar si los parásitos se cultivan en tipo Oglóbulos rojos (RBC). Invierta tubos para mezclar. Si el suero contiene partículas o es giro gruesa a 2.000 rpm y luego filtrar porción líquida utilizando una unidad de 0,45 micras filtro.
- El uso de un filtro de 0,2 micras unidad de filtro de 180 ml de RPMI-0, 20 ml de suero humano (10 ml de cada donante), y 0,5 ml de 10 mg / ml de gentamicina.
Nota: Suero humano puede obstruir el filtro de modo puede ser necesaria más de una unidad de filtro. - Etiqueta de la botella de medio con RPMI-A, la fecha, y la fuente del suero. Refrigere hasta que sea necesario. RPMI-A puede volverse turbia cuando refrigerado. Esto es normal, pero el aumento de la nubosidad es un signo de contaminación.
Nota: el crecimiento del parásito puede variar en diferentes suero del donante. Es una buena idea para poner a prueba todos los lotes de suero humano para el buen crecimiento del parásito antes de usar.
2. Preparación de los glóbulos rojos de la sangre humana para Parásito Cultura
Nota: Los donantes de sangre deben ser de tipo O.
- Recoger 7-10 ml de sangre en ácido-cit(ACD) tubos de tasa-dextrosa. Escribe DNI y fecha de recogida en la etiqueta del donante.
- Sangre tienda a 4 ° C hasta que sea necesario. Utilice la sangre para cultivos de parásitos dentro de 1 mes.
- Limpiar la parte superior del tubo con etanol al 70%. Retire con cuidado el tapón y deseche. Transferencia de sangre en un tubo de 15 ml. Centrifugado durante 3 minutos a 1000 x g. Eliminar plasma por aspiración.
- Suspender RBC con un volumen igual de cálida RPMI-0. Centrifugado durante 5 min a 1000 x g. Retire la capa leucocitaria por aspiración, resuspender en 5 ml de RPMI-0 y repita el lavado 2 veces más.
- Eliminar el sobrenadante y añadir una cantidad suficiente RPMI-A para producir una mezcla que es 50% en volumen RBC.
- Almacenar a 4 ° C hasta que se necesite.
3. El mantenimiento de las Culturas del parásito
- Pre-caliente RPMI-A a 37 ° C
- Coloque parásitos descongeladas (véase el protocolo MR4 para el procedimiento de descongelación) en un matraz T25 con 5 ml de RPMI-A y 75 l de RBC lavados humana para un hematocrito de ~ 3%.Nota: El hematocrito mide el volumen de RBC en comparación con volumen total. Para calcular el hematocrito medir el volumen de empaquetado RBC al volumen total de medio de más de RBC. Suponga que los parásitos descongelados contribuirán 75 l de RBC. Mediante la adición de 150 l de RBC de valores (que es equivalente a la adición de 75 l de empaquetado RBC) al matraz hay un total de 150 l de RBC en 5 ml de medio, lo que equivale a un hematocrito de 3% (150 l / 5000 l x 100% = 3%).
- Gas el matraz durante 30 seg con la mezcla de gas parásito (1% O 2, 3% de CO 2, el balance de N 2). Selle y coloque el lado ancho frasco en una incubadora a 37 ° para permitir la mayor área de superficie para el intercambio gaseoso.
- Para cambiar el medio y verifique la parasitemia (que hay que hacer todos los días), mueva con cuidado el frasco para no perturbar la capa de RBC. Utilizando una pipeta Pasteur estéril desenchufado extraiga el medio de cultivo sin perturbar la capa de sangre.
- Para comprobar parasitemia, extraiga una muestra de 10 l de la capa de sangre, lo coloca en un portaobjetos de vidrio y el uso de una segunda lámina de vidrio crean una película fina sangre. Deje que se seque la diapositiva.
- Colocar 4 ml de RPMI-A en el matraz, mezclar suavemente, gas durante 30 segundos, y el lugar en una incubadora a 37 ° C.
- Manchar la diapositiva utilizando el kit de tinción Hema3 según el protocolo del fabricante.
- Para la tinción óptima, la inmersión se desliza en la solución de fijación durante 10 s, la solución yo por 10 seg, y la solución II para 30 seg. Enjuagar con agua y dejar que se sequen.
- Calcula parasitemia contando el número de PfRBC (teñido de color púrpura oscuro) en comparación con el número total de glóbulos rojos (rosa manchado). Cuenta con un total de 300 células para asegurar la precisión.
- Cuando los parásitos han alcanzado una parasitemia del 5%, expandir el cultivo en un matraz T75, utilizando 40 ml de RPMI-A y 500 l de RBC.
4. Parásito Sincronización
Nota: El día antes de tque experimentar, sincronizar el cultivo de parásitos por tratamiento con alanina. Solamente los parásitos anillo etapa y no infectada RBC sobrevivirán este tratamiento. Sincronización de alanina le dará una cultura trophozoite pura al día siguiente, que puede ser utilizado en los experimentos de co-cultivo. Asegúrese de comenzar con una cultura parásito que contiene la mayoría de los parásitos etapa anillo.
- Preparar la solución de alanina mediante la mezcla de 8,01 g de alanina (300 mM) y 0,365 g de Tris (10 mM) en 300 ml de ddH 2 O. Traiga pH a 7,4. Filtrar esterilizar utilizando una unidad de 0,2 micras filtro.
- Solución alanina Pre-caliente a 37 ° C
- Gira por el cultivo de parásitos (5 min x 1000 x g) y retire medio.
- Resuspender pellet en 19 volúmenes de solución de alanina (1 ml embalados RBC a 19 ml de solución de alanina). Incubar durante 15 min a TA.
- Vuelta 5 min x 1000 x g. Aspirar el sobrenadante. Lave en RPMI-0 una vez. Aspirar el sobrenadante y resuspender en medio RPMI-A y ajustar el hematocrito a ~ 3%. Gcomo frasco y vuelta a 37 o C.
Nota: Para los experimentos de co-cultivo se necesita un mínimo de parasitemia 5% trofozoítos, con un 10% de parasitemia considerado óptimo.
5. parásito y Preparación de RBC para experimentos de co-cultivo
- Utilice una relación de 3 PfRBC por PBMC en experimentos de co-cultivo para inducir una respuesta inflamatoria. Para calcular total de PfRBC, cuantificar parasitemia haciendo un frotis de sangre delgada como se describe en 3.5, y el hematocrito contando el número de RBC por ml de cultivo de parásitos utilizando un hemocitómetro.
Número de PfRBC =% parasitemia x total de RBC / ml x ml de cultivo. Por ejemplo: 10 ml de cultivo a 10 parasitemia x 10 6 RBC / ml y 10% es igual a 0,1 x 10 6 / ml x 10 ml = 10 x 10 6 PfRBC. - Girar el cultivo de parásitos durante 5 min a 1.000 xg (RT). Aspirar medio, y resuspender en 6 x 10 6 PfRBC por ml en RPMI-S + (500 ml RPMI-1640 suplementado con L-glutamina y HEPES, 10% de calorFBS inactivado, 1,5 ml de gentamicina, 5 ml de piruvato sódico 100 mM, 5 ml de 10 mM MEM aminoácidos no esenciales, 5 ml de β-mercaptoetanol 5 mM).
- Tomar la sangre de control (no infectada RBC del mismo donante usado para mantener el cultivo de parásitos), calcular el hematocrito y resuspender en RPMI-S + en el mismo número de RBC por ml como el cultivo de parásitos.
6. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC)
- Recoger la sangre venosa en tubos de heparina sódica (tapa verde), tanto desde el VIH (+) de donantes crónica y un VIH (-) de control. No utilice EDTA como un anticoagulante como la acción quelante de calcio de EDTA afecta a la función celular. En promedio esperar entre 5-10 x 10 6 PBMC por cada 10 ml de sangre. Para un experimento típico recoger 30 ml de sangre de cada donante. Tendrá que ser ajustado de acuerdo a los requisitos experimentales El volumen de sangre.
- Tan pronto como sea posible y, definitivamente, a una hora de sangre que se recoge,quitar la sangre de los tubos y el lugar en un tubo de 50 ml de plástico. Los monocitos, en particular, se activarán y se adhieren al vidrio, por lo que es importante que las células Si se utilizan tubos de recogida de sangre de vidrio se eliminan lo antes posible.
- Girar la sangre a 1.000 xg durante 15 min y recoger plasma (esto puede ser utilizado para otros estudios si es necesario - si no es este paso puede ser omitido). Se diluye la sangre en un volumen igual de DPBS frío.
- Colocar 15 ml de Ficoll RT en un tubo de 50 ml. Poco a poco, usando una pipeta de transferencia de plástico estéril, la capa de la solución / DPBS sangre sobre el Ficoll sin ninguna mezcla. Un máximo de 25 ml de solución / DPBS sangre puede ser en capas sobre cada uno 15 ml de Ficoll.
- Haga girar los gradientes durante 30 minutos a temperatura ambiente a 600 x g. Asegúrese de que el ajuste "sin frenos" está activado.
- Una vez que las células han hilado, buscar la interfase entre las dos fases. Aquí es donde las CMSP son. Usando una pipeta de transferencia de plástico estéril recoger el PBMC de la interfaz (verFigura 1). Reducir al mínimo la contaminación por RBC.
- Coloque células recogidas en tubos de 50 ml, con no más de 20 ml por tubo. Top tubo de hasta 50 ml con DPBS frío estériles.
- Haga girar las células durante 10 minutos a 4 ° C a 300 x g.
- Desechar el sobrenadante, resuspender el pellet en 5 ml de DPBS frío estériles y agrupar todas las células del mismo donante en un tubo. Arriba hasta 50 ml con DPBS estériles, y repetir el lavado pasos 2 veces más.
- Resuspender las células en 10 ml de RPMI-S + medio.
- Sacar una parte alícuota de 20 l y se mezcla con 20 l de azul de tripano. Pipeta 10 l en un hemocitómetro y contar las células vivas (células que no han tomado el colorante azul - todas las células azules están muertos). Utilice un hemocitómetro para calcular el número de células en una solución de la siguiente manera.
Nota: un hemocitómetro tiene una rejilla de dimensiones especificadas de manera que se conoce el área cubierta por las líneas.- Asegúrese de que el hemocitómetro está limpio. Coloque el cubreobjetos sobre la countiárea ng. Cargar 10 l de solución de células mediante la colocación de la punta de pipeta en una de las cavidades en forma de V. El área bajo el cubreobjetos va a llenar por acción capilar.
- Coloque el hemocitómetro cargado bajo un microscopio. La red completa del hemocitómetro contiene 9 cuadrados de 1 mm 2 cada uno. Contar todas las células dentro de cada gran plaza. Si demasiadas células están presentes, se diluye la solución más allá y recuento.
- Calcular la concentración de células como sigue: células totales / ml = (total de células contadas / # de cuadrados) x factor de dilución x 10.000 células / ml, por ejemplo, (500 células / 5 cuadrados) x factor de dilución de 20 x 10.000 células / ml = 20 x 10 6 células en total.
- Ajuste medio a una concentración final de 10 x 10 6 por ml (RPMI-S + medio).
7. Malaria / Co-infección por VIH Cultura
- Plate 100 l de PBMCs aisladas y 400 l de RPMI-S + medio a una placa de 24 pocillos (1 x 10 6 PBMC por pocillo). Asegurarque los pozos se establecieron por triplicado: 3 pozos para no infectada RBC, 3 pozos con PfRBC, 3 pozos con medio, y 3 pozos con PMA / ionomicina. Esto es tanto para el VIH (+) y el VIH (-) de la muestra.
- Para la pozos PfRBC, coloque 3 x 10 6 PfRBC en cada uno de los pocillos (500 l de cultivo de parásitos preparados en 5.2).
- Para no infectada RBC pozos, colocar 500 l de la cultura RBC no infectado preparado en 5.3 en cada uno de los pocillos.
- Para los pozos medianas, colocar 500 l de RPMI-S + medio en cada uno de los pocillos.
- Para PMA / ionomicina pozos, preparar la solución de PMA / ionomicina (2,5 pg / ml, 250 pg / ml, respectivamente). Coloque 500 l de esta solución en cada pocillo.
Nota: Como potentes estimuladores de la secreción de citoquinas de células T, PMA e ionomicina se utilizan como un control positivo para asegurar células son funcionales. - Coloque la placa a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%.
- Opcional: utilizar el exceso de células para el análisis fenotípico mediante citometría de flujo o almacenar en un RNUna solución de estabilización para el futuro análisis de la expresión de ARNm.
8. Detección de respuestas inmunes Malaria
Nota: Realice experimentos de co-cultivo durante el tiempo de 4 días. No se requiere cambio de medio durante este tiempo. El momento óptimo dependerá del tipo de célula de interés y la pregunta formulada. Una incubación de 12 a 48 horas es óptimo para las respuestas monocıticas a PfRBCs, mientras que las respuestas de linfocitos se observan mejor en 72 a 96 h. Tendrán que ser optimizado basado en la pregunta experimental Los puntos de tiempo. Períodos más cortos (2-4 h) pueden ser utilizados si la interacción entre PfRBC intacto y PBMCs es de interés.
- Placa de centrifugado a 300 xg durante 3 min a las células de pellets. Recoger 700 l de sobrenadante de cultivo de cada pocillo.
- Haga girar sobrenadante a 1000 xg durante 5 min a clara de los residuos.
- Alícuota sobrenadante se aclaró, según sea necesario, la etiqueta y la congelación por debajo de -20 ° C hasta el análisis de los factores secretados es ser performó.
- Analizar las respuestas de citoquinas / quimioquinas por ELISA o bolas de serie (seguir los protocolos sugeridos por el fabricante).
- Recoger las células restantes en la placa en una solución de ARN de estabilización y utilizar para el análisis de la expresión de ARNm por cuantitativa en tiempo real PCR 14-16 de.
9. intracelular Citometría de Flujo para Respuestas Ccytokine de células específicas utilizando PBMC co-cultivadas con P. falciparum infectados RBC
Nota: Como se mencionó anteriormente la longitud de co-cultivo dependerá del tipo celular de interés. Si está interesado en las respuestas monocıticas a PfRBC un período de incubación más corto que se necesita. Los tiempos será más largo para las respuestas de linfocitos innatas delta gamma células T, células NK, células NKT), y ya siendo para las células T CD4 y CD8. Se requerirá la optimización.
- 6-8 horas antes del análisis añadir 1 l de 1.000 x brefeldin A a todos los pocillos. Devuelva la placa a 37 ° C incubadora. Después incub 6-8 hración, lugar placa en hielo durante 15 min.
- Retire las células de los pozos mediante pipeteo vigoroso y colocarlos en tubos de microcentrífuga etiquetados. Raspar puede ser necesaria para eliminar los monocitos.
- Centrifugar las células durante 5 minutos a 1000 x g. Retire sobrenadantes. Resuspender las células en 500 l de tampón de citometría de flujo (1x DPBS, 2% de FBS inactivado por calor, 0,02% de azida de sodio).
- Las células se dividen de tal manera que cada muestra tiene: un tubo para la tinción de anticuerpo completo (240 l), y un tubo para la tinción fluorescente menos uno (FMO) anticuerpo de control (240 l). Aunar una pequeña cantidad de cada muestra (20 l) para el flujo sin mancha citometría de control (esto será utilizado en la creación del citómetro de flujo).
- Centrifugar las células durante 5 min a 500 x g. Retire sobrenadantes.
- Se incuban las células con CD16 no conjugado anti-humano / CD32 (5 mg / ml) en 50 l de citometría de flujo tampón durante 15 min a 4 ° C para bloquear los receptores Fc.
- Añadir 1 ml de tampón de citometría de flujo a cada tubo. Girar ceLLS para 5 min a 500 x g. Retire sobrenadantes.
- Resuspender las células en 50 l de tampón de citometría de flujo con una concentración pre-titulada de anticuerpos conjugado con fluoróforo a marcadores de superficie celular deseados. Solución suficiente de anticuerpos pre-mezcla para todas las muestras que se tiñe. Se incuban las células a 4 ° C durante 20 min. Proteger de la light.Note: Cantidad de cada anticuerpo tendrá que ser optimizado. Rutinariamente manchas para CD56, CD3, γδ, CD4, CD8, CD14. Volúmenes titularon para estos anticuerpos se muestran en la Tabla 1.
- Añadir 1 ml de tampón de citometría de flujo a cada tubo. Centrifugar las células durante 5 min a 500 x g. Retire sobrenadantes.
- Añadir 100 l de solución de Cytofix / Cytoperm a cada tubo. Se incuban las células durante 20 min a 4 ° C Proteger de la luz.
- Añadir 1 ml de tampón perm / lavado (siempre tan concentrado 10x - diluir a 1x usando ddH2O) a cada tubo. Centrifugar las células durante 5 min a 500 x g. Retire sobrenadantes.
- Añadir 100 μl de perm / tampón de lavado de tubos de tinción de anticuerpos de control de FMO y mezcle para resuspender las células.
- Añadir 100 l de tampón perm / lavado con una concentración pre-titulada de anticuerpos fluoróforo conjugado a marcadores intracelulares deseados (es decir, citoquinas / quimioquinas) a tubos de tinción de anticuerpos completos.
Nota: La cantidad de cada anticuerpo tendrá que ser optimizado. Rutinariamente mancha con anticuerpos anti-IFN anti-TNF y. Volúmenes titularon para estos anticuerpos se muestran en la Tabla 1. - Incubar todos los tubos durante 30 min a 4 ° C. Proteger de la luz.
- Añadir 1 ml de tampón de Perm / Wash a cada tubo. Centrifugar las células durante 5 min a 500 x g. Retire sobrenadantes.
- Resuspender las células en 300 l de tampón de citometría de flujo con 1% de paraformaldehído. Deje reposar durante un mínimo de 15 minutos para neutralizar el VIH.
- Preparar los anticuerpos solo muestras teñidas utilizando cuentas de compensación, que se utilizará para la indemnización establecido en el citómetro de flujo. El tipo de compensacióncuentas dependerán de los anticuerpos utilizados (es decir., anti-Ig de ratón, anti-rata / hamster Ig). Perlas Vortex. Añadir una gota de perlas al anticuerpo. Añadir cantidades iguales de anticuerpo tal como se utiliza para la tinción. Añadir 200 l de tampón de citometría de flujo. Estos son ahora listo para su uso. No hay necesidad de lavar las perlas.
- Adquirir las muestras en un citómetro de flujo tan pronto como sea posible y dentro de las 24 horas para obtener mejores resultados. Colorantes tándem son susceptibles a la disociación con almacenamiento por lo que recomendamos la adquisición inmediata si es posible.
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Representative Results
Los gráficos representan los niveles de producción de IFN a partir de células NKT (Figura 2), utilizando CD56 + CD3 + γδ- puertas para obtener la población las células NKT (datos no mostrados). Las células se cultivaron durante 72 horas antes de la tinción. Una vez teñidos, 100.000 células CD3 + fueron adquiridas en el citómetro de flujo para obtener grandes poblaciones suficientes de NK, NKT y las células delta gamma (células de interés). Un mínimo de 5.600 células NKT se muestran en cada gráfica. Se obtiene la producción de TNF de la misma manera (datos no mostrados). Los gráficos demuestran claramente que la producción de IFN es menor en células de individuos VIH en comparación con el VIH (+) - individuos expuestos a PfRBC ().
Citometría de flujo análisis es muy subjetiva. Por tanto, es esencial tener todos los controles adecuados para cada experimento (ver Figura 2). Los niveles de fondo se calculan utilizando las muestras de FMO, lo que permite una verdadera representación de la tinción de citoquinas.Las células estimuladas con PMA / ionomicina se utilizaron como un control positivo (datos no mostrados). PMA e ionomicina son fuertes estimuladores de T producción de citoquinas de células. A falta de producción de IFN en estas muestras lo más probable indica un problema con el protocolo de tinción. Sin embargo, otras variables como la viabilidad celular o reactivos inactivos también pueden tener la culpa.
Figura 1. Representación de Ficoll posterior gradiente de giro que demuestra la posición del CMSP.
Figura 2. la producción de IFN γ por las células T asesinas naturales. Los diagramas de flujo se obtuvieron por gating en CD56 + CD3 + γδ- células (mínimo de 5.600 eventos). La producción de IFN es detectable en el VIH (-) muestra estimulada conP. falciparum infecta las células rojas de la sangre. Esta respuesta de citoquinas ya no evidente en el contexto de una infección crónica por el VIH es. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Nuestro protocolo se ha optimizado con el fin de estudiar más realista co-infección por el VIH in vitro de la malaria. En primer lugar, se requiere que los eritrocitos humanos frescos y suero para la cultura parásito de la malaria. Esto es vital para obtener una población saludable de parásitos de la malaria. Lisados de parásitos no pueden ser sustituidos por parásitos vivos como la producción de citoquinas es mucho más rápida e intensa al utilizar P. en vivo falciparum infecta RBC (PfRBC) 17,18. Además, la activación de tipos de células como las células NK, requiere PfRBCs enteros, y no funciona eficientemente con lisados de parásitos. Esto puede ser debido a la necesidad de contacto directo entre el PfRBC y los leucocitos o puede ser debido a la naturaleza inestable de los ligandos derivados de parásitos que interactúan con receptores de superficie celular 18. Culturas Malaria PfRBC también deben estar bien sincronizados (Protocolo 4) antes del experimento. PfRBCs sincronizados mejorar la reproducibilidad de los datos experimentales. Aunque este protocolo deescribas el uso de la fase de trofozoito PfRBC para co-cultivo, que pueden ser fácilmente modificados para el estudio de fase anillo PfRBC.
Leucocitos humanos pueden ser infectados artificialmente con el VIH, y este método se ha utilizado en estudios de investigación co-infección de la malaria-VIH 20. Sin embargo, esto no modela la desregulación inmune que resulta de la infección crónica por el VIH. En este sistema de co-cultivo utilizamos PBMCs aisladas de los participantes humanos que están infectados crónicamente con el VIH-1. Cuando se requieren los participantes para un estudio, es importante seleccionar cuidadosamente esta población. Los criterios de inclusión y exclusión son vitales para garantizar la variabilidad mínima y máxima reproducibilidad. Nuestros criterios incluyen una definición clara de la infección crónica por el VIH (infectados por el VIH durante> 1 año, con CD4 + de células T declive recuento de> 50 células / mm 3 / año) y la exclusión de cualquier persona con una infección concurrente. Esto aseguró que los resultados obtenidos podrían atribuirse por loLely al efecto de la infección crónica por VIH, y no otra infección. Además, desde que estábamos interesados en la respuesta inmune innata a la malaria se excluyeron los donantes que tenían infección previa malaria.
Los controles no infectados por VIH también se utilizan para cada VIH (+) de los donantes, en cada punto de tiempo de muestreo, para permitir la normalización de datos. Un intento se debe hacer para que coincida con los controles a sus respectivos VIH (+) de donantes durante un mínimo de edad, pero preferiblemente también el sexo (aunque en nuestro estudio anterior 12 que no observó una diferencia significativa en subconjuntos de células o respuestas de citocinas entre mujeres y hombres VIH- participantes no infectadas). Si el muestreo prospectivo está planificada manteniendo el mismo control del VIH-no infectada por cada punto de tiempo de muestreo es beneficioso. Las respuestas pueden variar de un experimento a otro debido a múltiples factores, entre ellos la salud de los PfRBCs, su grado de sincronización, el nivel de parasitemia y la etapa de madurez de PfRBCs, y el nivel de hematocrito. Cuidadohay que tener para mantener el mayor número de ellos consistente entre experimentos. La normalización a un control no infectado por el VIH permite cierta contabilización de estas variables.
El uso de células frescas es de suma importancia para evitar resultados artificiales. Muestras de congelación y descongelación pueden tener un impacto significativo en 21,22 viabilidad celular, la producción de citoquinas 23-26 y fenotípica superficie celular marcadores 27.
Si los monocitos son de particular interés, es importante que el vidrio no se utiliza durante el protocolo. Los monocitos se adhieren al vidrio y muchos otros plásticos 28. Utilizamos pipetas de polipropileno plástico, pipetas de transferencia, y tubos de largo para minimizar la adhesión de monocitos y la eliminación definitiva de nuestros poblaciones celulares estudio.
Al configurar la citometría de flujo ensayo, cualquier combinación de anticuerpos se puede utilizar dependiendo de las células de interés. Estamos particularmente interesados en IFN y TNF producciónde las células NK, las células NKT y las células T delta gamma. Esto define nuestro panel de anticuerpos. Sin embargo, si se utiliza una combinación diferente, es importante para optimizar las cantidades de anticuerpo para cada panel. Esto es vital para evitar datos erróneos. Además, para evitar la variabilidad y asegurar la validez, se requieren FMOs para evaluar los niveles de citoquinas de fondo para cada condición (RBC, PfRBC, mediano y PMA / ionomicina) y la población participante (VIH (-) y VIH (+), Figura 2). Medición de la producción in vitro de citoquinas intracelulares por lo general resulta en altos niveles de fondo, especialmente cuando las células se han cultivado antes de la tinción. Dado que las condiciones de cultivo afectan a los niveles de fondo, FMOs adecuados garantizan el conocimiento del nivel de fondo para cada muestra. Nuestra oferta de células era limitada, por lo tanto, hemos diseñado nuestros FMOs para contener todas las manchas de la superficie, pero sin manchas intracelulares. Esto permite la comparación específica de los niveles de fondo de citoquinas en todos los diferentes tipos de células estudiados.También realizamos una sola mancha por experimento para cada uno de los marcadores de superficie para confirmar sus niveles de fondo.
El protocolo descrito es un versátil, que puede ser utilizado para examinar respuestas dentro de horas o días, dependiendo de las células de interés. Para una óptima producción de citoquinas inducida por PfRBC de linfocitos innatas, que mide la citometría de flujo de salida después de 2 o 3 días. Al mirar los monocitos, se recomiendan los puntos de tiempo anterior (1 o 2 días). Este sistema permite múltiples tipos de células y las respuestas de células que se distinguen por citometría de flujo, las respuestas secretoras que se midieron en los sobrenadantes celulares y perfiles de expresión para ser evaluada en el ARN extraído. Además, el uso de anticuerpos para bloquear los receptores específicos o neutralizar las citocinas se pueden utilizar en este sistema para diseccionar los mecanismos. Hemos utilizado con éxito la IL-18 el bloqueo del receptor de implicar a la IL-18 receptor en las respuestas IFN inducidos PfRBC 12. Este sistema representa un realistaic método por el cual para evaluar una serie de la respuesta inmune innata a la malaria en el contexto de la infección por VIH.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alanine | Sigma | A7377 | |
| antibodies (see other table) | |||
| BD Cytofix/Cytoperm with BD GolgiPlug | BD | 555028 | includes brefeldin A, cytofix/cytoperm buffer and perm/wash buffer |
| BD Vacutainer ACD Solution A | BD | 364506 | |
| BD Vacutainer Sodium Heparin | BD | 17-1440-02 | |
| DPBS (no calcium, no magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F1051 | heat inactivate before use |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| gentamycin (10 mg/ml) | Gibco | 15710-064 | |
| Hema3 Staining Set | Fisher | 122-911 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| Ionomycin | Sigma | I3909 | |
| MEM non-essential amino acids (10 mM) | Gibco | 11140 | |
| PMA | Sigma | P8139 | |
| RPMI-1640 powder | Life-Technologies | 31800-022 | |
| RPMI-1640 with L-glutamine and HEPES | Thermo Scientific | SH30255.01 | |
| sodium bicarbonate (powder, cell culture) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360 | |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T6066 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| Trypan Blue (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| BD CompBead | BD | 552843, 552845 | depends on antibodies used |
| Parasite Gas Mixture | By special order | 3% CO2, 1% O2, balance N2 | |
| Equipment | |||
| 0.2 μm filter unit | |||
| Glass slides | |||
| T25 flasks | |||
| T75 flasks | |||
| 50 ml tubes | |||
| 24 well culture plates | |||
| unplugged Pasteur pipettes | |||
| plugged Pasteur pipettes | |||
| sterile transfer pipettes | |||
| hemocytometer | |||
| flow cytometer (3 laser) | |||
| Antibodies used for flow cytometry | |||
| Anti-TNF | eBiosciences | 551487 | FITC (fluorophore) 2 μl |
| Anti-IFNγ | Biolegend | 506507 | PE (fluorophore) 20 μl |
| Anti-CD8 | Biolegend | 300914 | PE-Cy7 (fluorophore) 1 μl |
| Anti-CD14 | Biolegend; BD Biosciences | 325624; 551487 | Biotin (fluorophore) 0.5 μl Streptavin PE-TR (fluorophore) 0.1 μl |
| Anti-CD56 | Biolegend | 318322 | PerCP/Cy5.5 (fluorophore) 5 μl |
| Anti-γδ | Biolegend | 331212 | APC (fluorophore) 5 μl |
| Anti-CD3 | Biolegend | 300426 | APC-Cy7 (fluorophore) 5 μl |
| Anti-CD4 | Biolegend | 317424 | Pacific Blue (fluorophore) 1 μl |
References
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