Introduction
Co-infektion, infektion med flere samtidige infektioner, er normen i naturlige miljøer. Co-infektion kan have en stor indvirkning på sygdommens patologi og på den kliniske behandling af hver infektion. I forbindelse med co-infektion, vaccine og medicin effektivitet, såvel som diagnostisk test, kan blive negativt påvirket (revideret i 1). Trods sin betydning, at størstedelen af patogen forskning mener dog, kun enkelte infektioner.
Malaria og HIV-1 (HIV) er førende årsager til sygelighed og dødelighed globalt. Områder af malaria og HIV endemisk forekomst deler en bred geografisk overlap, at sætte millioner af mennesker i risiko for co-infektion og dermed i risiko for mere alvorlig klinisk sygdom 2-10. De to sygdomme negativt interagere. I HIV-inficerede individer, højere HIV virale belastninger og midlertidige fald i CD4 + T-celletal kan ses i løbet af en malaria infektion, mensmalariaparasitten byrder og risiko for klinisk og svær malaria er højere i co-inficerede individer 2,3,5,7,8,10. De mekanismer, som HIV øger malaria sværhedsgraden ikke fuldt forstået og garanterer yderligere undersøgelser.
Her beskriver vi en metode, som malaria og HIV-infektion, kan studeres in vitro. Konkret denne metode giver mulighed til undersøgelse af malaria-specifikke immunreaktioner i forbindelse med hiv-smitte. Vores protokol beskriver en alsidig co-dyrkningssystem hjælp frisk isolerede perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) isoleret fra kronisk HIV-inficerede donorer og in vitro dyrkede P. falciparum parasitiseret erythrocytter (PfRBC). Virkningen af hiv antiretroviral behandling på disse reaktioner kan også undersøges ved hjælp af prospektivt indsamlede PBMC'er fra HIV (+) donorer før og efter behandling.
Vi har brugt dette system til at undersøge virkningen af HIV-infektionom malaria-specifikke medfødte immunrespons 11,12, og var i stand til at bestemme, at malaria-specifikke IFNy og TNF svar er forringet i NK-celler, NKT celler, γδ T-celler fra HIV (+) donorer før og efter HIV antiretroviral behandling . Derudover var vi i stand til at bruge dette system til at bestemme, at monocytiske funktioner også er svækket i HIV (+) donorer, men genvinde post-HIV antiretroviral behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol kræver rekruttering af donorer for serum og RBC der skal anvendes til parasit kultur, og HIV (+) og ikke-inficerede donorer for PBMC isolation. Institutional Review Boards skal godkende alle undersøgelser og alle donorer skal give informeret samtykke forud for blod uafgjort.
ADVARSEL: Arbejde med blodprøver menneskelige og humane malariaparasitter kræver forebyggende foranstaltninger. Brug altid en kittel, handsker, og arbejde i et niveau 2 biosikkerhed kabinet. I tilfælde af utilsigtet perkutan eksponering for human malaria, rapportere til sundhed og sikkerhed for profylaktisk behandling. Yderligere vederlag sikkerhed bør også være på plads til at arbejde med hiv (+) blod. Bær en back lukker kittel. Dobbelt handske (øverste handske skal latex). Udfør alle håndtering i et niveau 2 biosikkerhed kabinet. Brug ikke glas eller skarpe genstande. Brug ikke emhætte. Læg alle forurenede emner i virox løsning eller blegemiddel i mindst 1 time før genudsætning.Vask alle overflader med virox og UV i 1 time efter brug. Bemærk, at hver institution vil have deres egne specifikke biosikkerhed regler, der skal følges. Rapporter alle utilsigtede eksponeringer til HIV-smittet blod til sundhed og sikkerhed for evaluering og overvejelse af mulige profylakse efter eksponering.
Bemærk: Forskellige stammer af P. findes falciparum malaria parasitter. ITG blev anvendt til disse forsøg, men forskellige stammer kan anvendes. Fremragende instruktioner om nedfrysning og optøning Plasmodium falciparum parasitter er tilgængelige på MR4 hjemmeside 13.
1. Gør RPMI-A for malariaparasitten Kultur
- Gør RPMI-0 ved at blande 950 ml Hedeselskabet 2 O, 1 pakke RPMI-1640 pulver, 6 g HEPES, 2 g natriumbicarbonat, og 1,35 mg af hypoxanthin.
- Thaw varmeinaktiveret humant serum fra to forskellige donorer. AB donorer er bedst, men enhver kan anvendes, hvis parasitter dyrkes i O-typerøde blodlegemer (RBC). Vend rør til at blande. Hvis serum indeholder partikler eller er tyk centrifugering ved 2.000 rpm og derefter filtrere væskedel under anvendelse af en 0,45 um filterenhed.
- Anvendelse af et 0,2 um filterenhed filter 180 ml RPMI-0, 20 ml humant serum (10 ml fra hver donor), og 0,5 ml 10 mg / ml gentamycin.
Bemærk: Humant serum kan tilstoppe filteret kan således kræves mere end én filterenhed. - Mærk medium flaske med RPMI-A, datoen og kilden til serum. Opbevares i køleskab indtil anvendelse. RPMI-A kan blive uklar i køleskab. Dette er normalt, men stigende uklarhed er et tegn på forurening.
Bemærk: Parasit vækst kan variere i forskellige donor serum. Det er en god ide at teste alle menneskelige serum partier for god parasit vækst inden brug.
2. Forberedelse humane røde blodlegemer til Parasite Kultur
Bemærk: Blood donorer skal være typen O.
- Saml 7-10 ml blod i syre-CITrate-dextrose (ACD) rør. Skriv donorens id og dato for opsamling på etiketten.
- Store blodet ved 4 ° C indtil brug. Brug blod for parasit kulturer inden for 1 måned.
- Tør toppen af røret med 70% ethanol. Fjern forsigtigt proppen og kassér. Overfør blod i et 15 ml rør. Spin i 3 min ved 1000 x g. Fjern plasma ved aspiration.
- Suspendere RBC med lige så stort volumen RPMI varme-0. Spin i 5 minutter ved 1.000 x g. Fjern buffy coat ved aspiration, resuspender i 5 ml RPMI-0 og gentage vasken 2 gange mere.
- Fjern supernatanten og tilsæt tilstrækkeligt RPMI-A til frembringelse af en blanding, som er 50% RBC vol.
- Opbevar ved 4 ° C indtil brug.
3. Fastholdelse af Parasite kulturer
- Pre-varme RPMI-A til 37 ° C.
- Placer optøede parasitter (se MR4 protokol for optøning procedure) i en T25 kolbe med 5 ml RPMI-A og 75 pi vaskede human RBC til en hæmatokrit på ~ 3%.Bemærk: Hæmatokrit måler mængden af RBC forhold til den samlede mængde. At beregne hæmatokrit måle mængden af emballeret RBC til den samlede mængde af medium plus RBC. Antag, at de optøede parasitter vil bidrage 75 pi RBC. Ved tilsætning af 150 pi RBC lager (hvilket svarer til tilsætning af 75 pi pakkede RBC) til kolben er i alt 150 pi RBC i 5 ml medium, hvilket svarer til en hæmatokrit på 3% (150 pl / 5000 pi x 100% = 3%).
- Gas kolben i 30 sekunder med parasitten gasblanding (1% O 2, 3% CO2, balance N2). Seal og anbringes kolben brede nedad i en 37 ° C inkubator for at muliggøre den største overfladeareal til gasudveksling.
- For at ændre mediet og kontrollere for parasitæmi (skal gøres dagligt), kolben forsigtigt flytte for ikke at forstyrre RBC lag. Anvendelse af en steril Pasteur-pipette unplugged trække off dyrkningsmediet uden at forstyrre blodet lag.
- For at kontrollere parasitemia, fjerne en 10 pi prøve fra blodet lag, placere den på et objektglas og bruge en anden glasplade Opret en tynd blod film. Lad dias tørre.
- Placer 4 ml frisk RPMI-A i kolben, forsigtigt blandes, gas i 30 sek, og plads i inkubator ved 37 ° C.
- Farv objektglasset ved hjælp af Hema3 farvning kit ifølge producentens protokol.
- For optimal farvning, dip glider i fastsættelsen løsning til 10 sek, løsning, jeg i 10 sek, og opløsning II i 30 sek. Skyl i vand og lad dias til tørre.
- Beregn parasitæmi ved at tælle antallet af PfRBC (farves mørklilla) versus det samlede antal RBC (farvet lyserød). Tæl i alt 300 celler for at sikre nøjagtighed.
- Når parasitter har nået en parasitæmi på 5%, udvide kulturen i en T75 kolbe, under anvendelse af 40 ml RPMI-A, og 500 pi RBC.
4. Parasite Synkronisering
Bemærk: Dagen før tHan eksperimenterer, synkronisere parasitten kultur ved behandling med alanin. Kun ring stadie parasitter og ikke-inficerede RBC vil overleve denne behandling. Alanin synkronisering vil give dig en ren trofozoit kultur den næste dag, der kan anvendes i co-kultur eksperimenter. Sørg for at starte med en parasit kultur, der indeholder et flertal af ring stadie parasitter.
- Forbered alanin opløsning ved at blande 8,01 g af alanin (300 mM) og 0,365 g Tris (10 mM) i 300 ml dobbeltdestilleret 2 O. Bring pH til 7,4. Filtersteriliser ved anvendelse af et 0,2 um filterenhed.
- Pre-varme alanin løsning til 37 ° C.
- Spin ned parasitten kultur (5 min x 1.000 xg), og fjern mediet.
- Resuspender pellet i 19 rumfang af alanin-opløsning (1 ml pakket RBC til 19 ml alanin opløsning). Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Spin 5 min x 1.000 x g. Aspirer supernatanten. Vask i RPMI-0 gang. Aspirer supernatanten og resuspender i RPMI-A og justere hæmatokrit til ~ 3%. Gsom kolben og vende tilbage til 37 ° C.
Bemærk: co-kultur eksperimenter er behov for en minimal parasitæmi af 5% trophozoitter, med 10% parasitæmi betragtes optimal.
5. Parasite og RBC Forberedelse til co-kultur Eksperimenter
- Brug et forhold på 3 PfRBC pr PBMC i co-kultur eksperimenter for at inducere et inflammatorisk respons. For at beregne det samlede PfRBC, kvantificere parasitæmi ved at lave en tynd blodudstrygning som beskrevet i 3.5, og hæmatokrit ved at tælle antallet af RBC pr ml parasit kultur anvendelse af et hæmocytometer.
Antal PfRBC =% parasitæmi x samlede RBC / ml x ml kultur. For eksempel: 10 ml kultur ved 10 x 10 6 RBC / ml og 10% parasitæmi er lig med 0,1 x 10 6 / ml x 10 ml = 10 x 10 6 PfRBC. - Spin parasitten kultur i 5 minutter ved 1000 xg (RT). Aspirer medium og resuspender på 6 x 10 6 PfRBC per ml i RPMI-S + (500 ml RPMI-1640 suppleret med L-glutamin og HEPES, 10% varmeinaktiveret FBS, 1,5 ml gentamicin, 5 ml 100 mM natriumpyruvat, 5 ml 10 mM MEM ikke-essentielle aminosyrer, 5 ml 5 mM β-mercaptoethanol).
- Tage kontrol blod (uinficeret RBC fra den samme donor benyttes til opretholdelse parasitten kultur), beregner hæmatokrit og resuspender i RPMI-S + ved det samme antal RBC per ml som parasitten kultur.
6. Isolering af humane perifere mononucleære blodceller (PBMC)
- Saml veneblod i natriumheparin rør (grøn top) fra både en kronisk HIV (+) en donor og HIV (-) kontrol. Brug ikke EDTA som en anti-koagulerende som EDTA calcium chelaterende handling påvirker celle funktion. I gennemsnit forventer 5-10 x 10 6 PBMC pr 10 ml blod. For en typisk eksperiment indsamle 30 ml blod fra hver donor. Blodvolumen skal justeres i henhold til de eksperimentelle betingelser.
- Så hurtigt som muligt og absolut inden for en time af blod, der indsamles,fjerne blod fra rørene og anbringes i en plastik 50 ml rør. Monocytter især vil blive aktiveret og holde sig til glas, så det er vigtigt, at hvis der bruges til indsamling af glas blod rør celler fjernes så hurtigt som muligt.
- Spin blodet ved 1.000 xg i 15 minutter og indsamle Plasma (dette kan anvendes til andre undersøgelser, hvis det kræves - om ikke dette trin kan springes over). Fortynd blodet tilsvarende volumen af kold DPBS.
- 15 ml RT Ficoll i et 50 ml rør. Langsomt anvendelse af en steril plastik transfer pipette lag blod / DPBS opløsningen over Ficoll uden blanding. Højst 25 ml blod / DPBS løsning kan være lagdelt over hver 15 ml Ficoll.
- Spin gradienterne i 30 minutter ved stuetemperatur ved 600 x g. Sørg for, at indstillingen "ingen bremse 'er på.
- Når cellerne er spundet, kigge efter grænsefladen mellem de to faser. Det er her PBMC er. Anvendelse af en steril plastik overførselspipetten indsamle PBMC fra grænsefladen (seFigur 1). Minimer forurening med RBC.
- Placer opsamlede celler i 50 ml rør, med ikke mere end 20 ml pr rør. Overrøret op til 50 ml med sterile kolde DPBS.
- Spin cellerne i 10 minutter ved 4 ° C ved 300 x g.
- Supernatanten kasseres, resuspender pellet i 5 ml sterilt kolde DPBS og samle alle celler fra den samme donor i et rør. Top op til 50 ml med sterile DPBS, og gentag vasken trin 2 flere gange.
- Resuspender celler i 10 ml RPMI-S + medium.
- Fjern en 20 pi alikvot og blandes med 20 pi trypanblåt. Afpipetteres 10 ul i et hæmocytometer og tælle de levende celler (celler, der ikke har taget op blå farvestof - alle blå celler er døde). Brug et hæmocytometer at beregne celleantal i en opløsning på følgende måde.
Bemærk: En hæmocytometer har et gitter af angivne dimensioner, således at det område, som linjerne er kendt.- Sørg for, at hæmocytometer er ren. Placer dækglasset over counting område. Load 10 pi celleopløsning ved at placere pipettespidsen i en af de V-formede brønde. Arealet under dækglasset vil fylde ved kapillarvirkning.
- Placer læsset hæmocytometer under et mikroskop. Den fulde gitter af hæmocytometeret indeholder 9 kvadrater på 1 mm 2 hver. Tæl alle celler inden for hver stor firkant. Såfremt for mange celler er til stede, fortyndes yderligere opløsning og optælling.
- Beregn cellekoncentration som følger: Total celler / ml = (totale celler tælles / # af kvadrater) x fortyndingsfaktor x 10.000 celler / ml, fx (500 celler / 5 firkanter) x fortyndingsfaktor på 20 x 10.000 celler / ml = 20 x 10 6 celler i alt.
- Juster medium til en slutkoncentration på 10 x 10 6 pr ml (RPMI-S + medium).
7. Malaria / HIV co-infektion Kultur
- Plade 100 pi isolerede PBMC'er og 400 ul RPMI-S til + medium en plade med 24 brønde (1 x 10 6 PBMC per brønd). Sikreat brønde er sat op i tre eksemplarer: 3 brønde til ikke-inficerede RBC, 3 brønde med PfRBC, 3 brønde med medium, og 3 brønde med PMA / Ionomycin. Dette er både for HIV (+) og HIV (-) prøve.
- For PfRBC brønde, placere 3 x 10 6 PfRBC i hver af brøndene (500 pi parasit kultur udarbejdet i 5.2).
- For inficerede RBC brønde, placere 500 pi af inficerede RBC kultur fremstillet i 5,3 i hver af brøndene.
- For mellemstore brønde, placere 500 pi RPMI-S + mediet i hver af brøndene.
- For PMA / ionomycin brønde, forberede PMA / ionomycin-opløsning (2,5 pg / ml, 250 pg / ml). Placer 500 pi af denne opløsning i hver brønd.
Bemærk: som potente stimulatorer af T-celle cytokinsekretion er PMA og ionomycin anvendt som en positiv kontrol for at sikre celler er funktionelle. - Anbringes ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator.
- Valgfrit: Brug overskydende celler til fænotypisk analyse ved anvendelse af flowcytometri eller butik i en RNEn stabilisering løsning for fremtiden mRNA-ekspression analyse.
8. Påvisning af malaria Immune Responses
Bemærk: Udfør co-kultur eksperimenter så længe som 4 dage. Nr medieændring kræves i dette tidsrum. Det optimale tidspunkt vil afhænge af celletypen af interesse og stillet spørgsmålet. En inkubation af 12-48 timer er optimal for monocytiske reaktioner på PfRBCs, mens lymfocytresponser blev bedst observeret ved 72-96 timer. De tidspunkter skal optimeres baseret på den eksperimentelle spørgsmål. Kortere perioder (2-4 HR) kan anvendes, hvis samspil mellem intakt PfRBC og PBMC'er er af interesse.
- Spin plade ved 300 xg i 3 minutter for at pelletere cellerne. Indsamle 700 pi kultursupernatant fra hver brønd.
- Spin supernatanten ved 1.000 xg i 5 min til fri for skidt.
- Portion klarede supernatant efter behov, mærke og fryse ved under -20 ° C indtil analyse af udskilte faktorer er at være PerfoRMED.
- Analyser cytokin / kemokin reaktioner ved ELISA eller perle array (følge producentens foreslåede protokoller).
- Indsamle celler forbliver i pladen i et RNA stabiliserende opløsning og udnytte for mRNA-ekspression analyse ved kvantitativ realtids-PCR 14-16.
9. Intracellulær flowcytometri for celle-specifikke Ccytokine Responses Brug PBMC Co-dyrkes med P. falciparum inficerede RBC
Bemærk: Som nævnt ovenfor længden af co-kultur vil afhænge af den celletype interesse. Hvis interesseret i monocytiske svar på PfRBC en kortere inkubationstid er nødvendig. Tider vil være længere for medfødte lymfocytresponser γδ T-celler, NK-celler, NKT-celler), og endnu længere for CD4 og CD8 T-celler. Optimering vil være påkrævet.
- 6-8 timer før analyse tilsættes 1 pi 1.000 x Brefeldin A til alle brønde. Returnere pladen til 37 ° C inkubator. Efter 6-8 timers incubationer den anbringes på is i 15 minutter.
- Fjern celler fra brøndene ved hjælp af kraftig pipettering og placere dem i mærkede microcentifuge rør. Skrabning kan være nødvendigt at fjerne monocytter.
- Spin celler i 5 minutter ved 1.000 x g. Fjern supernatanter. Resuspender celler i 500 pi flowcytometri puffer (1x DPBS, 2% varmeinaktiveret FBS, 0,02% natriumazid).
- Divide celler op, så at hver prøve har: et rør for fuld antistoffarvning (240 pi) og et rør til fluorescerende minus én (FMO) kontrol antistof farvning (240 pi). Pool en lille mængde af hver prøve (20 ul) for ufarvede flowcytometri kontrol (dette vil blive anvendt ved opsætning flowcytometeret).
- Spin celler i 5 minutter ved 500 x g. Fjern supernatanter.
- Cellerne inkuberes med ukonjugeret anti-humant CD16 / CD32 (5 pg / ml) i 50 pi flowcytometri buffer i 15 minutter ved 4 ° C til at blokere Fc-receptorer.
- Der tilsættes 1 ml flowcytometri buffer til hvert rør. Spin ceLLS i 5 minutter ved 500 x g. Fjern supernatanter.
- Resuspender celler i 50 pi flowcytometri buffer med en praetitreret koncentration af fluoroforen-konjugerede antistoffer til ønskede celleoverflademarkører. Pre-mix nok antistof løsning for alle prøver, der skal farves. Cellerne inkuberes ved 4 ° C i 20 min. Beskytte mod light.Note: Mængden af hvert antistof skal optimeres. Vi rutinemæssigt farvning for CD56, CD3, γδ, CD4, CD8, CD14. Titrerede mængder for disse antistoffer er vist i tabel 1.
- Der tilsættes 1 ml flowcytometri buffer til hvert rør. Spin celler i 5 minutter ved 500 x g. Fjern supernatanter.
- Tilsæt 100 pi Cytofix / cytoperm opløsning til hvert rør. Cellerne inkuberes i 20 minutter ved 4 ° C. Beskyt mod lys.
- Tilsæt 1 ml perm / vaskebuffer (leveres som 10x koncentrat - fortyndes til 1x bruge Hedeselskabet 2 O) til hvert rør. Spin celler i 5 minutter ved 500 x g. Fjern supernatanter.
- Tilføj 100 μl perm / vaskebuffer til FMO kontrol antistoffarvning rør og bland til at opblande cellerne.
- Tilsæt 100 pi perm / vaskebuffer med en praetitreret koncentration af fluoroforen-konjugerede antistoffer til ønskede intracellulære markører (dvs. cytokiner / kemokiner) til fuld antistoffarvning rør.
Bemærk: Mængden af hvert antistof skal optimeres. Vi rutinemæssigt pletten med anti-TNF og anti-IFNy-antistoffer. Titrerede mængder for disse antistoffer er vist i tabel 1. - Inkuber alle rør i 30 minutter ved 4 ° C. Beskyt mod lys.
- Tilsæt 1 ml Perm / Wash buffer til hvert rør. Spin celler i 5 minutter ved 500 x g. Fjern supernatanter.
- Resuspender celler i 300 pi flowcytometri buffer med 1% paraformaldehyd. Lad det sidde i mindst 15 minutter for at neutralisere HIV.
- Forbered enkelt antistof farvede prøver ved hjælp af kompensation perler, der skal bruges til kompensation oprettet på flowcytometeret. Den form for kompensationperler vil afhænge af de anvendte antistoffer (dvs.., anti-muse-Ig, anti-rotte / hamster-Ig). Vortex perler. Tilsæt en dråbe perler pr antistof. Tilføj lige store mængder af antistof som anvendes til farvning. Tilsæt 200 pi flowcytometri buffer. Disse er nu klar til brug. Der er ingen grund til at vaske perlerne.
- Anskaf prøver på et flowcytometer så hurtigt som muligt og inden 24 timer for de bedste resultater. Tandem-farvestoffer er modtagelige for dissociation med opbevaring om muligt så vi anbefaler øjeblikkelig overtagelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Graferne viser de niveauer af IFNy produktion fra NKT-celler (figur 2), under anvendelse af CD56 + CD3 + γδ- porte til opnåelse af NKT-celler populationen (data ikke vist). Cellerne blev dyrket i 72 timer før farvning. Når farves, 100.000 CD3 + celler blev erhvervet på flowcytometeret at opnå store nok populationer af NK, NKT og γδ celler (celler af interesse). Et minimum af 5.600 NKT-celler er vist på hver graf. TNF-produktion opnås på samme måde (data ikke vist). Graferne viser klart, at IFNy produktion er lavere i celler fra HIV (+) personer sammenlignet med hiv (-) personer udsat for PfRBC.
Flowcytometrianalyse er meget subjektive. Det er derfor vigtigt at have alle de nødvendige kontroller for hvert forsøg (se figur 2). Baggrundsniveauer beregnes ved hjælp af FMO prøver, hvilket giver mulighed for en korrekt gengivelse af cytokin-farvning.Celler stimuleret med PMA / ionomycin blev anvendt som en positiv kontrol (data ikke vist). PMA og ionomycin er stærke stimulatorer af T-celle cytokinproduktion. En mangel på IFNy produktion i disse prøver vil sandsynligvis indikere et problem med farvningen protokollen. Imidlertid kan andre variabler såsom cellernes levedygtighed eller inaktive reagenser også være skyld i ulykken.
Figur 1. Afbildning af Ficoll gradient efter centrifugering demonstrerer position PBMC'er.
Figur 2. IFN γ produktion af Natural Killer T-celler. De rutediagrammer blev opnået ved gating på CD56 + CD3 + γδ- celler (minimum af 5.600 hændelser). IFNy produktion kan påvises i HIV (-) prøve stimuleret medP. falciparum inficerede røde blodlegemer. Denne cytokin respons er ikke længere synlig i forbindelse med en kronisk HIV-infektion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vores protokol er blevet optimeret med henblik på at de fleste realistisk studere HIV-malaria-co-infektion in vitro. Først friske humane røde blodlegemer og serum nødvendig for malariaparasitten kultur. Dette er afgørende for at opnå en sund bestand af malaria parasitter. Parasit lysater kan ikke erstatte levende parasitter som cytokinproduktion er langt hurtigere og mere intens, når du bruger levende P. falciparum inficerede RBC (PfRBC) 17,18. Desuden aktivering af celletyper som NK-celler, kræver hele PfRBCs, og ikke virker effektivt med parasit lysater. Dette kan skyldes behovet for direkte kontakt mellem PfRBC og leukocyt eller kan skyldes den ustabile karakter af parasit-afledte ligander, der interagerer med celleoverfladereceptorer 18. Malaria PfRBC kulturer skal også være godt synkroniseret (protokol 4) forud for forsøget. Synkroniserede PfRBCs forbedre reproducerbarheden af de eksperimentelle data. Selv om denne protokol deskriftkloge brugen af trofozoit fase PfRBC til co-kultur, kan den let modificeret til studiet af ringen etape PfRBC.
Humane leukocytter kan kunstigt smittet med hiv, og denne metode er blevet anvendt i studier af malaria-HIV co-infektion forskning 20. Det betyder dog ikke modellere immundysreguleringssygdom, der resulterer af kronisk HIV-infektion. I denne co-kultursystem anvender vi PBMC'er isoleret fra humane deltagere, som kronisk inficeret med HIV-1. Når der kræves deltagere for en undersøgelse, er det vigtigt at vælge omhyggeligt denne population. Inklusionskriterier og eksklusionskriterier er afgørende for at sikre minimal variabilitet og maksimal reproducerbarhed. Vores kriterier indeholdt en klar definition af kronisk HIV-infektion (HIV-smittede i> 1 år, med CD4 + T-celletal fald på> 50 celler / mm 3 / år) og udelukkelse af alle med en samtidig infektion. Dette sikrede, at de opnåede resultater kunne tilskrives såLely til virkningen af kronisk HIV-infektionen, og ikke en anden infektion. Derudover, da vi var interesserede i medfødte immunrespons til malaria vi udelukkede donorer, der havde tidligere malaria infektion.
HIV-inficerede kontroller anvendes også for hver HIV (+) donor ved hvert tidspunkt for prøvetagning for at tillade data normalisering. Bør gøres et forsøg på at matche kontroller til de respektive HIV (+) donor i mindst alder men helst også køn (selv i vores tidligere undersøgelse 12 vi ikke oplever en betydelig forskel i celleundergrupper eller cytokin respons mellem kvindelige og mandlige HIV- inficerede deltagere). Hvis potentielle prøveudtagning er planlagt at opretholde den samme HIV-inficeret kontrol for hvert tidspunkt for prøvetagning er gavnligt. Reaktionerne kan variere fra eksperiment til eksperiment på grund af flere faktorer, herunder sundhed PfRBCs, deres grad af synkronisering, parasitæmi-niveau og fase af modenhed PfRBCs, og hæmatokrit-niveau. Plejeskal tages for at holde så mange af disse konsistent mellem forsøg. Normalisering til en HIV-inficeret kontrol giver mulighed for nogle regnskabsmæssige for disse variabler.
Ved hjælp af friske celler er altafgørende for at undgå kunstige resultater. Nedfrysning og optøning prøver kan have en betydelig indvirkning på cellernes levedygtighed 21,22, cytokinproduktion 23-26 og celleoverfladen fænotypiske markører 27.
Hvis monocytter er af særlig interesse, er det vigtigt, at glas ikke anvendes under protokollen. Monocytter overholde glas og mange andre plast 28. Vi bruger Propenplast pipetter, overførselspipetter, og rør hele til at minimere monocytadhærens og ultimativ fjernelse fra vores studie cellepopulationer.
Ved opsætning af flowcytometri assay, kan enhver kombination af antistoffer anvendes afhængigt af cellerne af interesse. Vi var især interesseret i IFNy og TNF produktionfra NK-celler, NKT-celler og T-celler γδ. Denne definerede vores antistofpanel. Men hvis der anvendes en anden kombination, er det vigtigt at optimere mængden af antistof for hvert panel. Dette er afgørende for at undgå fejlagtige data. Også, for at undgå variation og sikre validitet, er rammerne for gensidige forpligtelser forpligtet til at vurdere baggrunden cytokinniveauer for hver betingelse (RBC, PfRBC, medium og PMA / lonomycin) og deltager befolkningen (HIV (-) og HIV (+), figur 2). Måling in vitro intracellulær cytokinproduktion normalt resulterer i høje baggrundsniveauer, især når celler er blevet dyrket før farvning. Siden dyrkningsbetingelser påvirker baggrundsniveauer, passende rammer for gensidige forpligtelser sikre viden om baggrunden for hver prøve. Vores levering af celler var begrænset, derfor har vi designet vores rammer for gensidige forpligtelser til at indeholde alle overflade pletter men ingen intracellulære pletter. Dette gør det muligt for den specifikke sammenligning af cytokin baggrundsniveauer alle de forskellige celletyper undersøgt.Vi løb også en enkelt plet for hvert forsøg for hver af de overflademarkører at bekræfte deres baggrundsniveauer.
Den beskrevne protokol er en alsidig én, som kan anvendes til at undersøge responser inden for få timer eller dage afhængigt af cellerne af interesse. For optimal PfRBC-induceret cytokinproduktion fra medfødte lymfocytter, målte vi flowcytometri output efter 2 eller 3 dage. Når man ser på monocytter, der tidligere tidspunkter (1 eller 2 dage) anbefales. Dette system giver mulighed for flere celletyper og celle responser skal skelnes ved flowcytometri sekretoriske respons der skal måles, i cellesupernatanter og ekspressionsprofiler skal vurderes i udvundet RNA. Endvidere kan anvendelse af antistoffer blokerer specifikke receptorer eller neutralisere cytokiner kan anvendes i dette system for yderligere at dissekere mekanismer. Vi har med succes brugt IL-18-receptor blokade at indblande IL-18 receptor i PfRBC-induceret IFNy reaktioner 12. Dette system er en realistic metode til at vurdere en række medfødte immunrespons til malaria i forbindelse med HIV-infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alanine | Sigma | A7377 | |
| antibodies (see other table) | |||
| BD Cytofix/Cytoperm with BD GolgiPlug | BD | 555028 | includes brefeldin A, cytofix/cytoperm buffer and perm/wash buffer |
| BD Vacutainer ACD Solution A | BD | 364506 | |
| BD Vacutainer Sodium Heparin | BD | 17-1440-02 | |
| DPBS (no calcium, no magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F1051 | heat inactivate before use |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| gentamycin (10 mg/ml) | Gibco | 15710-064 | |
| Hema3 Staining Set | Fisher | 122-911 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| Ionomycin | Sigma | I3909 | |
| MEM non-essential amino acids (10 mM) | Gibco | 11140 | |
| PMA | Sigma | P8139 | |
| RPMI-1640 powder | Life-Technologies | 31800-022 | |
| RPMI-1640 with L-glutamine and HEPES | Thermo Scientific | SH30255.01 | |
| sodium bicarbonate (powder, cell culture) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360 | |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T6066 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| Trypan Blue (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| BD CompBead | BD | 552843, 552845 | depends on antibodies used |
| Parasite Gas Mixture | By special order | 3% CO2, 1% O2, balance N2 | |
| Equipment | |||
| 0.2 μm filter unit | |||
| Glass slides | |||
| T25 flasks | |||
| T75 flasks | |||
| 50 ml tubes | |||
| 24 well culture plates | |||
| unplugged Pasteur pipettes | |||
| plugged Pasteur pipettes | |||
| sterile transfer pipettes | |||
| hemocytometer | |||
| flow cytometer (3 laser) | |||
| Antibodies used for flow cytometry | |||
| Anti-TNF | eBiosciences | 551487 | FITC (fluorophore) 2 μl |
| Anti-IFNγ | Biolegend | 506507 | PE (fluorophore) 20 μl |
| Anti-CD8 | Biolegend | 300914 | PE-Cy7 (fluorophore) 1 μl |
| Anti-CD14 | Biolegend; BD Biosciences | 325624; 551487 | Biotin (fluorophore) 0.5 μl Streptavin PE-TR (fluorophore) 0.1 μl |
| Anti-CD56 | Biolegend | 318322 | PerCP/Cy5.5 (fluorophore) 5 μl |
| Anti-γδ | Biolegend | 331212 | APC (fluorophore) 5 μl |
| Anti-CD3 | Biolegend | 300426 | APC-Cy7 (fluorophore) 5 μl |
| Anti-CD4 | Biolegend | 317424 | Pacific Blue (fluorophore) 1 μl |
References
- Graham, A. L., Cattadori, I. M., Lloyd-Smith, J. O., Ferrari, M. J., Bjørnstad, O. N. Transmission consequences of coinfection: cytokines writ large. Trends in parasitology. 23 (6), 284-291 (2007).
- French, N., et al. Increasing rates of malarial fever with deteriorating immune status in HIV-1-infected Ugandan adults. AIDS (London, England). 15 (7), 899-906 (2001).
- Hoffman, I. F., et al. The effect of Plasmodium falciparum malaria on HIV-1 RNA blood plasma concentration. AIDS (London, England). 13 (4), 487-494 (1999).
- Kamya, M. R., et al. Effect of HIV-1 infection on antimalarial treatment outcomes in Uganda: a population-based study. The Journal of infectious diseases. 193 (1), 9-15 (2006).
- Kublin, J. G., et al. Effect of Plasmodium falciparum malaria on concentration of HIV-1-RNA in the blood of adults in rural Malawi: a prospective cohort study. Lancet. 365 (9455), 233-240 (2005).
- Mermin, J., et al. Effect of co-trimoxazole prophylaxis, antiretroviral therapy, and insecticide-treated bednets on the frequency of malaria in HIV-1-infected adults in Uganda: a prospective cohort study. Lancet. 367 (9518), 1256-1261 (2006).
- Patnaik, P., et al. Effects of HIV-1 serostatus, HIV-1 RNA concentration, and CD4 cell count on the incidence of malaria infection in a cohort of adults in rural Malawi. The Journal of infectious diseases. 192 (6), 984-991 (2005).
- Whitworth, J., et al. Effect of HIV-1 and increasing immunosuppression on malaria parasitaemia and clinical episodes in adults in rural Uganda: a cohort study. Lancet. 356 (9235), 1051-1056 (2000).
- Xiao, L., Owen, S. M., Rudolph, D. L., Lal, R. B., Lal, A. A. Plasmodium falciparum antigen-induced human immunodeficiency virus type 1 replication is mediated through induction of tumor necrosis factor-alpha. The Journal of infectious diseases. 177 (2), 437-445 (1998).
- Francesconi, P., et al. HIV, malaria parasites, and acute febrile episodes in Ugandan adults: a case-control study. AIDS (London, England). 15 (18), 2445-2450 (2001).
- Finney, C. A. M., et al. HIV infection deregulates Tim-3 expression on innate cells: combination antiretroviral therapy results in partial restoration. Journal of acquired immune deficiency syndromes. 63 (2), 161-167 (2013).
- Finney, C. A. M., et al. HIV infection deregulates innate immunity to malaria despite combination antiretroviral therapy. AIDS (London, England). 27 (3), 325-335 (2013).
- Ljungstrom, I., et al. Methods in Malaria Research. , 4th edition, MR4/ATCC. Available from: http://www.mr4.org/Publications/MethodsinMalariaResearch.aspx (2013).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
- Universal SYBR green quantitative PCR protocol [Internet]. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.html (2014).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-DDCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Hensmann, M., Kwiatkowski, D. Cellular basis of early cytokine response to Plasmodium falciparum. Infection and immunity. 69 (4), 2364-2371 (2001).
- Artavanis-Tsakonas, K., Riley, E. M. Innate immune response to malaria: rapid induction of IFN-gamma from human NK cells by live Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. J Immunol. 169 (6), 2956-2963 (2002).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. The Journal of parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
- Ludlow, L. E., et al. HIV-1 inhibits phagocytosis and inflammatory cytokine responses of human monocyte-derived macrophages to P. falciparum infected erythrocytes. PloS one. 7 (2), e32102 (2012).
- Weinberg, A., et al. Viability and functional activity of cryopreserved mononuclear cells. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (4), 714-716 (2000).
- Fowke, K. R., Behnke, J., Hanson, C., Shea, K., Cosentino, L. M. Apoptosis: a method for evaluating the cryopreservation of whole blood and peripheral blood mononuclear cells. Journal of immunological. 244 (1-2), 139-144 (2000).
- Jeurink, P. V., Vissers, Y. M., Rappard, B., Savelkoul, H. F. J. T cell responses in fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells: kinetics of cell viability, cellular subsets, proliferation, and cytokine production. Cryobiology. 57 (2), 91-103 (2008).
- Kvarnström, M., Jenmalm, M. C., Ekerfelt, C. Effect of cryopreservation on expression of Th1 and Th2 cytokines in blood mononuclear cells from patients with different cytokine profiles, analysed with three common assays: an overall decrease of interleukin-4. Cryobiology. 49 (2), 157-168 (2004).
- Venkataraman, M. Effects of cryopreservation of immune responses. XI. Heightened secretion of tumor necrosis factor-alpha by frozen human peripheral blood mononuclear cells. Cryobiology. 34 (3), 276-283 (1997).
- Venkataraman, M. Effects of cryopreservation on immune responses. X. Decrease in interleukin-12 production by frozen human peripheral blood mononuclear cells is mediated by the endogenously hypersecreted interleukin-10. Cryobiology. 33 (5), 581-588 (1996).
- Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (3), 352-359 (2000).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. Journal of leukocyte biology. 56 (3), 236-240 (1994).
