Introduction
Со-инфекция, заражение нескольких одновременных инфекций, является нормой в естественных условиях. Со-инфекция может иметь большое влияние на патологию заболевания и клиническому ведению каждой инфекции. В контексте ко-инфекцией, вакцины и эффективности препарата, а также диагностического тестирования, может быть негативное влияние (обзор в 1). Тем не менее, несмотря на его важность, большинство патогенных микроорганизмов исследований рассматривает только отдельные инфекции.
Малярией и ВИЧ-1 (ВИЧ), являются основными причинами заболеваемости и смертности во всем мире. Области малярии и распространенностью ВИЧ поделиться широкий географический перекрытие, положив миллионы людей, подверженных риску сочетанной инфекции и, следовательно, на риск более тяжелой клинической картиной заболевания 2 - 10. Эти две болезни негативно взаимодействовать. У ВИЧ-инфицированных лиц, высших ВИЧ вирусной нагрузки и временных уменьшается в уровень CD4 Т-клеток + можно увидеть во время заражения малярией, в то время какмалярийного паразита тяготы и риск клинического и тяжелой малярии выше в сочетанной инфекцией лиц 2,3,5,7,8,10. Механизмы, с помощью которых ВИЧ увеличивает тяжесть малярии полностью не поняты и требуют дальнейшего расследования.
Здесь мы опишем метод, с помощью которого малярией и ВИЧ ко-инфекции можно изучать в лабораторных условиях. В частности, этот метод позволяет для рассмотрения малярии конкретных иммунных реакций в контексте ВИЧ-инфекции. Наш протокол описывает универсальную систему совместного культивирования с использованием свежевыделенных мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), выделенных из хронически инфицированных ВИЧ доноров и культивированных в лабораторных P. тропической зараженных эритроцитов (PfRBC). Воздействие ВИЧ антиретровирусной терапии этих ответов может быть обследованы с помощью перспективно собранные МНПК от ВИЧ (+) доноры до и после терапии.
Мы использовали эту систему, чтобы исследовать воздействие ВИЧ-инфекциина малярией конкретных врожденных иммунных реакций 11,12, и были в состоянии определить, что малярия конкретных IFN, TNF и ответов обесценились в НК-клеток, клетки, NKT γδ Т-клетки ВИЧ (+) доноры пред- и пост-ВИЧ антиретровирусной терапии , Кроме того, мы смогли использовать эту систему, чтобы определить, что моноцитарные функции также нарушена в ВИЧ (+) доноров, но восстановить сообщению ВИЧ антиретровирусной терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол требует набор доноров для сыворотки и РБК быть использованы для паразита культуры, и ВИЧ (+) и неинфицированных доноров для выделения РВМС. Институциональные Обзор платы должен одобрить все исследования и все доноры должны предоставить информированное согласие до ничьей крови.
ВНИМАНИЕ: Работа с образцами крови человека и паразитов малярии человека требует мер предосторожности. Всегда носите пальто лаборатории, перчатки и работу в шкафу биобезопасности уровня 2. В случае случайного чрескожного контакта с человеческой малярии, сообщают здоровью и безопасности для профилактического лечения. Дополнительное рассмотрение безопасности также должны быть введены в действие для работы с ВИЧ (+) крови. Носите назад закрытия халат. Двухместный перчатки (верхняя перчатки должны быть латекс). Выполните все обращения в шкафу биобезопасности уровня 2. Не используйте стакан или острые предметы. Не используйте аспиратор. Поместите все загрязненные предметы в растворе хлорной извести или virox в течение как минимум 1 часа перед утилизацией.Вымойте все поверхности с virox и УФ в течение 1 часа следующего использования. Обратите внимание, что каждое учреждение будет иметь свои специфические правила биобезопасности, которые должны быть соблюдены. Обо всех аварийных воздействий на ВИЧ-инфицированной крови для здоровья и безопасности для оценки и рассмотрения возможных профилактики после контакта.
Примечание: Различные штаммы P. существуют паразиты малярии тропической. ITG был использован для этих экспериментов, но различные штаммы могут быть использованы. Отличные инструкции по замораживания и оттаивания малярийного плазмодия паразитов доступны на веб-сайте MR4 13.
1. Создание RPMI-A для малярийного паразита культуры
- Сделать RPMI-0 путем смешивания 950 мл DDH 2 O, 1 пакет RPMI-1640 порошка, 6 г HEPES, 2 г бикарбоната натрия и 1,35 мг гипоксантина.
- Оттепель инактивированной нагреванием человеческую сыворотку из двух разных доноров. AB доноры лучше, но любой может быть использован, если паразиты выращивают в типа Oкрасные кровяные клетки (РБК). Обратить трубки перемешать. Если сыворотка содержит твердых частиц или толстый спин на 2000 оборотов в минуту, а затем отфильтровать жидкую часть с помощью блока 0,45 мкм фильтра.
- Использование блок фильтров фильтр 0,2 мкм 180 мл RPMI-0, 20 мл сыворотки крови человека (10 мл из каждого донора) и 0,5 мл 10 мг / мл гентамицина.
Примечание: Человеческая сыворотка может засорить фильтр так, может потребоваться более чем один блок фильтра. - Этикетка среды RPMI бутылку с-А, дату и источник сыворотке. Охладите до необходимости. RPMI-А может превратить облачно, когда в холодильнике. Это нормально, но увеличение облачность знак загрязнения.
Примечание: Паразит рост может варьироваться в разных доноров сыворотки. Это хорошая идея, чтобы проверить все человеческие сыворотки партий для хорошего роста паразита перед использованием.
2. Подготовка человека эритроциты Parasite культуры
Примечание: Доноры должны быть типа О.
- Соберите 7-10 мл крови в кислотно-читскорость-декстрозы (ACD) трубы. Написать идентификатор и дату сбора на этикетке донора.
- Магазин крови на 4 о С до тех пор, пока это необходимо. Используйте кровь для паразитов культур в течение 1 месяца.
- Протрите верхнюю часть трубы с 70% этанола. Осторожно снимите пробку и выбросить. Передача кровь в 15 мл пробирку. Спин в течение 3 мин при 1000 х г. Удалить плазму аспирации.
- Приостановка RBC с равным объемом теплой средой RPMI-0. Спин течение 5 мин при 1000 х г. Удалить слой светлого сгустка крови путем аспирации, ресуспендируют в 5 мл среды RPMI-0 и повторить промывочной еще 2 раза.
- Удалить супернатант и добавить достаточно RPMI-A с получением смеси, что составляет 50% по объему RBC.
- Хранить при 4 ° С до тех пор, пока это необходимо.
3. Поддержание паразита культур
- Предварительно теплой среде RPMI-А 37 о С.
- Поместите размороженные паразитов (см MR4 протокол процедуры оттаивания) в колбе Т25 с 5 мл RPMI-A и 75 мкл человеческого промывают RBC для гематокрита ~ 3%.Примечание: Гематокрит измеряет объем эритроцитов по сравнению с общим объемом. Для вычисления гематокрита измерения объема упакованных эритроцитов в общем объеме среды плюс RBC. Предположим, что размороженные паразиты будут способствовать 75 мкл РБК. При добавлении 150 мкл RBC складе (что эквивалентно добавлению 75 мкл упакованной RBC) в колбу есть в общей сложности 150 мкл RBC в 5 мл среды, которая равна гематокрита на 3% (150 мкл / 5000 мкл × 100% = 3%).
- Газ колбу в течение 30 сек с паразитом газовой смеси (1% O 2, 3% СО 2, N 2 баланса). Печать и поместить колбу широкой стороной вниз в 37 ° С инкубатор, чтобы позволить наибольшей площади поверхности для газообмена.
- Чтобы изменить среду и проверить паразитемией (должно быть сделано в день), тщательно перемещать колбу, чтобы не беспокоить слой РБК. Используя стерильный неподсоединённого пипетки Пастера оттянуть культуральной среды, не нарушая слой крови.
- Чтобы проверить годовыхrasitemia, удалить образец 10 мкл из слоя крови, поместить его на предметное стекло и с помощью второго предметного стекла создают тонкую пленку крови. Разрешить слайд высохнуть.
- Место 4 мл свежей RPMI-A в колбу, осторожно перемешать, газ в течение 30 сек, и в инкубаторе место при 37 ° С.
- Пятно слайд, используя окрашивания комплект Hema3 в соответствии с протоколом производителя.
- Для оптимального окрашивания, падение слайды в фиксирующем растворе в течение 10 сек, раствор для меня 10 сек, и решение II в течение 30 сек. Промыть в воде и оставить сушиться слайды.
- Рассчитать паразитемии путем подсчета количества PfRBC (окрашенных темно-фиолетовый) по сравнению с общим количеством РБК (окрашенных розовый). Граф в общей сложности 300 ячеек для обеспечения точности.
- При паразиты достигли паразитемии 5%, расширить культуры в колбу Т75, используя 40 мл RPMI-A, и 500 мкл RBC.
4. Паразит Синхронизация
Примечание: За день до тон экспериментировать, синхронизировать паразита культуры обработкой аланин. Только паразиты кольцо этап и неинфицированных РБК выживет это лечение. Синхронизация аланин даст вам чистого трофозоита культуры на следующий день, что может быть использовано в со-культуры экспериментов. Убедитесь, чтобы начать с паразитами культуре, содержащей большинство кольцо стадии паразитов.
- Готовят раствор аланина путем смешивания 8,01 г аланина (300 мм) и 0,365 г трис (10 мМ) в 300 мл DDH 2 O. Принесите рН до 7,4. Фильтр стерилизовать с помощью блока 0,2 мкм фильтра.
- Предварительно теплый раствор аланин до 37 ° С.
- Спин вниз культуру паразитов (5 мин х 1000 XG), и удалить среду.
- Ресуспендируют осадок в 19 томах аланин раствора (1 мл упакованы РБК 19 мл аланин решение). Инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Спин 5 мин х 1000 х г. Аспирируйте супернатант. Стирать в RPMI-0 раз. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют в RPMI-A и отрегулируйте уровень гематокрита в ~ 3%. га колбу и возвращения к 37 о С.
Примечание: совместное культивирование экспериментов минимум паразитемии 5% трофозоиты необходимо, с добавлением 10% паразитемии считать оптимальной.
5. Паразит РБК Подготовка к сокультуры экспериментов
- Используйте соотношение 3 PfRBC на PBMC в со-культуры экспериментов, чтобы вызвать воспалительную реакцию. Чтобы вычислить общее PfRBC, количественно паразитемии путем тонкого мазка крови, как описано в 3.5, и гематокрита путем подсчета количества эритроцитов на мл культуры паразита с помощью гемоцитометра.
Количество PfRBC =% паразитемии х общая РБК / мл х мл культуры. Например: 10 мл культуры в 10 х 10 6 RBC / мл и 10% паразитемии равна 0,1 × 10 6 / мл х 10 мл = 10 х 10 6 PfRBC. - Спин паразита культуру в течение 5 мин при 1000 мкг (RT). Аспирируйте среднего, и ресуспендируют в 6 х 10 6 PfRBC на мл в RPMI-S + (500 мл RPMI-1640 с добавлением L-глютамина и HEPES, 10% теплаинактивированной ФБС, 1,5 мл гентамицина, 5 мл 100 мМ пирувата натрия, 5 мл 10 мМ MEM заменимых аминокислот, 5 мл 5 мМ -меркаптоэтанол).
- Возьмите под свой контроль крови (неинфицированных РБК от того же донора, используемого для поддержания паразита культуры), рассчитать гематокрита и ресуспендируют в среде RPMI-S +, в то же число РБК в мл как паразита культуры.
6. Выделение человеческого мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС)
- Сбор венозной крови в пробирки с гепарином натрия (зеленый вверху) как с хронической ВИЧ (+), донора и ВИЧ (-) контроля. Не используйте ЭДТА в качестве антикоагулянта, как хелатирующий кальция действия ЭДТА влияет функцию клеток. На среднем ожидали между 5-10 х 10 6 PBMC за 10 мл крови. Для типичного эксперимента собрать 30 мл крови от каждого донора. Объем крови необходимо будет корректироваться в соответствии с экспериментальными требованиям.
- Как быстро, как это возможно, и, безусловно, в течение часа крови собираются,удалить кровь из труб и поместить в полиэтиленовый 50 мл пробирку. Моноциты, в частности, будут активированы и придерживаться стекла, поэтому очень важно, что при использовании сбора крови трубки стекла клетки удаляют как можно быстрее.
- Спин кровь на 1000 мкг в течение 15 мин и собирают плазму (это может быть использовано для других исследований, необходимых при - если не этот шаг может быть пропущен). Развести крови в равном объеме холодного DPBS.
- Поместите 15 мл РТ фиколлом в 50 мл трубки. Медленно, с использованием стерильных пластиковых пипетки передачи, слой крови / DPBS решение за фиколлом без смешивания. Максимум 25 мл крови раствора / DPBS можно наложить на каждые 15 мл Ficoll.
- Спин градиенты в течение 30 мин при комнатной температуре при 600 х г в. Убедитесь, что параметр "нет тормоза" на.
- Как только клетки развернулся, искать интерфейса между двумя фазами. Это то, где РВМС. Используя стерильный пластиковый передачи пипетки собирать РВМС из интерфейса (смРисунок 1). Свести к минимуму загрязнение РБК.
- Поместите собранные клетки в 50 мл пробирки, с не более чем 20 мл на пробирку. Топ труба до 50 мл стерильной холодной DPBS.
- Спин клеток в течение 10 мин при 4 ° С при 300 х г в.
- Удалите супернатант, ресуспендируют осадок в 5 мл стерильного холодного DPBS и объединить все клетки от того же донора в одной пробирке. Долить до 50 мл стерильной DPBS, и повторите шаги мыть еще 2 раза.
- Ресуспендируют клеток в 10 мл RPMI-S + среды.
- Удаление 20 мкл аликвоты и смешать с 20 мкл трипанового синего. Внесите 10 мкл в гемоцитометра и посчитать живые клетки (клетки, которые не взяли на себя синюю краску - все синие клетки мертвы). Использование гемоцитометра для подсчета количества клеток в растворе следующим образом.
Примечание: гемоцитометра имеет сетку заданных размеров, так что площадь, занимаемая линий известно.- Убедитесь, что гемоцитометре чист. Поместите покровное над countiнг площадь. Нагрузка 10 мкл раствора клеточной путем размещения пипетки в одну из скважин клиновидных. Площадь под покровным заполнит под действием капиллярных сил.
- Поместите загруженный гемоцитометра под микроскопом. Полный сетка гемоцитометре содержит 9 квадратов 1 мм 2 каждый. Граф все клетки в каждой большой площади. Если слишком много клетки присутствуют, разбавить раствор дополнительно и пересчет.
- Рассчитать концентрацию клеток следующим образом: Всего клеток / мл = (общий объем клетки подсчитывали / # квадратов) х разведение фактора X 10000 клеток / мл, например, (500 клеток / 5 квадратов) х коэффициент разбавления 20 х 10000 клеток / мл = 20 Всего х 10 6 клеток.
- Регулировка среде до конечной концентрации 10 х 10 6 на мл (RPMI-S + среда).
7. Малярия / ВИЧ-инфекцией Культура
- Пластина 100 мкл изолированных МКПК и 400 мкл RPMI-S + среды в 24-луночный планшет (1 × 10 6 РВМС на лунку). Обеспечиватьчто скважины задаются в трех экземплярах: 3 скважины для неинфицированных РБК, 3 скважины с PfRBC, 3 скважины со средним и 3 скважины с PMA / Ionomycin. Это и для ВИЧ (+) и ВИЧ (-) образец.
- Для PfRBC скважин, место 3 х 10 6 PfRBC в каждом из скважин (500 мкл паразита культуры, подготовленные в 5,2).
- Для неинфицированных эритроцитов скважин, размещать 500 мкл культуры неинфицированных эритроцитов, полученного в 5,3 в каждую лунку.
- Для средних скважин, размещать 500 мкл RPMI-S + среды, в каждую из лунок.
- Для PMA / иономицином скважин, приготовить раствор РМА / иономицином (2,5 мкг / мл, 250 мкг / мл соответственно). Поместите 500 мкл этого раствора в каждую лунку.
Примечание: В мощными стимуляторами секреции цитокинов Т-клеток, РМА и Ionomycin используют в качестве положительного контроля, чтобы обеспечить клетки являются функциональными. - Место пластины в 37 о С в 5% СО 2 инкубатора.
- Дополнительно: использовать лишние клетки для анализа фенотипической помощью проточной цитометрии или магазин в RNСтабилизация решение для будущего анализа экспрессии мРНК.
8. Выявление малярией иммунного ответа
Примечание: Выполните сокультуры эксперименты до тех пор, как 4 дня. Нет среднего изменения не требуются в течение этого времени. Оптимальная точка времени будет зависеть от типа клеток, представляющих интерес и на поставленный вопрос. Инкубационный из 12-48 ч является оптимальным для моноцитарных ответов на PfRBCs, в то время как ответы лимфоцитов были лучше всего наблюдать в 72-96 ч. Моменты времени необходимо будет оптимизирован на основе экспериментальных вопрос. Короткие периоды (2-4 ч) может использоваться, если взаимодействие между неповрежденной PfRBC и МНПК представляет интерес.
- Спин пластины при 300 мкг в течение 3 мин для осаждения клеток. Собирают 700 мкл супернатанта культуры из каждой лунки.
- Спин супернатант при 1000 мкг в течение 5 мин, чтобы очистить от мусора.
- Алиготе очищается супернатант как нужно, этикетки, и замораживание при температуре ниже -20 ° С до анализа секретируемых факторов не должно быть Перфоrmed.
- Анализ ответов цитокинов / хемокинов по ELISA или шарик массива (следовать предложенные протоколы производителя).
- Сбор клеток, оставшихся в плите в растворе РНК стабилизации и использовать для анализа экспрессии мРНК путем количественной ПЦР в реальном времени 14-16.
9. внутриклеточного проточной цитометрии для сотовых конкретных Ccytokine ответы с помощью РВМС культивируют совместно с Р. тропической Зараженный РБК
Примечание: Как указано выше, длина совместного культивирования будет зависеть от типа клеток, представляющих интерес. Если Вы заинтересованы в моноцитарных ответов на PfRBC более короткий инкубационный период необходим. Времена будет больше времени для врожденные реакции лимфоцитов γδ Т-клеток, NK-клетки, NKT клетки), и больше сих пор для CD4 и CD8 Т-клеток. Оптимизация потребуется.
- 6-8 ч до анализа добавить 1 мкл 1,000x брефелдин А для всех скважин. Верните пластину 37 ° С инкубатор. После 6-8 ч incubвания, место пластины на льду в течение 15 мин.
- Удалить клеток из скважин используя энергичные пипетирования и поместить их в маркированные microcentifuge труб. Зачистка может потребоваться удалить моноциты.
- Побочные клетки в течение 5 мин при 1000 х г. Удалить супернатантами. Ресуспендируют клеток в 500 мкл буфера проточной цитометрии (1x DPBS, 2% инактивированной ФБС тепла, 0,02% азида натрия).
- Разделить клетки таким образом, что каждый образец имеет: одну трубку для полного окрашивания антител (240 мкл) и одну трубку для окрашивания флуоресцентной минус один (предприятие) контрольным антителом (240 мкл). Бассейн небольшое количество каждого образца (20 мкл) для неокрашенной проточной цитометрии контроля (это будет использоваться в создании проточного цитометра).
- Спин клетки в течение 5 мин при 500 х г в. Удалить супернатантами.
- Инкубируйте клетки с неконъюгированного анти-CD16 человека / CD32 (5 мкг / мл) в 50 мкл буфера проточной цитометрии в течение 15 мин при 4 ° С, чтобы блокировать рецепторы Fc.
- Добавить 1 мл буфера проточной цитометрии в каждую пробирку. Спин CEзаполняет течение 5 мин при 500 х г в. Удалить супернатантами.
- Ресуспендируют клеток в 50 мкл буфера проточной цитометрии с предварительно титруют концентрации флуорофора-сопряженных антител к желаемым маркеров клеточной поверхности. Премикс раствор достаточно антитела для всех образцов, окрашенных. Инкубируйте клетки при 4 ° С в течение 20 мин. Защита от light.Note: Сумма каждого антитела должны быть оптимизированы. Мы регулярно окрашивать для CD56, CD3, γδ, CD4, CD8, CD14. Титруют объемы этих антител показаны в Таблице 1.
- Добавить 1 мл буфера проточной цитометрии в каждую пробирку. Спин клетки в течение 5 мин при 500 х г в. Удалить супернатантами.
- Добавить 100 мкл cytofix / Cytoperm решения в каждую пробирку. Инкубируйте клетки в течение 20 мин при 4 ° С. Защищать от света.
- Добавить 1 мл Пермь / промывочного буфера (при условии, как 10x концентрата - разбавить до 1x, используя DDH 2 O) в каждую пробирку. Спин клетки в течение 5 мин при 500 х г в. Удалить супернатантами.
- Добавить 100 мкмл Перми буфер / помыть управления Предприятие окрашивания антител труб и смешать ресуспендировать клетки.
- Добавить 100 мкл Пермь / промывочного буфера с заранее титруют концентрации флуорофорных-сопряженных антител к желаемым внутриклеточных маркеров (т.е., цитокинов / хемокинов) до полного окрашивания антител труб.
Примечание: Количество каждого антитела должны быть оптимизированы. Мы регулярно окрашивать с анти-ФНО и анти-IFN, антител. Титруют объемы этих антител показаны в Таблице 1. - Выдержите все трубы в течение 30 мин при 4 ° С. Защищать от света.
- Добавить 1 мл Пермь / Wash буфера в каждую пробирку. Спин клетки в течение 5 мин при 500 х г в. Удалить супернатантами.
- Ресуспендируют клеток в 300 мкл буфера проточной цитометрии с 1% параформальдегида. Пусть сидят в течение как минимум 15 мин, чтобы нейтрализовать ВИЧ.
- Подготовка одного антитела окрашенных образцов с использованием компенсации бусы, которые будут использоваться для компенсации, установленной на проточном цитометре. Тип компенсациишарики будут зависеть от используемых антител (т.е.., против мышиного Ig, анти-крысиного / хомяка Ig). Вихревые шарики. Добавьте одну каплю шариков на антитела. Добавить равное количество антител, которые используются для окрашивания. Добавить 200 мкл буфера проточной цитометрии. Они теперь готовы к использованию. Там нет необходимости мыть шарики.
- Приобретение образцов на проточном цитометре, как можно скорее и в течение 24 часов для достижения наилучших результатов. Тандем красители чувствительны к диссоциации с хранения, поэтому мы рекомендуем немедленно приобретение, если это возможно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Графики показывают уровни IFN & gamma продукции из NKT клеток (рисунок 2), используя CD56 + CD3 + γδ- ворота, чтобы получить популяцию клеток NKT (данные не показаны). Клетки культивировали в течение 72 ч до окрашивания. После того, как пятна, 100000 CD3 + клетки были приобретены на поток цитометр, чтобы получить достаточно большие популяции НК, НКТ и γδ клеток (клеток интерес). Минимум 5600 НКТ клеток выводятся на каждом графике. Выработку ФНО получают таким же способом, (данные не показаны). Графики наглядно демонстрируют, что IFN, производства ниже, в клетках от ВИЧ (+) лиц по сравнению с ВИЧ (-) лиц, подвергающихся PfRBC.
Проточной цитометрии очень субъективно. Поэтому важно, чтобы все соответствующие элементы управления для каждого эксперимента (рисунок 2). Фоновые уровни рассчитываются с использованием образцов Предприятие, что позволяет для истинного представления окрашивания цитокинов.Клетки, стимулированные PMA / иономицином были использованы в качестве положительного контроля (данные не показаны). PMA и Ionomycin сильные стимуляторы Т производства клеток цитокинов. Отсутствие производства IFN & gamma в этих образцах, скорее всего, указывает на проблему с протоколом окрашивания. Тем не менее, другие переменные, такие как жизнеспособность клеток или неактивных реагентов также может быть виноват.
Рисунок 1. Изображение фиколла градиент сообщению спина демонстрируя позицию МНПК.
Рисунок 2. Производство ИФН γ действию естественных киллеров Т-клеток. Блок-схемы были получены стробирования на CD56 + CD3 + клеток (γδ- минимум 5600 событий). IFN, производство обнаруживается в ВИЧ (-) образца стимулированнойП. тропической инфицированных красных кровяных клеток. Этот ответ цитокин больше не проявляется в контексте хронического ВИЧ-инфекции. Пожалуйста, не нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенное версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наш протокол был оптимизирован для того, чтобы наиболее реалистично изучения ВИЧ-малярии ко-инфекции в пробирке. Во-первых, свежие эритроциты человека и сыворотки необходимы для малярийного паразита культуры. Это жизненно важно для получения здорового населения малярийных паразитов. Паразитов лизаты не может быть заменен на живых паразитов, как продукция цитокинов гораздо быстро и интенсивно при использовании живой P. тропической инфицированных РБК (PfRBC) 17,18. Кроме того, активация клеток, таких как типы натуральных киллеров, необходимо целые PfRBCs, и не работает эффективно, с паразитов лизатов. Это может быть из-за необходимости непосредственного контакта между PfRBC и лейкоцитов или может быть из-за нестабильной природы паразита, полученных лигандов, которые взаимодействуют с рецепторами клеточной поверхности 18. Малярия PfRBC культуры также должны быть хорошо синхронизированы (протокол 4) до эксперимента. Синхронные PfRBCs улучшить воспроизводимость экспериментальных данных. Хотя этот протокол декнижники использование сценического трофозоита PfRBC для совместного культуры, он легко может быть изменен для изучения кольцо стадии PfRBC.
Лейкоциты человека может быть искусственно инфицированы ВИЧ, и этот метод был использован в исследованиях исследований ко-инфекцией ВИЧ малярии 20. Однако, это не моделирует иммунную нарушение регуляции, которая является результатом хронического ВИЧ-инфекции. В этой системе сокультуры мы используем РВМС, выделенные из человека участников, которые, хронически инфицированных ВИЧ-1. Когда участники необходимы для изучения, важно тщательно выбрать этот население. Критерии включения и исключения являются жизненно важными для обеспечения минимального изменчивости и максимальную воспроизводимость. Наши критерии включали четкое определение хронической ВИЧ-инфекции (ВИЧ-инфицированных в течение> 1 года, с CD4 + Т-клеток снижением Граф> 50 клеток / мм 3 / год) и исключения тех, кто с сопутствующей инфекции. Это гарантировало, что результаты, полученные могут быть отнесены такЛели-за эффекта хронического ВИЧ-инфекции, а не другой инфекции. Кроме того, так как мы были заинтересованы в врожденных иммунных реакций с малярией мы исключили доноров, которые предыдущий малярийной инфекции.
ВИЧ-неинфицированных лиц контрольной группы также используются для каждого ВИЧ (+) донора, при каждый момент времени выборки, чтобы обеспечить нормализации данных. Попытка должна быть сделана, чтобы соответствовать элементы управления для их соответствующего ВИЧ (+), донора, по крайней мере возраста, но, предпочтительно, также секс (хотя в нашем предыдущем исследовании 12 мы не наблюдали значительную разницу в клеточных подмножеств или ответов цитокинов между женской и мужской ВИЧ неинфицированных участников). Если предполагаемый отбор планируется сохранении того же ВИЧ-неинфицированных управления для каждого времени отбора проб точки выгодно. Ответы могут варьироваться от эксперимента к эксперименту из-за многочисленных факторов, включая здоровье PfRBCs, степени их синхронизации, уровень паразитемии и стадии зрелости PfRBCs, и уровень гематокрита. Заботадолжны быть приняты, чтобы сохранить как многие из них соответствуют между экспериментами. Нормализация к контролю ВИЧ-неинфицированных позволяет в течение некоторого учета этих переменных.
Использование свежих клеток имеет первостепенное значение, чтобы избежать искусственных результаты. Замораживание и оттаивание образцов могут иметь существенное влияние на жизнеспособность клеток 21,22, продукция цитокинов 23-26 и клеточной поверхности фенотипических маркеров 27.
Если моноциты представляют особый интерес, важно, чтобы стекло не используется во время протокола. Моноциты придерживаться стекла и многих других пластмасс 28. Мы используем Полипропилен пипетки, пипетки передачи и трубы по всей свести к минимуму моноцитов приверженность и конечной удаление от нашего населения исследование клеток.
При настройке проточной цитометрии, любая комбинация антител могут быть использованы в зависимости от интересующих клеток. Мы были особенно заинтересованы в IFN & gamma и TNF производстваот NK-клеток, клеток NKT и γδ Т-клеток. Это определило нашу панель антител. Тем не менее, при использовании другой комбинации, важно оптимизировать количество антител для каждой панели. Это жизненно важно, чтобы избежать ошибочных данных. Кроме того, чтобы избежать изменчивости и обеспечить достоверность, лесозаготовительных предприятий требуются для оценки фоновых уровней цитокинов для каждого условия (RBC, PfRBC, средний и РМА / Ionomycin) и участник населения (ВИЧ (-) и ВИЧ (+), рис 2). Измерение в пробирке внутриклеточного продукции цитокинов, как правило, приводит к высоким фоновым уровнем, особенно, когда клетки культивировали до окрашивания. Поскольку условия культивирования влияют фоновые уровни, соответствующие лесозаготовительных предприятий обеспечить знание фонового уровня для каждого образца. Наша поставка ячеек была ограничена, поэтому мы разработали наши лесозаготовительных предприятий, содержит все поверхностные пятна, но нет внутриклеточных пятен. Это позволяет для конкретного сравнения цитокинов фоновых уровней на всех различных типов клеток исследованных.Мы также столкнулись одну пятно на эксперимент для каждой из поверхностных маркеров, чтобы подтвердить свои фоновых уровней.
Протокол, описанный является универсальным одним, который может быть использован для изучения ответов в течение нескольких часов или дней в зависимости от интересующих клеток. Для оптимального производства PfRBC индуцированных цитокинов из лимфоцитов врожденных, мы измерили проточной цитометрии выход после 2 или 3 дней. При взгляде на моноциты, точки раньше времени (1 или 2 дней) рекомендуется. Эта система позволяет нескольким типам клеток и клеточных реакций следует отличать с помощью проточной цитометрии, секреторные ответы должны быть измерены в клеточных супернатантах, и профилей экспрессии быть оценены в добываемой РНК. Кроме того, использование антител блокировать специфические рецепторы цитокинов или нейтрализации могут быть использованы в этой системе для дальнейшего рассекают механизмов. Мы успешно использовали Ил-18 рецептор блокады вовлечь IL-18 рецептор в PfRBC-индуцированных ответов IFN, 12. Эта система представляет собой реалистМетод, с помощью которого IC оценить ряд врожденных иммунных реакций малярии в контексте ВИЧ-инфекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alanine | Sigma | A7377 | |
| antibodies (see other table) | |||
| BD Cytofix/Cytoperm with BD GolgiPlug | BD | 555028 | includes brefeldin A, cytofix/cytoperm buffer and perm/wash buffer |
| BD Vacutainer ACD Solution A | BD | 364506 | |
| BD Vacutainer Sodium Heparin | BD | 17-1440-02 | |
| DPBS (no calcium, no magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F1051 | heat inactivate before use |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| gentamycin (10 mg/ml) | Gibco | 15710-064 | |
| Hema3 Staining Set | Fisher | 122-911 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| Ionomycin | Sigma | I3909 | |
| MEM non-essential amino acids (10 mM) | Gibco | 11140 | |
| PMA | Sigma | P8139 | |
| RPMI-1640 powder | Life-Technologies | 31800-022 | |
| RPMI-1640 with L-glutamine and HEPES | Thermo Scientific | SH30255.01 | |
| sodium bicarbonate (powder, cell culture) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360 | |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T6066 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| Trypan Blue (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| BD CompBead | BD | 552843, 552845 | depends on antibodies used |
| Parasite Gas Mixture | By special order | 3% CO2, 1% O2, balance N2 | |
| Equipment | |||
| 0.2 μm filter unit | |||
| Glass slides | |||
| T25 flasks | |||
| T75 flasks | |||
| 50 ml tubes | |||
| 24 well culture plates | |||
| unplugged Pasteur pipettes | |||
| plugged Pasteur pipettes | |||
| sterile transfer pipettes | |||
| hemocytometer | |||
| flow cytometer (3 laser) | |||
| Antibodies used for flow cytometry | |||
| Anti-TNF | eBiosciences | 551487 | FITC (fluorophore) 2 μl |
| Anti-IFNγ | Biolegend | 506507 | PE (fluorophore) 20 μl |
| Anti-CD8 | Biolegend | 300914 | PE-Cy7 (fluorophore) 1 μl |
| Anti-CD14 | Biolegend; BD Biosciences | 325624; 551487 | Biotin (fluorophore) 0.5 μl Streptavin PE-TR (fluorophore) 0.1 μl |
| Anti-CD56 | Biolegend | 318322 | PerCP/Cy5.5 (fluorophore) 5 μl |
| Anti-γδ | Biolegend | 331212 | APC (fluorophore) 5 μl |
| Anti-CD3 | Biolegend | 300426 | APC-Cy7 (fluorophore) 5 μl |
| Anti-CD4 | Biolegend | 317424 | Pacific Blue (fluorophore) 1 μl |
References
- Graham, A. L., Cattadori, I. M., Lloyd-Smith, J. O., Ferrari, M. J., Bjørnstad, O. N. Transmission consequences of coinfection: cytokines writ large. Trends in parasitology. 23 (6), 284-291 (2007).
- French, N., et al. Increasing rates of malarial fever with deteriorating immune status in HIV-1-infected Ugandan adults. AIDS (London, England). 15 (7), 899-906 (2001).
- Hoffman, I. F., et al. The effect of Plasmodium falciparum malaria on HIV-1 RNA blood plasma concentration. AIDS (London, England). 13 (4), 487-494 (1999).
- Kamya, M. R., et al. Effect of HIV-1 infection on antimalarial treatment outcomes in Uganda: a population-based study. The Journal of infectious diseases. 193 (1), 9-15 (2006).
- Kublin, J. G., et al. Effect of Plasmodium falciparum malaria on concentration of HIV-1-RNA in the blood of adults in rural Malawi: a prospective cohort study. Lancet. 365 (9455), 233-240 (2005).
- Mermin, J., et al. Effect of co-trimoxazole prophylaxis, antiretroviral therapy, and insecticide-treated bednets on the frequency of malaria in HIV-1-infected adults in Uganda: a prospective cohort study. Lancet. 367 (9518), 1256-1261 (2006).
- Patnaik, P., et al. Effects of HIV-1 serostatus, HIV-1 RNA concentration, and CD4 cell count on the incidence of malaria infection in a cohort of adults in rural Malawi. The Journal of infectious diseases. 192 (6), 984-991 (2005).
- Whitworth, J., et al. Effect of HIV-1 and increasing immunosuppression on malaria parasitaemia and clinical episodes in adults in rural Uganda: a cohort study. Lancet. 356 (9235), 1051-1056 (2000).
- Xiao, L., Owen, S. M., Rudolph, D. L., Lal, R. B., Lal, A. A. Plasmodium falciparum antigen-induced human immunodeficiency virus type 1 replication is mediated through induction of tumor necrosis factor-alpha. The Journal of infectious diseases. 177 (2), 437-445 (1998).
- Francesconi, P., et al. HIV, malaria parasites, and acute febrile episodes in Ugandan adults: a case-control study. AIDS (London, England). 15 (18), 2445-2450 (2001).
- Finney, C. A. M., et al. HIV infection deregulates Tim-3 expression on innate cells: combination antiretroviral therapy results in partial restoration. Journal of acquired immune deficiency syndromes. 63 (2), 161-167 (2013).
- Finney, C. A. M., et al. HIV infection deregulates innate immunity to malaria despite combination antiretroviral therapy. AIDS (London, England). 27 (3), 325-335 (2013).
- Ljungstrom, I., et al. Methods in Malaria Research. , 4th edition, MR4/ATCC. Available from: http://www.mr4.org/Publications/MethodsinMalariaResearch.aspx (2013).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
- Universal SYBR green quantitative PCR protocol [Internet]. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.html (2014).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-DDCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Hensmann, M., Kwiatkowski, D. Cellular basis of early cytokine response to Plasmodium falciparum. Infection and immunity. 69 (4), 2364-2371 (2001).
- Artavanis-Tsakonas, K., Riley, E. M. Innate immune response to malaria: rapid induction of IFN-gamma from human NK cells by live Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. J Immunol. 169 (6), 2956-2963 (2002).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. The Journal of parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
- Ludlow, L. E., et al. HIV-1 inhibits phagocytosis and inflammatory cytokine responses of human monocyte-derived macrophages to P. falciparum infected erythrocytes. PloS one. 7 (2), e32102 (2012).
- Weinberg, A., et al. Viability and functional activity of cryopreserved mononuclear cells. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (4), 714-716 (2000).
- Fowke, K. R., Behnke, J., Hanson, C., Shea, K., Cosentino, L. M. Apoptosis: a method for evaluating the cryopreservation of whole blood and peripheral blood mononuclear cells. Journal of immunological. 244 (1-2), 139-144 (2000).
- Jeurink, P. V., Vissers, Y. M., Rappard, B., Savelkoul, H. F. J. T cell responses in fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells: kinetics of cell viability, cellular subsets, proliferation, and cytokine production. Cryobiology. 57 (2), 91-103 (2008).
- Kvarnström, M., Jenmalm, M. C., Ekerfelt, C. Effect of cryopreservation on expression of Th1 and Th2 cytokines in blood mononuclear cells from patients with different cytokine profiles, analysed with three common assays: an overall decrease of interleukin-4. Cryobiology. 49 (2), 157-168 (2004).
- Venkataraman, M. Effects of cryopreservation of immune responses. XI. Heightened secretion of tumor necrosis factor-alpha by frozen human peripheral blood mononuclear cells. Cryobiology. 34 (3), 276-283 (1997).
- Venkataraman, M. Effects of cryopreservation on immune responses. X. Decrease in interleukin-12 production by frozen human peripheral blood mononuclear cells is mediated by the endogenously hypersecreted interleukin-10. Cryobiology. 33 (5), 581-588 (1996).
- Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (3), 352-359 (2000).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. Journal of leukocyte biology. 56 (3), 236-240 (1994).
