Introduction
同時感染、複数の同時感染症の感染は、自然環境では標準です。同時感染は、疾患の病理学上の各感染の臨床管理に大きな影響を持つことができます。同時感染、ワクチン及び薬物の有効性、ならびに診断試験の文脈では、悪影響を受けることができる（1に概説）。しかし、その重要性にもかかわらず、病原体研究の大半は、単一の感染を考慮します。
マラリアおよびHIV-1（HIV）は世界的に罹患率と死亡率の原因をリードしています。 10 -マラリアやHIVの地方的流行の領域は同時感染のリスクが何百万人もの人々を入れ、その結果、より重度の臨床疾患2のリスクが、広い地理的なオーバーラップを共有しています。 2疾患は否定的に相互作用します。 HIVに感染した個体は、より高いHIVウイルス負荷およびCD4 + T細胞数の一時的な減少をしながら、マラリア感染の間に見ることができますマラリア原虫の負担と臨床および重症マラリアのリスクが同時感染した個体2,3,5,7,8,10に高くなっています。 HIVは、マラリアの重症度を増加するメカニズムは完全に理解し、さらなる調査を保証されていません。
ここでは、マラリア、HIV同時感染をインビトロで研究することができる方法を記載している。具体的には、この方法は、HIV感染の文脈におけるマラリア特異的免疫応答の検査が可能になります。我々のプロトコルは、培養されたP.慢性的にHIVに感染したドナーからインビトロで単離新たに単離した末梢血単核細胞を用いた汎用性の高い共培養系（のPBMC）について説明熱帯熱マラリア原虫は赤血球（PfRBC）を寄生しました。これらの応答のHIV抗レトロウイルス療法の影響はまた、HIV（+）ドナー前および治療後からプロスペクティブに収集したPBMCを使用して検査することができます。
我々は、HIV感染の影響を調査するためにこのシステムを使用していますマラリア固有の自然免疫応答の11,12、およびNK細胞で損なわれることマラリア固有のIFNγおよびTNF応答を決定することができました、HIV（+）ドナー前後のHIV抗レトロウイルス療法からNKT細胞、γδT細胞。さらに、当社は、単球の機能はまた、HIV（+）ドナーにおいて減損が、後のHIV抗レトロウイルス療法を回復していると判断する。このシステムを使用することができました。
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Protocol
このプロトコルは、寄生虫培養に使用される血清およびRBCのためのドナーの補充を必要とし、PBMCの単離のためのHIV（+）と非感染ドナー。機関審査委員会は、すべての研究を承認する必要があり、すべてのドナーは、血液採取の前にインフォームドコンセントを提供する必要があります。
注意：ヒトの血液サンプルと人間のマラリア原虫での作業は、予防措置が必要です。常にレベル2バイオセーフティキャビネットに白衣、手袋、作業を着用してください。人間のマラリアへの偶発的な経皮的曝露の場合には、予防的治療のための健康と安全に報告。さらなる安全性の考慮はまた、HIV（+）の血液を処理するための場所に置かれるべきです。バック閉じる白衣を着用してください。ダブル手袋（トップ手袋はラテックスであるべきです）。レベル2バイオセーフティキャビネット内のすべての処理を実行します。任意のガラスや、先がとがった物を使用しないでください。吸引器を使用しないでください。捨てる前に1時間の最低virox液や漂白のすべての汚染されたアイテムを配置します。使用後1時間viroxとUVとのすべての表面を洗浄します。各機関が続いする必要があり、独自の特定の生物学的安全性の規制があることに注意してください。可能な暴露後予防の評価および検討のための健康と安全へのHIV感染血液へのすべての偶発的暴露を報告します。
注：Pの異なる株を熱帯熱マラリア原虫が存在します。 ITGは、これらの実験に使用したが、異なる株を使用することができます。凍結融解の熱帯熱マラリア原虫寄生虫に優れた命令は、MR4のウェブサイト13でご利用いただけます。
1.マラリア原虫の文化のためのRPMI-Aを作ります
- ddH 2 Oを 、RPMI-1640粉末、HEPESの6グラム、炭酸水素ナトリウムの2グラム、およびヒポキサンチンの1.35ミリグラムの1パケットの950ミリリットルを混合することによりRPMI-0にします。
- 解凍熱は、2人の異なるドナーからのヒト血清を不活性化。 ABドナーが最適であるが、寄生虫がO型で増殖させる場合に任意のものを使用することができます赤血球（RBC）。混合するためにチューブを反転。血清は、粒子状物質が含まれているか、厚いスピンが2000rpmであるとした場合、次に0.45μmフィルターユニットを用いて液体部分をフィルタリングします。
- RPMI-0 180ミリリットル（各ドナーからの10 ml）をヒト血清、0.2μmフィルターユニットのフィルターを20 mlを用いて、および10mg / mlのゲンタマイシンを0.5ml。
注意：複数のフィルタユニットが必要な場合がありますので、ヒト血清がフィルターを詰まらせることができます。 - RPMI-A、日付、および血清の供給源を含む培地ボトルにラベルを付けます。冷蔵までに要します。冷蔵したRPMI-Aは曇りなるかもしれません。これは正常ですが、曇りの増加は、汚染の兆候です。
注意：寄生虫成長が異なるドナー血清中に異なる場合があります。これは、使用する前に、良好な寄生虫の成長のために、すべてのヒト血清バッチをテストすることをお勧めします。
寄生虫の文化のための準備2.ヒト赤血球
注：血液ドナー型O.でなければなりません
- 酸-CITへの血液7-10ミリリットル収集レート - デキストロース（ACD）チューブ。ラベルのコレクションのドナーのIDと日付を記入してください。
- 4 O Cで保存血必要になるまで。 1ヶ月以内に寄生虫培養のための血液を使用してください。
- 70％エタノールでチューブの上部を拭きます。慎重に栓を除去し、廃棄します。 15mlチューブに血液を移します。千×gで3分間スピン。吸引してプラズマを削除します。
- 暖かいRPMI-0等容量のRBCを一時停止します。千×gで5分間スピン。 RPMI-0の5mlに、吸引により再懸濁をバフィーコートを外し、洗浄を2回以上繰り返します。
- 上清を除去し、体積比で50％のRBCである混合物を生成するのに十分なRPMI-Aを追加します。
- 必要になるまで4 O Cで保管してください。
3.パラサイト文化の維持
- プリ暖かいRPMI-Aに37℃。
- RPMI-Aと〜3％のヘマトクリットのために洗浄し、人間RBC75μlの5 mLでT25フラスコに（解凍手順のMR4プロトコルを参照してください）を解凍寄生虫を置きます。注意：ヘマトクリットは、総容量に比べてRBCの量を測定します。計算するために、ヘマトクリットは培地プラスRBCの総容量にパックされたRBCの体積を測定。解凍した寄生虫がRBCの75μLを貢献することを前提としています。 3％のヘマトクリット（150μL/ 5,000に等しい培地5mlにRBCの150μLの合計が、そこにあるフラスコに（パックされたRBCの75μLを加えることに相当する）のRBC株式の150μLを加えることでμL×100％= 3％）。
- 寄生虫ガス混合物（1％O 2、3％CO 2、バランスN 2）で30秒間フラスコをガス。ガス交換のための最大の表面積を可能にするように37°Cのインキュベーター内でダウンフラスコワイド側をシールし、配置します。
- RBC層を乱さないようになどの媒体を変更し、寄生虫（毎日実行する必要がある）かどうかを確認するには、慎重にフラスコを移動します。無菌抜いパスツールピペットを使用すると、血液層を乱すことなく、培養培地をオフに描きます。
- PAを確認するにはrasitemia、血液層から10μlのサンプルを削除し、スライドガラス上に配置し、第二のガラススライドを使用しては薄い血液フィルムを作成します。スライドが乾燥することができます。
- 優しく、フラスコに新鮮なRPMI-Aの4ミリリットルを置き30秒間、ガスを混合し、37℃のインキュベーターで場所。
- 製造業者のプロトコルに従ってHema3染色キットを使用してスライドを染色します。
- 最適な染色のために、10秒、10秒のためのソリューション私を、30秒間溶液II定着液中のディップスライド。水ですすぎ、乾燥するスライドを残します。
- RBCの総数（染色ピンク）対（濃い紫色に染色）PfRBCの数をカウントすることによって寄生虫を計算します。正確さを保証するために300個の細胞の合計を数えます。
- 寄生虫は5％の寄生虫血に達したときに、RPMI-Aの40ミリリットル、およびRBCの500μLを使用して、T75フラスコに文化を展開します。
4.パラサイト同期
注意：T前日彼は、実験アラニンで処理することによって寄生虫文化を同期します。リングステージ寄生虫と感染していないRBCのみがこの治療を生き残ります。アラニンの同期はあなたの共培養実験に使用することができ、次の日に、純粋な栄養型文化を与えます。リング期寄生虫の大半が含まれている寄生虫の文化で開始することを確認します。
- ddH 2 Oで300mlにアラニンの8.01グラム（300ミリモル）及びトリス（10ミリモル）の0.365グラムを混合することにより、アラニン溶液を調製します7.4のpHを持参してください。フィルターは、0.2ミクロンのフィルターユニットを用いて滅菌します。
- プリ暖かいアラニン溶液に37℃。
- 寄生虫培養物（X千XG 5分）をスピンダウンし、培地を除去します。
- アラニン溶液を19容積の再懸濁ペレット（1mlを19ミリリットルアラニン溶液に、RBCパック）。 RTで15分間インキュベートします。
- スピン5分のxのx千グラム。上清を吸引。一度RPMI-0で洗います。上清を吸引し、再懸濁したRPMI-A及び〜3％のヘマトクリットを調整します。 Gフラスコとして37℃。に戻ります
注意：共培養実験のために、5％の栄養体の最小寄生虫が最適と考え、10％の寄生虫で、必要とされています。
共培養実験のための5寄生虫とRBC準備
- 炎症反応を誘導するために共培養実験におけるPBMCあたり3 PfRBCの比率を使用してください。 PfRBC合計を計算するために、3.5に記載され、およびヘマトクリット血球計数器を用いて寄生虫培養物1mLあたりRBCの数をカウントすることによってのような薄い血液塗抹標本を作製することによって寄生虫を定量化します。
PfRBC =％の寄生虫の数は、文化のRBC / mlのX mlの全xは。たとえば、次のように10×10 6 RBC / mlおよび10％の寄生虫血で培養10 mlの0.1×10 6 / mlのX 10ミリリットル= 10×10 6 PfRBCに等しいです。 - 千XG（RT）で5分間寄生虫の文化をスピン。培地を吸引し、L-グルタミンおよびHEPES、10％の熱で補充6×10 6 RPMI-S内の1ml当たりPfRBC +（500ミリリットルRPMI-1640に再懸濁不活性化FBS、1.5 mlのゲンタマイシン、100mMのピルビン酸ナトリウムの5 mlの10 mMのMEM非必須アミノ酸の5 mlの、βメルカプトエタノール5mMの5mlの）。
- 寄生虫の文化として1ml当たりのRBCの数が同じで、RPMI-Sの+におけるヘマトクリットおよび再懸濁を計算し、（寄生虫の文化を維持するために使用されるのと同じドナーから感染していないRBC）コントロール血液を取ります。
ヒト末梢血単核細胞（PBMC）の単離6。
- （ - ）コントロール慢性HIV（+）ドナーとHIVの両方からヘパリンナトリウム管（グリーン上）に静脈血を採取します。 EDTAのカルシウムキレート作用が細胞機能に影響を与えるなどの抗凝固剤としてEDTAを使用しないでください。平均的に10mlの血液あたり5〜10×10 6 PBMCの間で期待しています。典型的な実験のために、各ドナーからの血液の30ミリリットルを収集します。血液量は、実験の要件に応じて調整する必要があります。
- 可能な限り迅速かつ確実に収集された血液の時間内に、チューブから血液を除去し、プラスチック製の50mlチューブに配置します。特に、単球を活性化し、それがガラス採血管を使用する場合、細胞は可能な限り迅速に除去されることが重要であるので、ガラスに粘着されます。
- 15分、1000×gで血液をスピンし、血漿を収集し（ - ではない、このステップをスキップすることができれば、これは必要に応じて他の研究のために使用することができます）。冷たいDPBS等量の中で血液を希釈します。
- 50ミリリットルチューブにRTフィコール15mlのを置きます。ゆっくりと、滅菌プラスチックトランスファーピペットを用いて、任意の混合せずにフィコール上の血液/ DPBS溶液層。血液/ DPBS溶液25mlの最大値は、フィコールの各15ミリリットルの上に階層化することができます。
- 600×gで室温で30分間の勾配をスピン。 「ブレーキなし」設定がオンになっていることを確認してください。
- 細胞を回転させた後、2つの相の間の界面を探します。 PBMCがある場所です。インタフェースからのPBMCを収集滅菌プラスチック転送ピペットを用いて（参照図1）。 RBCによる汚染を最小限に抑えます。
- チューブあたりせいぜい20mlで、50mlチューブに回収した細胞を配置します。無菌冷たいDPBSで50mlまでトップチューブ。
- 300×gで4 O℃で 10分間細胞をスピン。
- 上清を捨て、5ミリリットル中にペレットを再懸濁し、無菌冷たいDPBSと1チューブに同じドナーからのすべてのセルをプール。無菌DPBSで50mlまでトップ、および洗浄を2回以上のステップを繰り返します。
- 10ミリリットルのRPMI-S +培地中で細胞を再懸濁し。
- 20μlのアリコートを取り出して、トリパンブルー20μlを混ぜます。血球計数器でピペット10μlの生細胞を数える（青色色素を取り上げていない細胞 - すべての青色の細胞が死んでいます）。次のように溶液中の細胞数を計算するために、血球計数器を使用してください。
注：線で覆われた領域が知られているように、血球計数器は、指定された大きさの格子を有しています。- 血球計数器がクリーンであることを確認します。 countiの上にカバースリップを置き、ngのエリア。負荷V字型のウェルの中にピペットチップを配置することによって、細胞溶液10μl。カバースリップの下の領域は、毛管作用により充填します。
- 顕微鏡下でロードされた血球計数器を置きます。血球計のフルグリッドを1mm 2の各9正方形が含まれています。各大きな正方形内のすべてのセルを数えます。あまりにも多くの細胞が存在する場合は、さらにソリューションおよび再集計を希釈します。
- 例えば 、総細胞/ mLの=は、（全細胞は、正方形の/＃カウント）希釈係数X 10,000細胞/ mlにX、（500セル/ 5四角）ミリリットル= 20/20×10,000細胞の希釈係数をxは次のように細胞濃度を計算します×10 6細胞を合計します。
- 1mlあたり10×10 6（RPMI-S +培地）の最終濃度になるように培地を調整します。
7.マラリア/ HIV同時感染の文化
- 板孤立PBMCの100μlの24ウェルプレート（ウェル当たり1×10 6 PBMC）を、RPMI-S +培地400μlの。確認ウェルを三連で設定されていること：非感染RBCのための3つのウェル、PfRBCと3ウェル、媒体との3ウェル、およびPMA /イオノマイシンで3ウェル。 （ - ）サンプルこれは、両方のHIV（+）及びHIVのためのものです。
- PfRBCウェルは、ウェル（5.2で調製した寄生虫の文化の500μL）のそれぞれに3×10 6 PfRBCを配置します。
- 非感染RBCウェルは、各ウェルに5.3で製造した非感染RBC文化の500μlのを配置します。
- メディア井戸のために、各ウェルにRPMI-S +培地500μlを配置します。
- PMA /イオノマイシンウェルは、PMA /イオノマイシン溶液を調製（2.5 pg / mlで、250 pgは/ mlのそれぞれ）。各ウェルのこの溶液500μlを置きます。
注：T細胞のサイトカイン分泌の強力な刺激物質としては、PMAおよびイオノマイシンは、細胞が機能的であることを確認するための陽性対照として使用されます。 - 5％CO 2インキュベーター内で37°Cの場所でのプレート。
- オプション：RNでフローサイトメトリーまたはストアを使用して、表現型分析のための余分な細胞を使用します将来のmRNA発現分析のための安定化溶液。
8.検出マラリア免疫応答の
注：限り4として日間共培養実験を行います。いいえ培地交換はこの時間の間に必要とされません。最適な時点は、目的の細胞型と尋ねた質問に依存します。リンパ球の応答は最高72〜96時間で観察された12〜48時間のインキュベーションは、PfRBCsへの単球の応答に最適です。時点は、実験の質問に基づいて最適化する必要があります。インタクトPfRBCのPBMCとの間の相互作用が重要である場合は、より短い期間（2-4時間）を使用することができます。
- ペレット細胞に3分間300×gでスピンプレート。各ウェルから培養上清700μlのを収集します。
- いずれかの破片を明確に5分、1000×gで上清をスピン。
- アリコートは以下で必要と、ラベル、および凍結など上清をクリア-20°C分泌因子の分析はperfoようになるまでrmed。
- ELISAによって、またはビーズアレイ（製造元が推奨プロトコルに従う）によるサイトカイン/ケモカイン応答を分析します。
- RNA安定化溶液にプレートに残っている細胞を回収し、定量的リアルタイムPCR法14-16によってmRNA発現解析のために利用します。
Pで PBMC共培養を用いて細胞に特異的Ccytokine応答9.細胞内フローサイトメトリー熱帯熱マラリア原虫感染赤血球
注：共培養の長さは、上述したように、目的の細胞型に依存します。短い潜伏期間をPfRBCする単球の反応に興味があれば必要とされています。先天性リンパ球応答は、CD4およびCD8 T細胞の静止長いT細胞、NK細胞、NKT細胞）γδ、及びための時間が長くなります。最適化が必要となります。
- 分析の前に6-8時間は、すべてのウェルに1,000倍ブレフェルジンAの1μlを添加します。 37 O Cのインキュベーターにプレートを返します。 6-8時間のincub後ationが、氷上で15分間、プレートを配置。
- 積極的なピペッティングを使用してウェルから細胞を除去し、標識microcentifugeチューブに入れます。スクレイピングは、単球を除去するために必要な場合があります。
- 千×gで5分間スピン細胞。上清を除去します。 500μlの再懸濁細胞はバッファフローサイトメトリー（1×DPBS、2％の熱不活性化FBS、0.02％アジ化ナトリウム）。
- 蛍光マイナス1（FMO）コントロール抗体染色（240μL）の完全な抗体染色（240μL）のための1つのチューブと、1つのチューブを：各サンプルが持つように、アップセルを分割します。未染色のフローサイトメトリー制御のためのプールの各試料を少量（20μL）（これは、フローサイトメーターの設定に使用されます）。
- 500×gで5分間細胞をスピン。上清を除去します。
- Fc受容体をブロックするためにO 4℃で 15分間、フローサイトメトリーバッファー50μlのフローの非コンジュゲート抗ヒトCD16 / CD32（5μg/ mlの）で細胞をインキュベートします。
- 各チューブにフローサイトメトリー用緩衝液1mlを追加します。スピンCE500×gで5分間LLS。上清を除去します。
- 流れ50μlの再懸濁細胞は、フローサイトメトリー所望の細胞表面マーカーへのフルオロフォア結合抗体のプレ滴定濃度のバッファー。染色された対象の全てのサンプルのための十分な抗体溶液を予め混合します。 20分間4 O℃で細胞をインキュベートします。 light.Noteからの保護：各抗体の量を最適化することがあります。私たちは日常的に、CD56、CD3、γδ、CD4、CD8、CD14を染色。これらの抗体のための滴定体積を表1に示します。
- 各チューブにフローサイトメトリー用緩衝液1mlを追加します。 500×gで5分間細胞をスピン。上清を除去します。
- 各チューブにのCytofix / cytoperm溶液100μlを追加します。 4 O℃で20分間細胞をインキュベート光から保護します。
- 各チューブに- （のddH 2 Oを使用して1Xに希釈10倍濃縮物として提供される）パーマ/洗浄緩衝液1mlを追加します。 500×gで5分間細胞をスピン。上清を除去します。
- 100μを追加パーマlの/ FMOコントロール抗体染色チューブにバッファーを洗浄し、細胞を再懸濁するために混ぜます。
- 完全な抗体染色チューブに所望の細胞内マーカーに対する蛍光団結合抗体のプレ滴定濃度（ すなわち、サイトカイン/ケモカイン）でパーマ/洗浄緩衝液100μlを追加します。
注：各抗体の量を最適化する必要があります。私たちは日常的に抗TNFおよび抗IFNγ抗体で染色。これらの抗体のための滴定体積を表1に示します。 - 4 O℃で30分間、すべてのチューブをインキュベート光から保護します。
- 各チューブにパーマ/洗浄緩衝液1mlを追加します。 500×gで5分間細胞をスピン。上清を除去します。
- 300μlの再懸濁細胞を、1％パラホルムアルデヒドでバッファフローサイトメトリー。 HIVを中和するために15分の最低座ってみましょう。
- フローサイトメーター上でセットアップ補償に使用されるように、補償ビーズを使用して単一の抗体染色したサンプルを準備します。報酬の種類ビーズを使用する抗体に依存するであろう（ すなわち 、抗マウスIg、抗ラット/ハムスターIG）。渦ビーズ。抗体当たりのビーズの一滴を追加します。染色のために使用される抗体の等量を追加します。フローサイトメトリー用緩衝液200μlを追加します。これらを使用する準備は完了です。ビーズを洗浄する必要はありません。
- できるだけ早くサイトメーターと最良の結果を得るために、24時間内の流れのサンプルを取得します。可能ならば、我々は、即時取得をお勧めしますので、タンデム色素は、ストレージとの解離の影響を受けやすいです。
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Representative Results
グラフは、NKT細胞の集団を得るためにCD56 + CD3 +γδ-ゲートを使用して、NKT細胞からのIFNγ産生（ 図2）のレベルを示している（データは示さず）。細胞は染色前に72時間培養しました。一度染色100,000 CD3 +細胞は、NK、NKTおよびγδ細胞（目的の細胞）の十分な大きさの集団を得るために、フローサイトメーターで得ました。 5600 NKT細胞の最小値を各グラフに表示されます。 TNF産生は、同様の方法で得られた（データは示さず）。 （ - ）PfRBCに曝露された個体のグラフは明らかにIFNγ産生がHIVに比べて、HIV（+）個体由来の細胞では低くなっていることを示しています。
フローサイトメトリー分析は非常に主観的です。これは、各実験のためのすべての適切な制御を有することが不可欠である（ 図2参照）。バックグラウンドレベルは、サイトカイン染色の真の表現を可能にするFMOサンプルを用いて計算されます。PMA /イオノマイシンで刺激された細胞は、陽性対照として使用した（データは示さず）。 PMAおよびイオノマイシンは、T細胞のサイトカイン産生の強力な刺激物質です。これらのサンプル中のIFNγ産生の欠如は、最も可能性の高い染色プロトコルに問題があることを示すことになります。しかしながら、そのような細胞の生存または非アクティブの試薬のような他の変数も、故障であってもよいです。
PBMCの位置を実証フィコール勾配郵便スピンの図1.描写。
ナチュラルキラーT細胞による、図2、IFNγ産 。フロー図は、CD56 + CD3 +細胞γδ-（5600イベントの最小値）にゲーティングすることによって得ました。 （ - ）で刺激したサンプルIFNγ産生は、HIVで検出可能です熱帯熱マラリア原虫の赤血球を感染させました。このサイトカイン応答は、慢性HIV感染との関連ではもはや明らかではありません。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
我々のプロトコルは、最も現実的に、インビトロでの HIV-マラリア同時感染を研究するために最適化されています。まず、新鮮なヒト赤血球と血清はマラリア原虫の培養に必要とされます。これは、マラリア原虫の健常者集団を得ることが不可欠です。サイトカイン産生をはるかに迅速かつ強烈であるとしてライブPを使用したとき寄生虫溶解物は、ライブ寄生虫の代わりに使用することはできません熱帯熱マラリア原虫は 、RBC（PfRBC）17,18を感染させました。また、NK細胞のような細胞型の活性化は、全体PfRBCsを必要とし、寄生虫の溶解物を効率的に動作しません。これはPfRBCと白血球との間の直接接触の必要性であり得るか、または細胞表面受容体18と相互作用寄生虫由来のリガンドの不安定な性質に起因し得ます。マラリアPfRBCの培養もよく、実験前に（プロトコル4）を同期させる必要があります。同期PfRBCsは、実験データの再現性を向上させます。このプロトコルが、デ律共培養のための栄養型の段階PfRBCの使用は、それが簡単にリングステージPfRBCの研究のために変更することができます。
ヒト白血球は、人為的にHIVに感染することができ、この方法は、マラリア、HIV同時感染の研究20の研究に使用されています。しかし、これは、慢性HIV感染に起因する免疫調節不全をモデル化しません。この共培養系では、慢性的にHIV-1に感染している人の参加者から分離されたPBMCを使用しています。参加者は研究のために必要とされる場合には、慎重にこの集団を選択することが重要です。基準及び除外基準は、最小の変動および最大の再現性を確保するために不可欠です。当社の基準は、同時感染した誰の除外（> 50細胞/ mm 3 /年のCD4 + T細胞数の減少と> 1年間のHIV感染）慢性HIV感染の明確な定義が含まれています。これは、得られた結果は、そのように帰することができることを確実に慢性HIV感染症ではなく、他の感染症の影響にレリー。私たちはマラリアに対する自然免疫応答に興味を持っていたので、また、私たちは前のマラリア感染していたドナーは除外しました。
HIV非感染のコントロールは、データの正規化を可能にするために、すべてのサンプリング時点で、各HIV（+）ドナーのために使用されます。我々の以前の研究12で私たちは、女性と男性の間の細胞のサブセットまたはサイトカイン応答に有意な差は見られなかったが、試みは（それぞれのHIV（+）は、少なくとも年齢のためのドナーが、好ましくは、また性別にコントロールを一致させるためになされるべきであるHIV-感染していない参加者）。将来のサンプリングは、各サンプリング時点について同じHIV非感染コントロールを維持する計画されている場合に有益です。応答はPfRBCsの健康、同期、寄生虫血レベルとPfRBCsの成熟の段階の程度、およびヘマトクリットレベルを含む複数の要因による実験間で変化し得ます。お手入れ実験の間、これらの一貫の多くを保つように注意しなければなりません。 HIV非感染制御に正規化すると、これらの変数のいくつかの会計処理を可能にします。
新鮮な細胞を使用すると、人工的な結果を回避するために非常に重要です。凍結融解サンプルは有意な細胞生存率に影響を与える21,22、サイトカイン産生23-26および細胞表面表現型のマーカー27を有することができます 。
単球は特に重要である場合には、ガラスは、プロトコルの間に使用されないことが重要です。単球は、ガラスや他の多くのプラスチック28に準拠しています。我々は我々の研究の細胞集団から単球の接着性と究極の除去を最小限にするために全体でポリプロピレンプラスチックピペット、ホールピペット、チューブを使用しています。
フローサイトメトリーアッセイを設定する場合、抗体の任意の組み合わせは、目的の細胞に応じて使用することができます。私たちは、IFNγおよびTNF産生に特に興味を持っていましたNK細胞、NKT細胞及びγδT細胞から。これが私たちの抗体パネルを定義しました。しかし、別の組み合わせを使用する場合には、各パネルに対する抗体の量を最適化することが重要です。これは、誤ったデータを避けるために不可欠です。 （ - ）およびHIV（+）、 図2 HIV（）も、有効性を変動を回避し、確実にするために、のFMOは、各条件（RBC、PfRBC、培地、及びPMA /イオノマイシン）と参加者集団の背景サイトカインレベルを評価するために必要とされます。 インビトロの細胞内サイトカイン産生を測定することは、通常、細胞を染色する前に培養された場合は特に、高いバックグラウンドレベルをもたらします。培養条件は、バックグラウンドレベルに影響を与えるので、適切なのFMOは、各サンプルについてのバックグラウンドレベルの知識を確保します。細胞の私達の供給は、したがって、我々は、すべての表面の汚れが、無細胞内の汚れを含めるために私たちのFMOを設計し、限定的でした。このことは、研究された全ての種々の細胞型のサイトカインのバックグラウンドレベルの固有の比較を可能にします。我々はまた、バックグラウンドレベルを確認するために、表面マーカーのそれぞれについて実験ごとに一つの染色を実行しました。
説明されたプロトコルは、目的の細胞に応じて、数時間または数日以内に応答を調べるために使用することができる多用途の一つです。先天性のリンパ球から最適PfRBC誘発性サイトカイン産生のために、我々は2または3日後に出力フローサイトメトリーを測定しました。単球を見ると、それ以前の時点（1または2日）が推奨されています。このシステムは、抽出されたRNAで評価される複数の細胞型およびフローサイトメトリーによって区別される細胞応答、細胞上清中で測定される分泌応答と発現プロファイルを可能にします。さらに、特定の受容体をブロックまたはサイトカインを中和する抗体の使用は、さらに、機構を分析するために、このシステムで利用することができます。我々は成功しPfRBCによって誘発されるIFNγ応答12におけるIL-18受容体を巻き込むために、IL-18受容体遮断を使用しています。このシステムは、現実主義を表しHIV感染症のコンテキストでマラリアに先天性免疫応答の数を評価することにより、ICの方法。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alanine | Sigma | A7377 | |
| antibodies (see other table) | |||
| BD Cytofix/Cytoperm with BD GolgiPlug | BD | 555028 | includes brefeldin A, cytofix/cytoperm buffer and perm/wash buffer |
| BD Vacutainer ACD Solution A | BD | 364506 | |
| BD Vacutainer Sodium Heparin | BD | 17-1440-02 | |
| DPBS (no calcium, no magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F1051 | heat inactivate before use |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| gentamycin (10 mg/ml) | Gibco | 15710-064 | |
| Hema3 Staining Set | Fisher | 122-911 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| Ionomycin | Sigma | I3909 | |
| MEM non-essential amino acids (10 mM) | Gibco | 11140 | |
| PMA | Sigma | P8139 | |
| RPMI-1640 powder | Life-Technologies | 31800-022 | |
| RPMI-1640 with L-glutamine and HEPES | Thermo Scientific | SH30255.01 | |
| sodium bicarbonate (powder, cell culture) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360 | |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T6066 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| Trypan Blue (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| BD CompBead | BD | 552843, 552845 | depends on antibodies used |
| Parasite Gas Mixture | By special order | 3% CO2, 1% O2, balance N2 | |
| Equipment | |||
| 0.2 μm filter unit | |||
| Glass slides | |||
| T25 flasks | |||
| T75 flasks | |||
| 50 ml tubes | |||
| 24 well culture plates | |||
| unplugged Pasteur pipettes | |||
| plugged Pasteur pipettes | |||
| sterile transfer pipettes | |||
| hemocytometer | |||
| flow cytometer (3 laser) | |||
| Antibodies used for flow cytometry | |||
| Anti-TNF | eBiosciences | 551487 | FITC (fluorophore) 2 μl |
| Anti-IFNγ | Biolegend | 506507 | PE (fluorophore) 20 μl |
| Anti-CD8 | Biolegend | 300914 | PE-Cy7 (fluorophore) 1 μl |
| Anti-CD14 | Biolegend; BD Biosciences | 325624; 551487 | Biotin (fluorophore) 0.5 μl Streptavin PE-TR (fluorophore) 0.1 μl |
| Anti-CD56 | Biolegend | 318322 | PerCP/Cy5.5 (fluorophore) 5 μl |
| Anti-γδ | Biolegend | 331212 | APC (fluorophore) 5 μl |
| Anti-CD3 | Biolegend | 300426 | APC-Cy7 (fluorophore) 5 μl |
| Anti-CD4 | Biolegend | 317424 | Pacific Blue (fluorophore) 1 μl |
References
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