Introduction
合并感染，感染多个并发感染，是在自然的环境中的常态。共感染可以对疾病的病理和在每个感染的临床管理有重要影响。在共感染，疫苗和药物功效，以及诊断测试的范围内，可负面影响（在1中综述）。然而，尽管它的重要性，大多数病原体的研究只考虑单一的感染。
疟疾和HIV-1（艾滋病病毒）是全球领先的发病率和死亡率的原因。疟疾和艾滋病毒流行地区有着广泛的地理重叠，把数以百万计的人在共同感染的风险，因此，在风险更严重的临床疾病2 - 10。这两种疾病的负面互动。在艾滋病毒感染者，较高的HIV病毒载量和CD4 + T细胞计数暂时下降可在疟疾感染中可以看出，虽然疟疾寄生虫负担和临床和严重疟疾的风险是共同感染的个体2,3,5,7,8,10更高。由艾滋病病毒增加了疟疾严重性的机制尚不十分清楚，需要进一步调查。
在这里，我们描述了一个由疟疾和艾滋病病毒双重感染可在体外进行研究的方法，具体地讲，这种方法允许在感染艾滋病毒的情况下疟疾的特异性免疫反应的检查。我们的协议描述了从慢性感染艾滋病毒的捐助者，并在体外培养P.隔离使用新鲜分离的外周血单核细胞一个多功能的共培养体系（外周血单个核细胞） 疟原虫寄生红细胞（PfRBC）。 HIV抗逆转录病毒疗法对这些反应的影响，也可以使用前瞻性收集的PBMC来自HIV（+），供体前和治疗后研究。
我们已经使用这个系统来研究艾滋病病毒感染的影响疟疾特异性先天免疫反应11,12，并能够确定该疟疾特异性IFNγ和TNF响应在NK细胞受损，NKT细胞，γδŤ来自HIV（+），供体前后的HIV抗逆转录病毒治疗的细胞。此外，我们能够使用这个系统来确定单核细胞功能也受损HIV（+）捐助者，但恢复后的HIV抗逆转录病毒治疗。
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Protocol
此协议需要捐助者的血清和红细胞用于寄生虫文化的招募和HIV（+）和未感染的捐助者外周血单个核细胞分离。机构审查委员会必须批准所有研究和所有捐助者必须提供之前抽血知情同意书。
警告：人类血液样本和人类疟原虫工作需要的预防措施。总是穿着白大褂，手套和工作在2级生物安全柜。在意外经皮接触到人类疟疾的情况下，报告给健康和安全的预防性治疗。额外的安全考虑也应到位与HIV（+）血工作。穿一回收盘白大褂。双人手套（顶级手套应胶乳）。执行所有操作在2级生物安全柜。不要使用任何玻璃或尖锐物体。不要使用抽吸。发生在virox溶液或漂白粉所有被污染的物品之前丢弃至少1小时的。洗virox和UV所有表面1小时以下使用。需要注意的是每家机构将需要遵循自己特定的生物安全法规。报告所有意外暴露于艾滋病病毒感染者的血液，以健康和安全评估和考虑可能的暴露后预防。
注：P的不同菌株恶性疟疾寄生虫存在。 ITG被用于这些实验，但不同的菌株可以使用。可在MR4网站13冻融恶性疟原虫的寄生虫优秀的说明。
1.制作RPMI-A为疟疾寄生虫文化
- 使RPMI-0通过混合950 ml的DDH 2 O的的，的RPMI-1640粉末1包，6克的HEPES，2克碳酸氢钠，以及1.35毫克次黄嘌呤。
- 解冻热灭活人血清来自两个不同的捐助者。 AB捐助者最好的，但任何可以使用，如果寄生虫生长在O型红细胞（RBC）。反转管混合。如果血清含有的颗粒物质或较厚自旋在2,000rpm，然后用0.45微米的过滤器单元进行过滤的液体部分。
- 使用0.2微米的过滤器单元过滤器180毫升的RPMI-0，20毫升的人血清（从每个供体10毫升），0.5毫升10毫克/毫升庆大霉素。
注意：人血清会堵塞过滤器，以便一个以上的过滤器单元，可能需要。 - 标记介质瓶用RPMI-A中，日期，和血清的来源。冷藏备用。冷藏时RPMI-A可能会变成浑浊。这是正常的，但云量增加是污染的迹象。
注：寄生虫的生长可能会在不同的供体血清而有所不同。这是在使用之前测试所有的人血清批次良好的寄生虫的生长是一个好主意。
2.准备人红细胞寄生虫文化
注：献血者应该是O型。
- 收集7-10毫升血液进入酸CIT率 - 葡萄糖（ACD）管中。写捐赠者的ID和收集日期的标签。
- 直到需要血液储存在摄氏 4度。使用血液寄生虫培养1个月内。
- 擦拭用70％乙醇的管的顶部。小心取出瓶塞并丢弃。传输血液入15ml管中。自旋为3分钟，在1000×g下。吸除去血浆。
- 暂停红细胞与温暖的RPMI-0等体积。自旋5分钟，在1000×g下。吸取出白膜层，悬浮在5毫升RPMI-0，重复洗2次以上。
- 除去上清液，并添加足够的RPMI-A以产生混合物，其是50％的RBC（体积）。
- 储存在摄氏 4度，直到需要。
3.维护寄生虫文化
- 前期预热RPMI-A到37℃。
- 放置解冻寄生虫（见MR4协议解冻过程）转换成T25烧瓶用5ml RPMI-A和75微升洗涤人RBC为〜3％血细胞比容。注意：血细胞比容测定红细胞的体积相比，总体积。计算血细胞比容测量填充红细胞到培养基加上红细胞的总体积的体积。假设解冻寄生虫将推动75微升红细胞。通过加入红细胞库存150微升（相当于加入75微升填充红细胞）向烧瓶共有150微升RBC入5毫升培养基，它等于3％150微升/ 5000血细胞比容（是微升×100（％）= 3％）。
- 气的烧瓶中，持续30秒与寄生虫气体混合物（1％O 2，3％的CO 2，平衡N 2）。密封和向下放置烧瓶宽的部分，在37℃培养箱，以允许为最大的表面积为气体交换。
- 要改变中，检查原虫（需要每天做的），小心地将瓶中，以不打扰RBC层。使用无菌拔出巴斯德吸管抽出培养基不影响血液层。
- 要检查PArasitemia，从血液中去除层10微升样品，将其放置在载玻片上，并使用第二载玻片创建一个薄血膜。允许滑动晾干。
- 放置4毫升新鲜的RPMI-A到烧瓶中，轻轻地混合，气体30秒，并将其放置在培养箱中在37℃。
- 染色根据制造商的协议使用Hema3染色试剂盒的幻灯片。
- 为了达到最佳的染色，浸渍在滑动定影液10秒，溶液I，10秒，和溶液II为30秒。在水冲洗和离开载片干燥。
- 通过计数PfRBC的数目计算寄生虫血症（染色深紫色）对红细胞（染色粉红色）的总数。算共有300细胞以确保准确性。
- 当寄生虫已经达到了5％的原虫，扩大文化到T75烧瓶，用40毫升RPMI-A和500微升红细胞。
4.寄生虫同步
注：t前一天他尝试通过与丙氨酸处理同步寄生虫文化。只有环阶段寄生虫和未受感染的红细胞将在本治疗。丙氨酸同步会给你一个纯粹的滋养体的文化，可以在共培养实验中使用的第二天。请务必先从含有大多数的环阶段寄生虫寄生文化。
- 通过混合8.01克丙氨酸（300毫摩尔）和0.365克三（10毫米）的入300ml双蒸2 O的制备丙氨酸溶液把pH值至7.4。过滤消毒使用0.2微米的过滤器单元。
- 前期预热丙氨酸解至37℃。
- 降速寄生虫文化（5分钟×1,000 XG），并删除网上平台。
- 19卷丙氨酸解悬浮颗粒（1毫升包装红细胞至19 ml丙氨酸解）。孵育15分钟，在RT。
- 旋转5分钟×1,000×g的。吸去上清液。在RPMI-0一次清洗。吸上清，重悬在RPMI-A和红细胞压积调整至约3％。 G作为瓶中，回归到37℃。
注意：对于共培养实验，需要5％滋养体最小原虫，用10％的寄生虫血症认为是最优的。
5，寄生虫和RBC准备共培养实验
- 使用每个PBMC 3 PfRBC的共培养实验的比率以诱导炎症反应。计算总PfRBC，通过使薄的血涂片如3.5中所述，和血细胞比容通过使用血细胞计数器计数寄生虫培养的红细胞的数目每ml量化寄生虫血症。
PfRBC =％原虫数×总RBC /毫升×毫升文化。例如：在10×10 6的RBC / ml和10％的寄生虫血症10毫升培养物是等于0.1×10 6 /毫升×10毫升= 10×10 6 PfRBC。 - 旋转5分钟寄生虫文化在1000 XG（RT）。吸出培养基，并以每毫升6×10 6 PfRBC在RPMI-S +（500毫升的RPMI-1640悬浮补充有L-谷氨酰胺和HEPES，10％热灭活的FBS，1.5 ml庆大霉素，5毫升的100mM丙酮酸钠，5毫升10毫MEM非必需氨基酸，加入5ml的5mMβ巯基乙醇的）。
- 采取控制血压（未感染RBC从用于维护寄生虫文化同一供体），计算出每毫升相同数量的红细胞的寄生虫文化红细胞压积，重悬在RPMI-S +。
6.分离人外周血单个核细胞（PBMC）
- 收集来自慢性HIV（+）供体和艾滋病病毒的肝素钠管静脉血（绿顶）（ - ）的控制。不使用EDTA作为抗凝血剂如EDTA的钙螯合作用影响细胞功能。平均预期每10毫升血液之间5-10×10 6个PBMC。对于一个典型的实验收集30毫升的血液从每个捐赠者。血容量将需要根据实验要求调整。
- 尽快绝对内收集血液一小时，取出的血液从管和地方变成塑料50ml管中。特别是单核细胞将被激活，并坚持玻璃，所以重要的是，如果玻璃血液收集管用于细胞被尽可能快地除去。
- 旋血液在1000×g离心15分钟，并收集血浆（这可用于（如果需要）其它研究 - 如果不是这个步骤可以被跳过）。稀释血液中的冷DPBS等体积。
- 放置15个ml的RT聚蔗糖的到50毫升管中。慢慢地，用无菌塑料移液管，层血液/ DPBS溶液在聚蔗糖，没有任何混合。最多25毫升血液/ DPBS解决方案可分层置于每个15毫升聚蔗糖的。
- 旋梯度在室温30分钟，在600×g下。确保“不刹车”设置为开。
- 一旦细胞纺丝，寻找两相之间的界面。这正是PBMC是。使用无菌塑料移液管从界面收集外周血单个核细胞（见图1）。受红细胞减少污染。
- 将收集到的细胞在50毫升管，没有每管不少于20毫升。顶管可达50毫升无菌冷DPBS。
- 旋转细胞10分钟，在300×G 4 摄氏度 。
- 弃上清，重悬沉淀在5毫升无菌冷DPBS，集中来自同一供体的所有单元格成一管。补足至50ml无菌DPBS，并重复洗涤步骤2次以上。
- 悬浮细胞在10ml的RPMI-S +介质。
- 删除20微升等份，并与20微升台盼蓝的混合。移取10微升的血球计数和活细胞（即未采取了蓝染的细胞 - 所有的蓝色细胞都死了）。使用血细胞计数器来计算在溶液中细胞数量如下。
注：血细胞计数有规定的尺寸，使覆盖的行区域被称为一格。- 确保血细胞计数板是干净的。将盖玻片在countiNG区域。负载10微升细胞溶液通过将移液管尖成V形井之一。盖玻片下的面积将通过毛细作用填充。
- 放置装入血球计在显微镜下。该血球的满格包含1毫米2各9个方格。计算每个大型广场内的所有小区。如果有太多的细胞存在，稀释液进一步各显神通。
- 计算细胞浓度如下：总细胞/ ml =（正方形的总细胞计数/＃）×稀释系数x万个细胞/ ml，20×10000个细胞/毫升= 20，例如，（500个细胞/ 5正方形）×稀释因子×10 6细胞总数。
- 调整培养基至10×10 6每毫升（RPMI-S +培养基）的最终浓度。
7.疟疾/ HIV合并感染文化
- 板100微升分离的PBMC和400微升的RPMI-S +培养基到24孔板（每孔1×10 6个PBMC）。保障这口井都设置了一式三份：3井未受感染的红细胞，3井PfRBC，3口井中，3口井PMA /离子霉素。这既是对HIV（+）和HIV（ - ）样本。
- 对于PfRBC井，将3×10 6 PfRBC在每个孔（500微升寄生虫文化在5.2制备的）。
- 对于未感染的红细胞的孔，将500微升在每个孔中制备5.3未感染的红细胞培养物。
- 为介质的井，将500微升的RPMI-S +培养基在每个孔中。
- 对于PMA /离子霉素井，准备PMA /离子霉素溶液（2.5微克/毫升，250微克/毫升分别）。放置将500μl此溶液在各孔中。
注意：作为T细胞的细胞因子分泌有效刺激物，PMA和离子霉素用作阳性对照，以确保细胞是功能性。 - 将板在37℃，5％ 二氧化碳培养箱。
- 可选：使用过量的细胞表型分析，使用流式细胞仪或存储在RN对于未来的mRNA表达分析的稳定的解决方案。
8.疟疾的免疫反应检测
注意：执行共培养实验，只要4天。在此期间，则无需更换培养基。的最佳时间点，将取决于所感兴趣的细胞类型和问的问题。 12-48小时的潜伏期是最佳的单核细胞反应PfRBCs，而淋巴细胞反应均在72-96小时最佳观测。的时间点需要根据实验问题进行优化。较短（2-4小时），可以使用如果完好PfRBC和PBMC中的相互作用是感兴趣。
- 喷丝板在300×g离心3分钟以沉淀细胞。收集700μl的培养物上清液从每孔中。
- 旋转上清在1000 XG 5分钟，以清除任何杂物。
- 等分澄清的上清液按需要，标签，并冷冻在-20℃以下，直至分泌因子分析是成为PERFORmed指。
- 通过ELISA或珠阵列（按照制造商的建议方案）分析细胞因子/趋化因子的响应。
- 收集残留在板成RNA稳定溶液的细胞和通过定量实时PCR 14-16利用用于mRNA表达分析。
9.细胞内流式细胞特定小区Ccytokine响应使用外周血单个核细胞共培养P.恶性疟原虫感染的红细胞
注意：如上所述共培养的长度将依赖于感兴趣的细胞类型。如果有兴趣的单核细胞反应PfRBC更短的潜伏期是必要的。时间将更长先天淋巴细胞应答γδT细胞，NK细胞，NKT细胞），和较长的仍然为CD4和CD8 T细胞。优化是必需的。
- 6-8小时，在分析之前加入1微升的1000倍布雷菲德菌素A到所有的孔中。返回板块37℃培养箱。经过6-8小时incub通货膨胀，放置板置于冰上15分钟。
- 删除使用轰轰烈烈的移液从孔中的细胞，并将它们放置标记microcentifuge管。刮可能需要以除去单核细胞。
- 自旋细胞5分钟以1000×克。除去上清液。悬浮细胞在500μl流式细胞仪缓冲液（1×DPBS，2％热灭活的FBS，0.02％叠氮化钠）。
- 除法细胞上，使得每个样品具有：一管对全抗体染色（240μL），和一个管荧光灯减一（FMO）对照抗体染色（240μL）。游泳池的少量每个样品（20微升）的未染色的流式细胞仪控制（这将在流式细胞仪设置流量使用）的。
- 自旋细胞5分钟，在500×g下。除去上清液。
- 孵育在50μl流式细胞仪缓冲液15分钟，细胞未缀合的抗人CD16 / CD32（5微克/毫升） 在 4℃阻断Fc受体。
- 加入1毫升流式细胞仪缓冲液中向每个管。自旋CELLS 5分钟在500×g。除去上清液。
- 悬浮细胞在50μl流式细胞仪缓冲液中的荧光团共轭抗体所需的细胞表面标志物的预滴定浓度。被染色所有样品预混足够抗体溶液。孵育细胞在4℃下 20分钟。从light.Note保护：各抗体的量将必须被优化。我们经常染色的CD56，CD3，γδ，CD4，CD8，CD14。滴定体积为这些抗体示于表1。
- 加入1毫升流式细胞仪缓冲液中向每个管。自旋细胞5分钟，在500×g下。除去上清液。
- 加入100微升cytofix / cytoperm解决方案，以每管。在4℃孵育细胞20分钟避光。
- 加入1毫升的渗透/洗涤缓冲液（提供高达10倍的浓缩-稀释使用DDH 2 O的1倍），以每管。自旋细胞5分钟，在500×g下。除去上清液。
- 加入100μ升烫发/洗缓冲FMO对照抗体染色管和混合重悬细胞。
- 加入100微升的渗透/洗涤缓冲液中的荧光团共轭抗体所需的细胞内标记物（即，细胞因子/趋化因子），以完全抗体染色管的预滴定浓度。
注：各抗体的量将必须被优化。我们经常染色用抗TNF和抗IFNγ抗体。滴定体积为这些抗体示于表1。 - 育所有试管30分钟，在4℃。避光。
- 加入1毫升的渗透/洗涤缓冲液到每个管中。自旋细胞5分钟，在500×g下。除去上清液。
- 悬浮细胞在300微升流式细胞仪缓冲液用1％多聚甲醛。让我们坐了至少15分钟，以中和HIV。
- 准备使用补偿珠，以用于补偿建立在流式细胞仪单一抗体染色的样品。补偿的类型珠将取决于使用的抗体（即，抗小鼠Ig，抗大鼠/仓鼠Ig）的。涡珠。加入一滴每抗体珠。添加抗体等量作为用于染色。加入200μl流式细胞术缓冲区。这些都是现在可以使用。没有必要以洗涤珠。
- 采集样本的流动，尽快仪和在24小时内获得最佳效果。串联染料易于分解与存储，所以我们建议立即采集如果可能的话。
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Representative Results
该图描绘了IFNγ的产生由NKT细胞（图2）的水平，使用CD56 + CD3 +γδ-门以获得NKT细胞群（数据未显示）。将细胞培养72小时之前，染色。一旦沾上，被收购的流量100000 CD3 +细胞计数仪获得NK，NKT和γδ细胞（感兴趣的细胞）足够大的人群。最低5600 NKT细胞都显示每个图上。以相同的方式，获得TNF产生（数据未显示）。该图清楚地表明，IFNγ的产生是在细胞下的HIV（+）相比，艾滋病人（ - ）暴露于PfRBC个人。
流式细胞仪分析是非常主观的。因此，必须将所有的每个实验的适当的控制（ 参见图2）。背景水平使用FMO样品，其允许细胞因子染色的真实再现计算的。细胞用PMA /伊屋诺霉素刺激的被用作阳性对照（数据未显示）。 PMA和离子霉素是T细胞因子产生强烈的刺激。缺乏IFNγ的产生，这些样品中最有可能表明有染色协议的问题。然而，其他变量如细胞活力或无活性的试剂也可能发生故障。
图1.描写的聚蔗糖梯度后旋展示外周血单个核细胞的位置。
图2.干扰素γ的产生由天然杀伤T细胞。该流程图通过门控CD56 + CD3 +γδ-细胞（最低5600事件）获得。 IFNγ的产生是可检测到艾滋病毒（ - ）与刺激的样品恶性疟原虫感染的红细胞。这种细胞因子的反应不再是明显的慢性感染艾滋病毒的情况下， 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
我们的协议进行了优化，以最真实地研究艾滋病疟疾双重感染体外 。首先，新鲜的人红细胞和血清所需疟原虫培养。这是至关重要的，以获得疟原虫的健康人群。寄生虫溶胞产物不能被取代的活寄生虫如细胞因子的产生是更快速和强烈的使用活P.时疟原虫感染的红细胞（PfRBC）17,18。此外，活化像NK细胞的细胞类型，需要整个PfRBCs，并且不与寄生虫溶胞产物有效地工作。这可能是由于需要对PfRBC和白细胞之间的直接接触或可能是由于与细胞表面受体相互作用18寄生虫衍生的配体的不稳定性质。疟疾PfRBC培养物也必须被很好地同步在实验前（协议4）。同步PfRBCs改善的实验数据的再现性。虽然这个协议去学家使用滋养体阶段PfRBC对于共培养，它可以很容易地进行修改的环阶段PfRBC研究。
人类白细胞可以人为艾滋病病毒感染者，而且这种方法在疟疾HIV双重感染的研究20的研究中使用。然而，这并不模拟免疫失调而导致的慢性HIV感染。在此共培养体系，我们用外周血单个核细胞从慢性感染了HIV-1人参与隔离。当需要一个研究的参与者，它要慎重选择这一人群是非常重要的。入选和排除标准是至关重要的，以确保最小的可变性，再现性。我们的标准包括慢性感染艾滋病毒的明确定义（艾滋病毒感染> 1年，与CD4 + T细胞计数> 50 个 / mm3 /年的下降）和任何人有并发感染的排除。这确保了获得的结果可以归因所以雷利到慢性HIV感染的效果，而不是其他感染。此外，由于我们对疟疾有兴趣的先天免疫反应，我们排除了捐助者有先前的疟疾感染。
未感染HIV的控制也用于每个HIV（+）供体，在每个采样时间点，以允许数据正常化。试图提出，要配合控制各自的HIV（+）供体至少年龄，但最好也性行为（虽然我们在以前的研究中12，我们没有观察到细胞亚群或女性和男性之间的细胞因子反应一个显著差异HIV-未感染的人参加）。如果未来的采样计划保持相同的未感染HIV的控制，每个取样时间点是有益的。响应可以从实验变化进行实验，由于多种因素，包括PfRBCs的健康，它们的同步，原虫水平和PfRBCs的成熟阶段的程度，和血细胞比容水平。关照必须注意保持尽可能多的实验之间的这些一致的。归到未感染HIV的控制允许一些会计处理这些变量。
使用新鲜细胞是最重要的，以避免人为的结果。冷冻和解冻的样品可以具有对细胞活力21,22一个显著影响，细胞因子的产生23-26和细胞表面标记物表型的27。
如果单核细胞是特别令人感兴趣的，但重要的是在协议过程中不使用玻璃。单核细胞坚持以玻璃和许多其他塑料28。我们用聚丙烯塑料移液管，移液管和管贯穿始终，从我们的研究的细胞群减少单核细胞粘附和最终去除。
当设置仪检测的流动，抗体的任意组合可以根据感兴趣的细胞中使用。我们在IFNγ和TNF生产特别感兴趣从NK细胞，NKT细胞和γδT细胞。这定义了我们的抗体面板。然而，如果使用不同的组合，其最优化抗体的量为每个面板是重要的。这是至关重要的，以避免错误的数据。此外，为了避免变性和确保有效性，FMOs需要评估背景细胞因子水平为每个条件（RBC，PfRBC，介质，和PMA /离子霉素）和参与者人口（HIV（ - ）和HIV（+）， 图2）。 体外细胞内细胞因子生产的测量通常会导致高背景水平，特别是当细胞已被染色前培养。由于培养条件影响的背景水平，适当FMOs确保各样品的背景水平的知识。我司供应的细胞是有限的，因此我们在设计FMOs包含所有表面的污渍，但没有细胞内的污渍。这允许对细胞因子的背景水平上研究的所有不同的细胞类型的具体的比较。我们也跑每个实验单一色斑的每个的表面标志物，以确认其背景水平。
描述的协议是一种多用途的，它可以用来检查取决于感兴趣的细胞几小时或几天内的反应。用于从先天淋巴细胞最佳PfRBC诱导的细胞因子的生产，我们测量后2或3天流式细胞仪输出。当看单核细胞，较早的时间点（1或2天），建议。该系统允许多种细胞类型和细胞对由流进行区分术，分泌应答中细胞上清液来测量，并表达谱中提取的RNA进行评估。另外，使用抗体阻断特异性受体或中和细胞因子可以在本系统中，以进一步解剖机制被利用。我们已经成功地使用IL-18受体阻滞牵连IL-18受体PfRBC诱发IFNγ反应12。该系统是一个现实主义者IC采用何种方法来评估一些先天免疫反应对疟疾的感染艾滋病毒的情况下。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alanine | Sigma | A7377 | |
| antibodies (see other table) | |||
| BD Cytofix/Cytoperm with BD GolgiPlug | BD | 555028 | includes brefeldin A, cytofix/cytoperm buffer and perm/wash buffer |
| BD Vacutainer ACD Solution A | BD | 364506 | |
| BD Vacutainer Sodium Heparin | BD | 17-1440-02 | |
| DPBS (no calcium, no magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F1051 | heat inactivate before use |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| gentamycin (10 mg/ml) | Gibco | 15710-064 | |
| Hema3 Staining Set | Fisher | 122-911 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| Ionomycin | Sigma | I3909 | |
| MEM non-essential amino acids (10 mM) | Gibco | 11140 | |
| PMA | Sigma | P8139 | |
| RPMI-1640 powder | Life-Technologies | 31800-022 | |
| RPMI-1640 with L-glutamine and HEPES | Thermo Scientific | SH30255.01 | |
| sodium bicarbonate (powder, cell culture) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360 | |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T6066 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| Trypan Blue (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| BD CompBead | BD | 552843, 552845 | depends on antibodies used |
| Parasite Gas Mixture | By special order | 3% CO2, 1% O2, balance N2 | |
| Equipment | |||
| 0.2 μm filter unit | |||
| Glass slides | |||
| T25 flasks | |||
| T75 flasks | |||
| 50 ml tubes | |||
| 24 well culture plates | |||
| unplugged Pasteur pipettes | |||
| plugged Pasteur pipettes | |||
| sterile transfer pipettes | |||
| hemocytometer | |||
| flow cytometer (3 laser) | |||
| Antibodies used for flow cytometry | |||
| Anti-TNF | eBiosciences | 551487 | FITC (fluorophore) 2 μl |
| Anti-IFNγ | Biolegend | 506507 | PE (fluorophore) 20 μl |
| Anti-CD8 | Biolegend | 300914 | PE-Cy7 (fluorophore) 1 μl |
| Anti-CD14 | Biolegend; BD Biosciences | 325624; 551487 | Biotin (fluorophore) 0.5 μl Streptavin PE-TR (fluorophore) 0.1 μl |
| Anti-CD56 | Biolegend | 318322 | PerCP/Cy5.5 (fluorophore) 5 μl |
| Anti-γδ | Biolegend | 331212 | APC (fluorophore) 5 μl |
| Anti-CD3 | Biolegend | 300426 | APC-Cy7 (fluorophore) 5 μl |
| Anti-CD4 | Biolegend | 317424 | Pacific Blue (fluorophore) 1 μl |
References
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- French, N., et al. Increasing rates of malarial fever with deteriorating immune status in HIV-1-infected Ugandan adults. AIDS (London, England). 15 (7), 899-906 (2001).
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