Protocol
1. إعداد حلول متضاعف الكتروليتي
- تنقية الشيتوزان، كما هو مفصل في لياو وآخرون لفترة وجيزة، وخلق 1٪ (ث / ت) حل الشيتوزان في 2٪ (ت / ت) وحامض الخليك وفراغ مرشح يستخدم الصف 93 ورقة الترشيح. تحييد الترشيح باستخدام 5M هيدروكسيد الصوديوم حتى استقرت درجة الحموضة إلى 7. الطرد المركزي الشيتوزان عجلت في 1200 x ج لمدة 10 دقيقة. صب طاف وإضافة الماء منزوع الأيونات لغسل الشيتوزان. كرر الخطوة الطرد المركزي وغسل مرتين أخريين. تجميد الشيتوزان عجلت في -80 ° C ويجفد O / N للحصول على شكل منقى. تخزين الشيتوزان النقي في خزانة جفف.
- تزن من 1 غرام من الشيتوزان تنقيته في طبق نسيج الثقافة العقيمة. وضع الشيتوزان في صحن زراعة الأنسجة في أقرب وقت ممكن إلى مصباح الأشعة فوق البنفسجية في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية وفضح لضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة. باستخدام ملقط معقم، ضع الشيتوزان تعقيمها في وعاء زجاجي. حل الشيتوزان باستخدام تصفية 0.15M حامض الخليك إلى التركيز النهائي بين 0.5٪ و 1٪ (ث / ت).
- تزن من 0،1 غرام من ملح الصوديوم حمض الألجنيك وتذوب في 10 مل المقطر منزوع الأيونات (DDI) الماء للحصول على 1٪ (ث / ت) حل. خلط الألجنيك ملح الصوديوم حمض لا يقل عن 2 ساعة على خلاط دوامة لضمان حل كامل. تصفية الحل الجينات من خلال 0.2 ميكرون فلتر حقنة. تخزين حل الجينات في 4 ° C.
- إعادة تشكيل عوامل النمو المؤتلف الإنسان مثل الأوعية الدموية (عامل نمو بطانة VEGF) أو بيتا - عامل نمو الأعصاب (NGF)، على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة.
2. رسم من ألياف IPC
- مزيج البروتينات وعوامل النمو أو الجزيئات الحيوية الأخرى في 10-20 ميكرولتر قسامة من الحل متضاعف الكتروليتي له تهمة صافي مماثل. الجزيئات البيولوجية مع صافي شحنة سالبة (مثل الأبقار مصل الزلال [BSA]) ينبغي أن تكون مختلطة مع حل الجينات. الجزيئات البيولوجية مع صافي شحنة موجبة (مثل VEGF) ينبغي أن تكون مختلطة معحل الشيتوزان.
- وضع قسامات صغيرة (10-20 ميكرولتر) من الشيتوزان والجينات على سطح مستو مستقر التي يتم تغطيتها مع parafilm. يجب وضع قطرات من الشيتوزان والجينات على مقربة ولكن ليس على اتصال مع بعضها البعض.
- بخفة تراجع كل طرف على زوج من الملقط في الشيتوزان والجينات قطرات. جعل قطرات من polyelectrolytes معا عن طريق معسر ملقط. عندما تأتي قطرات في اتصال مع بعضها البعض، وسحب ببطء ملقط عموديا إلى أعلى لرسم الألياف IPC من واجهة من قطرات اثنين (الشكل 1A).
- وضع بعناية نهاية الألياف IPC المرسومة على ملقط على الجمع، مثل سقالة البوليمرية مسطحة الملصقة على مغزل الدورية (انظر القسم 3 و 4). تدوير مغزل بسرعة ثابتة من 10 ملم / ثانية للسماح بتشكيل موحدة وbeadless الألياف IPC. زيادة سرعة رسم الألياف IPC سيشكل الخرز، والتي سوف تتسبب في إطلاق موجة من إدراجهاالكيمياء الحيوية وسابق لأوانه إنهاء الألياف. 10
- لتحديد كفاءة التأسيس، وجمع كل السوائل المتبقية تركت على parafilm عن طريق تمييع مع 500 ميكرولتر من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). قياس البروتين أو نمو المحتوى عامل في بقايا من خلال فحص BCA (لBSA)، ELISA (لVEGF وNGF) أو فحص المناسب للكشف عن جزيء حيوي يدمج.
3. تصنيع المركب هيدروجيل سقالة من Pullulan-ديكستران (PD) السكاريد وألياف IPC
- افتعال إطار pullulan الأضاحي لIPC جمع الألياف
- تزن من السكاريد pullulan وتخلط مع منزوع الأيونات المقطر (DDI) الماء لخلق 20٪ (وزن / حجم) محلول مائي. مزيج الحل pullulan O / N لضمان التجانس.
- يلقي 15 غرام من حل pullulan إلى 10 سم زراعة الأنسجة قطر البوليسترين (برنامج التعاون الفني) الطبق. تجفيف حل pullulan O / N عند 37 درجة مئوية. قطع الأفلام pullulan إلى 7مم × 7 ملم إطارات مربع.
- إعداد الحل السكاريد-pullulan ديكستران
- إنشاء 30٪ (ث / ت) حل من السكريات pullulan وديكستران (3: 1 نسبة) في المياه DDI. مزيج O / N لضمان تجانس الحل السكاريد. إضافة ببطء في بيكربونات الصوديوم إلى حل السكاريد لتحقيق تركيز النهائي من 20٪ (ث / ت). مزيج O / N لضمان تجانس الحل. تخزين حل السكاريد في 4 ° C.
- جمع الألياف IPC في إطار pullulan
- يضعوا إطار pullulan الأضاحي (القسم 3.1) باستخدام مشبك التمساح. عصا مقطع التمساح والإطار pullulan في نهاية مغزل الدورية باستخدام الشريط المغلفة بلاستيكية لاصقة. تدوير مغزل مع الإطار اضافته بسرعة ثابتة من 10 ملم / ثانية. يمكن اضافته إطار pullulan على مغزل الدورية في التوجهات المطلوبة.
- رسم الألياف IPC باستخدام زوج من ملقط (القسم 1) واتاكح نهاية استخلاصها من الألياف IPC على الإطار pullulan الدورية. رسم الألياف IPC بسرعة ثابتة. عند الوصول إلى نهاية طرفية من الألياف IPC، تجفيف بناء O الألياف على الإطار / N في RT.
- دمج الألياف IPC إلى PD هيدروجيل سقالة
- لتشعبي كل غرام من حل pullulan ديكستران، إضافة 100 ميكرولتر من 11٪ (ث / ت) الصوديوم trimetaphosphate محلول مائي وهيدروكسيد الصوديوم 100 ميكرولتر 10M 7 مزيج الحل في 60 دورة في الدقيقة باستخدام stirplate عن 1-2 دقائق. بعد إضافة trimetaphosphate الصوديوم وهيدروكسيد الصوديوم، فإن الحل السكاريد تشعبي على الفور تقريبا. من أجل حل السكاريد لزج على بناء الألياف على الإطار إلى تضمين بالكامل الألياف IPC. احتضان الألياف pullulan-ديكستران-IPC مجتمعة (PD-IPC) عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتشكيل السقالات مركب crosslinked كيميائيا (الشكل 1B).
- تنبيه: تنفيذ الخطوة 3.3.2 في غطاء الدخان واستخدام متساو واقية السليمpment باسم حمض الخليك هو تآكل وقابل للاشتعال.
- للحث على تشكيل مسام في سقالة PD-IPC، غمر سقالة كاملة في 20٪ (ث / ت) وحامض الخليك لمدة 20 دقيقة.
- إزالة الكواشف غير المتفاعل عن طريق الغسيل-PD IPC السقالات في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق في حين تهتز في 100 دورة في الدقيقة. كرر هذه الخطوة 2 مرات.
- إزالة PBS الزائدة وتجميد فورا السقالات-PD IPC في -80 درجة CO / N. يجفد السقالات لا يقل عن 24 ساعة قبل الاستخدام في أي إصدار أو النشاط الحيوي المقايسات التي تسيطر عليها.
4. تصنيع المركب سقالة من PCL وألياف IPC
تنبيه: ثنائي كلورو ميثان هو مادة خطرة. استخدام غطاء الدخان ومعدات الوقاية الشخصية عند التعامل مع ثنائي كلورو ميثان.
- خلق البكر ونمط PDMS ركائز
- إنشاء polydimethylsiloxane البكر (PDMS) الركيزة المرنة باستخدام قطعة من برامج التعاون الفني من البعد المطلوب باستخدام عملية الطباعة الحجرية الناعمة. إنشاء pattePDMS rned ركائز باستخدام أساليب الطباعة الحجرية الناعمة القياسية على بولي (ميتاكريليت الميثيل) قوالب مع التضاريس المطلوب. 12
- افتعال الأضاحي إطار PCL لIPC جمع الألياف
- تزن خارج PCL وتذوب في ثنائي كلورو ميثان لخلق 0.9٪ (ث / ت) حل. لكل 1 سم 2 مساحة الركيزة PDMS، إسقاط 500 ميكرولتر من 0.9٪ محلول PCL. السماح لجميع من المذيب ثنائي كلورو ميثان لتتبخر تماما في غطاء الدخان. تكرار عملية صب 0.9٪ PCL لرشاقته الفيلم للسمك المطلوب. إزالة الفيلم PCL المجففة من الركيزة PDMS. خلق ثقب في الإطار PCL باستخدام الناخس مناسبة الحجم. 2
- جمع الألياف IPC على الإطار PCL
- يضعوا إطار PCL الأضاحي مع فتحة (من 4.2.1) على مقطع التمساح. عصا مقطع التمساح على مغزل الدورية باستخدام الشريط المغلفة بلاستيكية لاصقة. نعلق نهاية استخلاصها من الألياف IPC على فرام PCLه قبل بدء الدوران بسرعة ثابتة من 10MM / ثانية (القسم 2). بعد نهاية الألياف IPC الرسم، تجفيف الألياف على الإطار بناء O / N عند 4 درجات مئوية.
- دمج الألياف على الإطار بناء إلى الركيزة PCL منقوشة
- إسقاط 500 ميكرولتر من 0.9٪ محلول PCL على الركيزة PDMS لإنشاء قاعدة البكر PCL أو منقوشة، كما هو مطلوب. يلقي طبقات متعددة من 0.9٪ محلول PCL للحصول على سقالة مع سمك المطلوب. السماح لجميع من المذيب ثنائي كلورو ميثان لتتبخر تماما في غطاء الدخان.
- وضع بناء الألياف على الإطار (القسم 4.3.1) على رأس القاعدة PCL. إضافة 0.9٪ محلول PCL على الألياف في إطار بناء عدة مرات للحصول على سمك المطلوب وتضمين بالكامل الألياف IPC، افتعال سقالة المركبة PCL-IPC (الشكل 1C).
5. قياس الإفراج عن العوامل البيولوجية من مركب IPC السقالات
- وضع مركب PD-IPC أوالسقالات PCL-IPC وقائمة بذاتها الألياف IPC بشكل منفصل في 24 لوحة جيدا.
- تزج السقالة وقائمة بذاتها الألياف IPC مع 500 ميكرولتر من 1X PBS. احتضان العينات عند 37 ° C. جمع PBS في نقاط زمنية مختلفة (وسائل الإعلام الإفراج) واستبدالها مع 500 ميكرولتر من 1X PBS.
- قياس كمية البروتين أو عامل النمو في وسائل الإعلام الإفراج باستخدام مقايسة BCA (BSA)، ELISA (VEGF وNGF) أو غيرها من الفحص المناسب لحساب الشخصي الإفراج التراكمي لجزيء حيوي يدمج.
6. البذر من الخلايا على مركب IPC السقالات لاختبار النشاط الحيوي للعوامل البيولوجية المفرج عنهم
- تعقيم PD-IPC أو PCL-IPC السقالات المركبة مجفف بالتجميد باستخدام الأشعة فوق البنفسجية في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية لمدة 20 دقيقة على الأقل.
- استخدام تقنيات زراعة الخلايا القياسية للحصول على تعليق خلية من 2 × 10 5 خلايا في 200 سائط النمو ميكرولتر. البذور تعليق خلية مركزة على السقالات المركبة. بعد عملية الشراءص 20 دقيقة، وأعلى ما يصل حجم من وسائط النمو إلى غمر كامل السقالات.
- قياس نشاط الخلايا من خلال تقنيات القياسية مثل الامار الأيض الأزرق فحص النشاط، PC12 ثمرة neurite فحص أو المناعي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه المقالة، سعينا إلى إنشاء السقالات المركبة مع الألياف IPC لالاستمرار في اطلاق سراح العديد من الجزيئات الحيوية. تم العثور على خصائص الجزيئات الحيوية المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول 1. كان جزءا لا يتجزأ من الألياف IPC أولا إلى PD هيدروجيل ماء لإنشاء سقالة المركبة PD-IPC (الشكل 1B). تم اختبار النموذج جزيء BSA أولا لتحديد مدى جدوى استخدام سقالة المركبة لإطلاق جزيء حيوي للرقابة. تأسست BSA إلى السقالات PD-IPC مع كفاءة 45 ± 0.97٪. أظهر BSA صدر من PD-IPD حركية شبه الخطية مع إطلاق انفجار مخفف الأولي تليها حالة مستقرة يصاحب ذلك (الشكل 2). بعد 2 أشهر، حقق BSA لإجمالي الانبعاثات من 97٪. في المقابل، أظهرت الألياف IPC بذاتها والإفراج السريع عن 80٪ من BSA ضمن 4 ساعة.
المقبل، ونحن فحص ملف الافراج عن والنشاط الحيوي للVEGF باستخدام PD-IPC scaffoلدس. تأسست VEGF مع كفاءة 75.5 ± 2.7٪، وأظهر بيان المستدام لا يقل عن 1 أسبوع (الشكل 3A). وكانت المصنفة الخلايا البطانية الوريد السري الإنسان (HUVECs) على السقالات-PD IPC لتحديد النشاط الحيوي من VEGF. أظهر HUVECs على السقالات-PD IPC زيادة كبيرة في الامار تخفيض الأزرق والنشاط الأيضي مقارنة مع السقالات PD عادي في يوم 1، مشيرا إلى الحفاظ جيدة وظيفة VEGF بعد إطلاق سراحه من السقالات PD-IPC (الشكل 3B). الامار الحد الأزرق في أيام 3 و 6 و 7 انخفض إلى تحقيق مستويات قابلة للمقارنة مع PD سقالة سهل (الشكل 3B).
تم اختبار السقالات المركبة PCL-IPC أيضا من أجل إطلاق للرقابة ومقارنة مع الألياف IPC بذاتها. أدخلنا NGF كناقل التمثيلي في السقالات المركبة PCL-IPC مع كفاءة إدماج 66.38 ± 2.71٪. PCL-IPC أظهرت السقالات المركبة خطالمطرد الافراج عن العمر وإطلاق التراكمي حوالي 80٪ بعد 18 يوما (الشكل 4A). من ناحية أخرى، IPC قائمة بذاتها أظهر الألياف بيان انفجار 70٪ في غضون 24 ساعة تليها معدل إطلاق الراكدة. باستخدام PC12 ثمرة neurite الفحص، درسنا النشاط الحيوي للNGF صدر (الشكل 4B). أظهرت ثمرة neurite الخلايا PC12 نمت على PCL-IPC سقالة المركبة وسائل الاعلام الإفراج مستويات مماثلة مع خلايا PC12 المستزرعة في 30 نانوغرام / مل NGF تستكمل وسائل الاعلام. هذا يدل على أن NGF صدر بقي النشطة بيولوجيا لمدة 7 أيام على الأقل.
مزيج من التضاريس وأصيب عامل النمو التسليم قد تحاكي المكروية الخلوية بشكل أفضل. منهجية متعددة الجوانب من PCL-IPC تلفيق سمحت تلفيق من biochemically- وسقالة المركبة التي تسيطر عليها الطوبوغرافي. نحن ملفقة سقالة المركبة PCL-IPC مع نانو الحجم حواجز شبكية هيكل (NP-PCL-IPC سقالة). لاحظنا EF التآزراملنخفسة من تضاريس ومستمرة الافراج عن NGF من خلال تقييم تمايز الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية الوسيطة (hMSCs) (الشكل 5). وأظهرت hMSCs مثقف على السقالات المركبة NP-PCL-IPC التعبير العالي للأنيبيب المرتبطة بروتين 2 (MAP2)، مما يدل على تمايز الخلايا العصبية. من ناحية أخرى، كان MAP2 تعبير البروتين أقل بكثير في hMSCs مثقف على PCL-IPC مع الافراج عن NGF الوحيد أو PCL نمط (NP-PCL).
الشكل 1. التأسيس من الألياف IPC في السقالات ماء والكارهة للماء. (A) رسم من الألياف IPC في واجهة إيجابيا (الشيتوزان) وسلبا (الجينات) حلول متضاعف الكتروليتي المشحونة. (B) رسم تخطيطي يظهر إدماج الألياف IPC في حل PD ماء لخلق PD-IPC فيوزات البريد سقالة. (C) رسم تخطيطي يظهر إدماج الألياف IPC في مسعور PCL سقالة لخلق PCL-IPC سقالة المركبة. ويتم تكييف هذا الرقم من Cutiongco وآخرون، 2014. 7 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
تأسست الشكل 2. الإفراج التحكم من BSA من PD-IPC سقالة المركبة. BSA إلى PD-IPC السقالات المركبة وتم قياس صدوره في نقاط زمنية مختلفة باستخدام BCA الفحص. وتقدم BSA التراكمي صدر كنسبة مئوية من المبلغ الإجمالي للBSA (في ميكروغرام) تأسست في ألياف IPC وترد متوسط كنسبة مئوية ± الانحراف المعياري. ويتم تكييف هذا الرقم من Cutiongco وآخرون، 2014. 7/www.jove.com/files/ftp_upload/53079/53079fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. التحكم الإصدار والنشاط الحيوي للVEGF من PD-IPC سقالة المركبة. (A) لمحة الإفراج التراكمي للVEGF من PD-IPC السقالات المركبة. وقد تم قياس الإفراج VEGF في نقاط مختلفة الوقت باستخدام ELISA محددة لVEGF. (B) بقاء الخلية من الخلايا البطانية نمت على PD-IPC السقالات المركبة، إذا ما قيست الامار فحص الأيض الأزرق. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام ANOVA في اتجاه واحد مع الاختبار اللاحق-توكي و. * يدل p <0.05. ويتم تكييف هذا الرقم من Cutiongco وآخرون، 2014. 7 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. التحكم الإصدار والنشاط الحيوي من NGF من PCL-IPC سقالة المركبة. (A) لمحة الإفراج التراكمي للNGF من PCL-IPC السقالات المركبة. وقد تم قياس الافراج عن NGF في نقاط مختلفة الوقت باستخدام ELISA محددة لNGF. إدراج تظهر الصورة الإفراج التراكمي لNGF من PCL-IPC سقالة للساعة 8 الأولى. (B) النشاط الحيوي للNGF مقاسا ثمرة من الخلايا العصبية PC12. وقد تم قياس PC12 ثمرة من خلال تحليل الصور. ويتم تكييف هذا الرقم من تيو وآخرون، 2014. 2 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
.JPG "/>
الرقم 5. تمايز hMSC على NP-PCL-IPC سقالة. المسح متحد البؤر صورة مجهرية من hMSC تربيتها على السقالات مركب مختلفة. (A) NP-PCL-IPC، (B) NP-PCL، (C) PCL-IPC، (D) السقالات PCL البكر. وصمة عار الخضراء تدل MAP2، النسب علامة العصبية. بقعة حمراء ترمز F-الأكتين، والتي تبين الهيكل الخلوي الخلوي. الزرقاء وصمة عار يدل على النواة. ويتم تكييف هذا الرقم من تيو وآخرون، 2014. 2 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1. خصائص المواد الكيميائية الحيوية المستخدمة لإطلاق سراح الخاضعة للرقابة من السقالات IPC المركبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تتشكل الألياف IPC بتفاعل اثنين polyelectrolytes اتهم معاكس. عملية تستخدم لاستخراج مجمع من واجهة من polyelectrolytes، وتسهيل عملية التجميع الذاتي لتشكيل الألياف مستقر. آلية تشكيل الألياف IPC يضمن أن أي جزيء حيوي أضاف ضمن يمكن إدراجها في متضاعف الكتروليتي اتهم بالمثل أثناء عملية complexation. 10،11 العكس من ذلك، إضافة جزيء حيوي في متضاعف الكتروليتي اتهم معاكس سوف يؤدي إلى هطول الأمطار لحظية. منهجية تصنيع بسيطة للألياف IPC يضفي براعة في دمج مختلف المواد البيولوجية مثل الخلايا، عوامل النمو والجزيئات الصغيرة. وقد لوحظ هذا سمة أساسية من الألياف IPC أيضا في كل من السقالات PD-IPC وPCL-IPC المركبة، حيث أدرجت عوامل النمو مع مختلف الخصائص الفيزيائية والبيولوجية (الشحن والوزن الجزيئي) بكفاءة عالية. في كونتراالحادي والكفاءة التغليف باستخدام منهجيات microsphere لVEGF وNGF يمكن أن تكون منخفضة مثل 16٪ 6 و 8٪ 13، على التوالي.
كما أثبتت كل من PD-IPC والسقالات PCL-IPC السيطرة الزمنية للإفراج عنهم جزيء حيوي. أظهر VEGF من السقالات PD-IPC إطلاق خطي لمدة 7 أيام على الأقل. في المقابل، ذكرت وأظهرت VEGF ملامح الإفراج عن المجهرية البوليمرية إطلاق انفجار الأولي في غضون 24 ساعة، والإفراج عن 60٪ على الأقل من إجمالي محتوى VEGF. 5،14،15 وبالمثل، فقد تبين NGF انه اصيب عامل النمو تسليم من PCL-IPC السقالات، في حين تشير غيرها من النظم تسليم عامل النمو القائم على البوليمر هضبة الإفراج عن 20 يوما للإفراج عنهم. 13،16 ومن المفترض أن مختلف مكونات السقالات المركبة على حد سواء تساهم في حركية الافراج عن عامل النمو. آليات الاسترخاء البوليمر، المسامية وتعرج يمكن أن تؤثر بشكل كبير على الإفراج عن الجزيئات الحيوية ماء. 17 بالإضافة إلى ذلك، جخصائص hemical من سقالة البوليمرية قد جذب كهرباء والتنافر تجاه عوامل النمو التي تؤثر على الافراج عن جزيء حيوي. وبالتالي، فإن خصائص سقالة البوليمرية حاسمة في تحديد ملامح الإفراج والجزيئات الحيوية مع إطلاق تسيطر مؤقتا. على سبيل المثال، في حين أظهرت سقالة PD بالقرب الخطية الإفراج BSA، سقالة المركبة مماثلة باستخدام بولي (فينيل الكحول) هيدروجيل نفاذية يفتقر إلى BSA 18 السقالات البلاستيكية التي يمكن استخدامها في تركيبة مع الألياف IPC قد تتطلب اختبار أولي لتحديد نفاذية لها نطاق.
بالإضافة إلى الإفراج البيوكيميائية التي تسيطر عليها، والقدرة على الإبقاء على النشاط الحيوي من عوامل النمو هي ميزة مهمة لأي نظام تسليم جزيء حيوي. البيئة القلوية قاسية من الحل PD وجود العضوي DCM المذيبات في PCL لديها القدرة على الحط أي نوع من الجزيئات الحيوية. على سبيل المثال، والتسليم microsphere الصورةأظهر ystem التي تستخدم ثنائي كلورو ميثان وجود اتجاه ثابت تناقص النشاط الحيوي مع زيادة timepoint بسبب تدهور NGF. 16 ومع ذلك، لاحظنا أن النشاط الحيوي من VEGF وNGF والحفاظ عليها، كذلك التأكيد على أن الميزة الأساسية للألياف IPC يتم استيعابها داخل المركبة السقالات.
استخدام الأضاحي، السكاريد حيويا أو الإطار البوليمر التي يمكن إدراجها بسهولة في سقالة السائبة يعطي براعة لإنشاء سقالة المركبة مع الألياف IPC متعددة الانحياز في تكوينات مختلفة. 7 وبالتالي، فمن الضروري أن السقالات البوليمرية ليتم تطبيقها مع الألياف IPC لديها القدرة لمزيد من الاندماج في سقالة السائبة. عملية الاستيعاب مهم في ترسيخ تماما الألياف IPC في سقالة البوليمرية. لاحظنا هذه الظاهرة في pullulan الأضاحي والأطر PCL، والتي كانت على حد سواء حله بسهولة في المذيبات من PD السائبة أوسقالة PCL. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة خطوة واحدة لIPC تصنيع وجزيء حيوي التأسيس يعطي مرونة لعدد من الجزيئات الحيوية التي يمكن أن يتم تسليمها من قبل سقالة مركب واحد. بساطة منهجية كما يسمح صقل كفاءة التأسيس وإطلاق حركية عن طريق تغيير هوية متضاعف الكتروليتي أو التركيز. استخدمت الشيتوزان polyelectrolytes الطبيعية والجينات بسبب ارتفاع كثافة الشحنة والتشابه في مختلف الكربوهيدرات ECM وجدت في الأنسجة الحيوانية. بعد الكولاجين الميثيلي وterpolymer 8،19 أو كيتين والجينات 20 مايو أن تستخدم أيضا لتشكيل الألياف IPC إلى تأثيرات متفاوتة. الألياف IPC متعددة تطلق اشارات كيميائية حيوية مختلفة مع حركية مختلفة يمكن أيضا أن يتحقق لإنشاء مركب سقالة متعددة الوظائف. على سبيل المثال، والبروتينات المصفوفة خارج الخلية مثل فبرونيكتين تحميلها في الألياف IPC قد توفر منبرا للالتصاق الخلايا تسيطر مكانيا. 7 المستدامالافراج عن المضادات الحيوية وعوامل النمو أيضا مرغوب فيه لتطبيقات تجديد الأنسجة. قد يكون هذا ممكنا باستخدام PCL-IPC، والتي يمكن أن تتضمن مسعور، والمخدرات جزيء صغير وماء وعوامل النمو القائم على البروتين في مقصورات مختلفة من سقالة المركبة. 2
كما سمحت منهجيتنا قدم تصنيع سقالة مع كل من العظة الطبوغرافية والكيمياء الحيوية. لاحظنا أن السقالة NP-PCL-IPC كان أعلى تعزيز hMSC التمايز في نسب الخلايا العصبية، مما يعني أن تحاكي جوانب متعددة من مكانة الخلوية الفيزيائية الحيوية والكيميائية الحيوية غير مفيدة في توجيه سلوك الخلية. سهولة منهجية تقديم ترخيص تطبيقه على الأنظمة الأخرى البوليمر patternable مثل بولي أكريلاميد 21 أو البولي ايثيلين جلايكول 22، شريطة أن عملية يشابك لن تؤثر تأثيرا كبيرا على سلامة الألياف IPC. على سبيل المثال، كانت السقالات PD CHاوسين في هذه الدراسة لآليتها يشابك الفريدة التي تحدث في الظروف المحيطة والمائية. 24 وهذا يمكن أن يوفر أكثر من الناحية الفسيولوجية ركائز ذات الصلة في التجارب المختبرية والدراسات المجراة. بالإضافة إلى ذلك، دمج الألياف IPC في سقالة مركب يمكن التغلب على نقص القوة الميكانيكية للألياف IPC 23 عن طريق توفير قوة الشد. في الواقع، تم اختيار PCL 25 للقوة عالية الميكانيكية.
باختصار، وقد وصفت طريقة بسيطة لإنشاء السقالات المركبة لتسليم جزيء حيوي. أثبتنا كيف الألياف IPC يمكن استخدامها لتسليم المستدام من الجزيئات الحيوية دون المساس النشاط الحيوي وكفاءة التأسيس. أظهرنا ذلك من خلال خلق السقالات مركب مع نوعين: PD-IPC والسقالات PCL-IPC. تطبيق الألياف IPC لا يقتصر على التأسيس في PD- والسقالات أساس PCL، ولكن يمكن أن يحتمل تمديد لأنظمة البوليمرية أخرىوتقديم الجزيئات الحيوية الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة البحوث الوطنية في سنغافورة من قبل أحد مراكز البحوث في التميز، ومعهد Mechanobiology، سنغافورة يديرها. ويدعم MFAC وكالة للعلوم والتكنولوجيا والبحوث (سنغافورة) والوكالة الوطنية للبحوث (فرنسا) برنامج مشترك تحت رقم المشروع ويدعم 1122703037. BKKT من قبل معهد Mechanobiology. نشكر السيد دانيال HC ونغ لالمخطوط والسيدة الفجر JH الجدد للمساعدة في إنتاج الفيديو القراءة دليل على ذلك.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pullulan | Hayashibara Inc Okayama Japan | Molecular weight (MW) 200 kDa. This material is pharmaceutical grade pullulan used to make pullulan frames and PD-IPC scaffolds. | |
| Dextran | Sigma Aldrich | D1037 | MW 500 kDa. This material is no longer being produced by Sigma Aldrich. Alternative suggested is catalog number 31392 (Sigma Aldrich). This material is used to make PD-IPC scaffolds. |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | Sodium bicarbonate must be slowly added to the pullulan-dextran polysaccharide solution. Rapid addition of sodium bicarbonate will result in precipitation. |
| Sodium Trimetaphosphate | Sigma Aldrich | T5508 | This chemical is hygroscopic and must be stored in the dehumidifying cabinet. Aqueous solution of sodium trimetaphosphate must always be made fresh. |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | This material is hazardous and must be handled with proper protective equipment such as nitrile gloves. |
| Chitosan | Sigma Aldrich | 448877 | MW 190-310 kDa. Acetylation degree of 75% to 85%. Purification of chitosan is required to create stable IPC fibers. |
| Acetic Acid | Merck | This can be replaced by another brand type. This material is corrosive and flammable. Protective equipment such as face shield, nitrile gloves, lab coat and shoe cover must be worn when handling this chemical in the fume hood. | |
| Alginic acid sodium salt from brown algae, low viscosity | Sigma Aldrich | A2158 | Dissolve in water overnight. Filter through sterile 0.2 µm syringe filter before use. Store at 4 °C. |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent | Dissolve in sterile PBS and filter using 0.2 µm syringe filter before use. | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | This kit was used to measure BSA release from PD-IPC scaffolds. |
| Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor | R&D systems | 293-VE | Dissolve growth factor in 0.2% heparin solution to a final concentration of 5 mg/ml. |
| Heparin Sodium Salt From Porcine | Sigma Aldrich | H3393 | This can be replaced by another brand type. Dissolve heparin salt in sterile water at a final concentration of 1% and filter through 0.2 µm syringe filter before use. |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Lonza | C2517A | This primary cell type was used in the assay to determine VEGF bioactivity after release from PD-IPC scaffolds. |
| Alamar blue | Life Technologies | DAL1025 | This is used to measure cell metabolic activity. Incubate Alamar blue with cells and maintain in standard cell culture conditions for 2 to 4 hours. Measure absorbance at 570 nm to determine Alamar blue percent reduction, which is correlated to the cell activity. |
| ScanVac Coolsafe Lyophilizer | Labogene | 7.001.200.060 | This is a non-programmable freeze dryer that operates at -105 to -110 °C. This can be replaced by other standard lab lyophilizers. |
| Polycaprolactone (PCL) | Sigma Aldrich | 181609 | MW 65 kDa. This is no longer being manufactured by Sigma Aldrich. This can be replaced by Sigma Aldrich catalog number 704105. |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | V800151 | This can be replaced by another brand type. This material is hazardous and must be handled in the fume hood. Protective equipment must be worn at all times when handling this chemical. |
| Polydimethylsiloxane (PDMS; 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow Corning | (240)4019862 | The elastomer kit comes with polymer base and crosslinker. Mixing the polymer base and crosslinker in different ratios will result in different stiffness of the PDMS. |
| Human Recombinant Beta-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D systems | 256-GF | Reconstituted in sterile DI water to a final concentration of 100 µg/ml. Aliquot and store in -20 °C until use. |
| Human Mesenchymal Stem Cells (hMSC) | Cambrex | This cell type was used in the assay to determine synergistic effect of NGF and nanotopography. | |
| Rat PC12 Pheochromocytoma Cells | ATCC | This cell type was used in the neurite outgrowth assay to determine bioactivity of NGF. After exposure to release media with NGF, measure number of cells with neurite extensions and normalize to total number of cells. | |
| Grade 93 filter paper | Whatman | Z699675 | This is used for the purification of chitosan after its precipitation with sodium hydroxide at pH 7. |
| Swing bucket centrifuge | Eppendorf | 5810R | To be used during the purification of chitosan using 1,200 x g speed. |
| Motor with mandrel rotating at constant speed | Rhymebus | RM5E | The motor is used for the fabrication of IPC fibers on pullulan or PCL frame. |
| Phosphate buffered saline | FirstBase | Sterilize through filtration (0.2 µm filter) and autoclave. | |
| 10-mm diameter Tissue Culture Polystyrene Dish (TCPS) | Greiner | The TCPS dish is used for casting of pullulan frame. | |
| Human VEGF ELISA kit | R&D systems | DVE00 | The ELISA kit is used for detection of VEGF in the release medium. |
| Human NGF ELISA kit | R&D systems | DY256 | The ELISA kit is used for detection of NGF in the release medium. |
| Plastic Coated Adhesive Tape | Bel-Art | 9040336 | The adhesive tape is used to securely stick the alligator clip to the rotating mandrel |
References
- Annabi, N., Tamayol, A., et al. 25th Anniversary Article: Rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine. Adv. Mater. 26 (1), 85-124 (2014).
- Teo, B. K. K., Tan, G. D. S., Yim, E. K. F. The synergistic effect of nanotopography and sustained dual release of hydrophobic and hydrophilic neurotrophic factors on human mesenchymal stem cell neuronal lineage commitment. Tissue Eng. Part A. 20 (15-16), 2151-2161 (2014).
- Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: general approaches and a review of recent developments. J. R. Soc. Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
- Sun, Q., Chen, R. R., Shen, Y., Mooney, D. J., Rajagopalan, S., Grossman, P. M. Sustained vascular endothelial growth factor delivery enhances angiogenesis and perfusion in ischemic hind limb. Pharm. Res. 22 (7), 1110-1116 (2005).
- Rui, J., Dadsetan, M., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).
- King, T. W., Patrick, C. W. Development and in vitro characterization of vascular endothelial growth factor (VEGF)-loaded poly(DL-lactic-co-glycolic acid)/poly(ethylene glycol) microspheres using a solid encapsulation/single emulsion/solvent extraction technique. J. Biomed. Mater. Res. 51 (3), 383-390 (2000).
- Cutiongco, M. F. A., Tan, M. H., Ng, M. Y. K., Le Visage, C., Yim, E. K. F. Composite pullulan-dextran polysaccharide scaffold with interfacial polyelectrolyte complexation fibers: A platform with enhanced cell interaction and spatial distribution. Acta Biomater. 10 (10), 4410-4418 (2014).
- Yow, S. Z., Quek, C. H., Yim, E. K. F., Lim, C. T., Leong, K. W. Collagen-based fibrous scaffold for spatial organization of encapsulated and seeded human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (6), 1133-1142 (2009).
- Yim, E. K. F., Wan, A. C. A., Le Visage, C., Liao, I. C., Leong, K. W. Proliferation and differentiation of human mesenchymal stem cell encapsulated in polyelectrolyte complexation fibrous scaffold. Biomaterials. 27 (36), 6111-6122 (2006).
- Liao, I. C., Wan, A. C., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Controlled release from fibers of polyelectrolyte complexes. J. Control. Release. 104 (2), 347-358 (2005).
- Wan, A. C. A., Liao, I. C., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Mechanism of fiber formation by interfacial polyelectrolyte complexation. Macromolecules. 37 (18), 7019-7025 (2004).
- Yim, E. K. F., Reano, R., Pang, S., Yee, A., Chen, C., Leong, K. W. Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells. Biomaterials. 26 (26), 5405-5413 (2005).
- Sun, H., Xu, F., Guo, D., Yu, H. Preparation and evaluation of NGF-microsphere conduits for regeneration of defective nerves. Neurol. Res. 34 (5), 491-497 (2012).
- Simón-Yarza, T., Formiga, F. R., Tamayo, E., Pelacho, B., Prosper, F., Blanco-Prieto, M. J. PEGylated-PLGA microparticles containing VEGF for long term drug delivery. Int. J. Pharm. 440 (1), 13-18 (2013).
- Patel, Z. S., Ueda, H., Yamamoto, M., Tabata, Y., Mikos, A. G. In vitro and in vivo release of vascular endothelial growth factor from gelatin microparticles and biodegradable composite scaffolds. Pharm. Res. 25 (10), 2370-2378 (2008).
- Sun, H., Xu, F., Guo, D., Liu, G. In vitro evaluation of the effects of various additives and polymers on nerve growth factor microspheres. Drug Dev. Int. Pharm. 40 (4), 452-457 (2014).
- Lee, P. I. Kinetics of drug release from hydrogel matrices. J. Control. Release. 2, 277-288 (1985).
- Cutiongco, M. F. A., Choo, R. K. T., Shen, N. J. X., Chua, B. M. X., Sju, E., Choo, A. W. L., Le Visage, C., Yim, E. K. F. Composite scaffold of poly(vinyl alcohol) and interfacial polyelectrolyte complexation fibers for controlled biomolecule delivery. Front. Bioeng. Biotechnol. 3 (3), 1-12 (2015).
- Yow, S. Z., Lim, T. H., Yim, E. K. F., Lim, C. T., Leong, K. W. A 3D Electroactive Polypyrrole-Collagen Fibrous Scaffold for Tissue Engineering. Polymers. 3 (1), 527-544 (2011).
- Leong, M. F., Toh, J. K. C., et al. Patterned prevascularised tissue constructs by assembly of polyelectrolyte hydrogel fibres. Nat. Commun. 4, 2353 (2013).
- Di Benedetto, F., Biasco, A., Pisignano, D., Cingolani, R. Patterning polyacrylamide hydrogels by soft lithography. Nanotechnology. 16 (5), S165 (2005).
- Revzin, A., Russell, R. J., et al. Fabrication of poly(ethylene glycol) hydrogel microstructures using photolithography. Langmuir. 17 (18), 5440-5447 (2001).
- Yim, E. K. F., Liao, I. C. Tissue compatibility of interfacial polyelectrolyte complexation fibrous scaffold: evaluation of blood compatibility and biocompatibility. Tissue Eng. Part A. 13 (2), 423-433 (2007).
- Chaouat, M., Le Visage, C., Autissier, A., Chaubet, F., Letourneur, D. The evaluation of a small-diameter polysaccharide-based arterial graft in rats. Biomaterials. 27, 5546-5553 (2006).
- Eshraghi, S., Das, S. Mechanical and microstructural properties of polycaprolactone scaffolds with one-dimensional, two dimensional, and three-dimensional orthogonally oriented porous architectures produced by selective laser sintering. Acta Biomater. 6, 2467-2476 (2010).
