Protocol
1. Fremstilling af polyelektrolyt Solutions
- Oprense chitosan, som beskrevet detaljeret i Liao et al. Kort fortalt oprette en 1% (w / v) opløsning af chitosan i 2% (v / v) eddikesyre og vakuum filter ved hjælp klasse 93 filterpapir. Filtratet anvendelse af 5 M NaOH neutralisere indtil pH stabiliseres til 7. Centrifuger udfældede chitosan ved 1200 xg i 10 min. Dekanteres, og der tilsættes deioniseret vand til vaskning af chitosan. Der centrifugeres og vasketrinnet to gange mere. Frys præcipiterede chitosan ved -80 ° C og lyofiliseres O / N for at opnå den oprensede form. Opbevar oprenset chitosan i et affugtet kabinet.
- Afvejes 1 g oprenset chitosan i en steril vævskulturskål. Placer chitosan i vævskulturskål så tæt som muligt på UV lampe i biologisk sikkerhedsskab og udsættes for UV-lys i 15 minutter. Anvendelse af steril pincet, placere den steriliserede chitosan i en glasbeholder. Opløs chitosan hjælp filtreret 0.15M eddikesyre til en endelig koncentration mellem 0,5% og 1% (vægt / volumen).
- Afvejes 0,1 g alginsyre natriumsalt og opløses i 10 ml destilleret deioniseret (DDI) vand til opnåelse af en 1% (w / v) opløsning. Bland alginsyre natriumsalt i mindst 2 timer på vortex-blander for at sikre fuldstændig opløsning. Filtrer alginatopløsningen gennem 0,2 um sprøjtefilter. Opbevar alginat opløsning ved 4 ° C.
- Rekonstruere humane rekombinante vækstfaktorer, såsom vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) eller beta - nervevækstfaktor (NGF), som anbefalet af producenten.
2. Tegning af IPC Fibers
- Bland proteiner, vækstfaktorer eller andre biomolekyler i 10-20 pi alikvot af polyelektrolyt løsning, der har en lignende nettoladning. Biologiske molekyler med netto negativ ladning (f.eks bovint serumalbumin [BSA]) bør blandes med alginat løsning. Biologiske molekyler med netto positiv ladning (f.eks VEGF) bør blandes medchitosanopløsning.
- Placere små portioner (10-20 pi) af chitosan og alginat på en stabil flad overflade, der er dækket med parafilm. Dråber af chitosan og alginat bør placeres i tæt nærhed, men ikke i kontakt med hinanden.
- Let dyppe hver spids på et par pincet i chitosan og alginat dråber. Bringe dråberne af polyelektrolytter sammen ved at klemme tangen. Når dråberne kommer i kontakt med hinanden, langsomt trække tangen lodret opad for at trække IPC fiber fra grænsefladen mellem de to dråber (figur 1A).
- Placer forsigtigt enden af trukket IPC fiber på tangen på en samler, såsom en flad polymer stillads anbringes på en roterende dorn (se afsnit 3 og 4). Rotere dornen med en fast hastighed på 10 mm / sek for at tillade dannelse af en ensartet og beadless IPC fibre. Øge hastigheden af tegning IPC fibrene vil danne perler, hvilket vil forårsage en eksplosiv frigivelse af inkorporeretbiokemiske og for tidlig fiber opsigelse. 10
- At bestemme inkorporeringseffektivitet, indsamle efterlod alle resterende væske på parafilm ved fortynding med 500 pi 1X phosphatpufret saltopløsning (PBS). Måle proteinet eller vækstfaktor indhold i remanensen gennem BCA assay (for BSA), ELISA (for VEGF og NGF) eller en passende assay til påvisning inkorporeret biomolekyle.
3. Fremstilling af Composite Hydrogel Stillads af Pullulan-Dextran (PD) polysaccharid og IPC Fibers
- Opdigte opofrende pullulan ramme for IPC fiber kollektion
- Afvej pullulan polysaccharid og blandes med destilleret deioniseret (DDI) vand for at skabe en 20% (w / v) vandig opløsning. Bland pullulanopløsning O / N for at sikre homogenitet.
- Støbt 15 g pullulan opløsning i en 10 cm diameter vævskulturpolystyren (TCPS) skål. Tør pullulanopløsning O / N ved 37 ° C. Skær pullulanfilm til 7mm x 7 mm firkantede rammer.
- Fremstilling pullulan-dextran polysaccharidopløsning
- Opret en 30% (w / v) opløsning af polysacchariderne pullulan og dextran (3: 1 forhold) i DDI vand. Bland O / N til at sikre ensartethed i polysaccharidopløsningen. Tilsæt langsomt med natriumbicarbonat til polysaccharidet løsning til at opnå en slutkoncentration på 20% (vægt / volumen). Bland O / N til at sikre ensartethed af løsningen. Opbevar polysaccharid opløsning ved 4 ° C.
- Indsamling IPC fibre på pullulan ramme
- Anbringe offer pullulan ramme (afsnit 3.1) ved hjælp af et krokodillenæb. Stick krokodillenæb og pullulan ramme på enden af den roterende dorn ved hjælp plastbelagt tape. Rotere dornen med påsat ramme med en konstant hastighed på 10 mm / sek. Pullulanet ramme kan anbringes på den roterende dorn i ønskede retninger.
- Tegn IPC fibre ved hjælp af en pincet (afsnit 1) og Attach den trukne ende af IPC fibrene på den roterende pullulan ramme. Trække IPC fibre ved en konstant hastighed. Efter at have nået den terminale ende af IPC fiber, tørre fibre-on-frame konstruktion O / N ved stuetemperatur.
- Indlejring IPC fibre i PD hydrogel stillads
- At tværbinde hvert gram pullulan-dextran opløsning, tilsættes 100 pi 11% (vægt / volumen) natriumtrimetaphosphat vandig opløsning og 100 pi 10M natriumhydroxid. 7 Bland opløsningen ved 60 opm under anvendelse af en stirplate i 1 til 2 min. Efter tilsætning af natriumtrimetaphosphat og natriumhydroxid, vil polysaccharidopløsningen tværbinde næsten øjeblikkeligt. Hæld den viskose polysaccharid opløsning på fibrene-on-frame-konstruktion til fuldt ud at integrere IPC fibre. Inkubere de kombinerede pullulan-dextran-IPC fibre (PD-IPC) ved 60 ° C i 30 minutter til dannelse af en kemisk tværbundne sammensatte stilladser (figur 1b).
- ADVARSEL: Udfør trin 3.3.2 i stinkskab og bruge ordentlig beskyttende equipment som eddikesyre er ætsende og brandfarlig.
- For at inducere poredannelse i PD-IPC stillads, nedsænkes hele stilladset i 20% (vægt / volumen) eddikesyre i 20 minutter.
- Fjernelse af uomsatte reagenser ved at vaske PD-IPC stilladser i 1X PBS i 5 minutter under omrystning ved 100 rpm. Gentag dette trin 2 gange.
- Fjern det overskydende PBS og straks fryse PD-IPC stilladser ved -80 ° CO / N. Lyofilisere scaffolds mindst 24 timer før anvendelse i et kontrolleret frigivelse eller bioaktivitetsanalyser.
4. Fremstilling af kompositstilladset af PCL og IPC Fibers
ADVARSEL: Dichlormethan er et farligt materiale. Brug stinkskabet og personlige værnemidler ved håndtering af dichlormethan.
- Oprettelse uberørte og mønstrede PDMS substrater
- Opret en uberørt polydimethylsiloxan (PDMS) elastomer substrat ved hjælp af et stykke TCPS af ønsket dimension ved hjælp af bløde litografi proces. Opret patterned PDMS substrater ved anvendelse af standard bløde litografiske metoder på poly (methylmethacrylat) skabeloner med den ønskede topografi. 12
- Opdigte opofrende PCL ramme for IPC fiber kollektion
- Afvej PCL og opløses i dichlormethan for at skabe en 0,9% (w / v) opløsning. For hver 1 cm2 område af PDMS substrat, drop 500 pi 0,9% PCL opløsning. Tillad alle af dichlormethan opløsningsmiddel til fuldt ud at fordampe i stinkskab. Gentag processen med støbning 0,9% PCL at fortykke filmen til den ønskede tykkelse. Fjerne den tørrede PCL film fra PDMS substratet. Opret et hul i PCL ramme ved hjælp af en passende størrelse puncher. 2
- Indsamling IPC fibre på PCL rammen
- Anbringe offersystemet PCL ramme med hul (fra 4.2.1) på en alligator klip. Stick krokodillenæb på den roterende dorn ved hjælp plastbelagt tape. Fastgør den trukket ende af IPC fiber på PCL frame, før du starter rotationen ved en konstant hastighed på 10 mm / sek (afsnit 2). Efter afslutningen af IPC fibertrækning, tørre fiber-on-frame konstruktion O / N ved 4 ° C.
- Embedding fiber-on-frame konstruktion i mønstret PCL substrat
- Drop 500 pi 0,9% PCL opløsningen på PDMS substrat at skabe en uberørt eller mønstret PCL base efter behov. Cast flere lag af 0,9% PCL opløsning for at opnå et stillads med den ønskede tykkelse. Tillad alle af dichlormethan opløsningsmiddel til fuldt ud at fordampe i stinkskab.
- Placer fiber-on-frame-konstruktion (afsnit 4.3.1) oven på PCL base. Tilføje 0,9% PCL løsning på fiber-on-frame konstruere flere gange for at få den ønskede tykkelse og fuldt integrere IPC fibre, fremstilling af en PCL-IPC kompositstillads (figur 1C).
5. Måling af spredning af biologiske agenser fra Composite IPC Stilladser
- Placer komposit PD-IPC ellerPCL-IPC stilladser og enkeltstående IPC fibre separat i en 24-brønds plade.
- Fordyb stillads og stand-alone IPC fibre med 500 pi 1X PBS. Inkuber prøverne ved 37 ° C. Saml PBS på forskellige tidspunkter (release medier) og erstatte med 500 pi 1X PBS.
- Måle mængden af protein eller vækstfaktor i frigivelse medier ved anvendelse af en BCA-assay (BSA), ELISA (VEGF og NGF) eller et andet passende assay til at beregne den kumulative frigivelsesprofil for det inkorporerede biomolekyle.
6. Såning Celler på Composite IPC Stilladser til Test Bioaktivitet af Løst biologiske agenser
- Steriliser de frysetørrede PD-IPC eller PCL-IPC sammensatte scaffolds under anvendelse af UV lys i biologisk sikkerhedsskab i mindst 20 min.
- Brug standard celledyrkningsteknikker til opnåelse af en cellesuspension på 2 x 10 5 celler i 200 pi vækstmedium. Seed den koncentrerede cellesuspension på de sammensatte stilladser. After 20 min, top-up mængden af vækstmedier til fuldt ud at dykke stilladser.
- Måle celleaktivitet gennem standardteknikker, såsom Alamar blue metabolisk aktivitet assay PC12 neuritudvækst assay eller immunofluorescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne artikel, vi søgt at skabe sammensatte stilladser med IPC fibre til vedvarende frigivelse af forskellige biomolekyler. Karakteristik af de biomolekyler anvendt i denne undersøgelse findes i tabel 1. IPC fibre blev først indlejret i en hydrofil PD hydrogel at skabe en PD-IPC kompositstillads (figur 1B). Model molekyle BSA blev først testet for at bestemme muligheden for at benytte et kompositstillads til kontrolleret frigivelse biomolekyle. BSA blev inkorporeret i PD-IPC scaffolds med en effektivitet på 45 ± 0,97%. BSA frigivet fra PD-IPD viste næsten lineær kinetik med en initial svækket eksplosive frigivelse efterfulgt af en samtidig steady state (figur 2). Efter 2 måneder BSA opnåede en samlet frigivelse på 97%. I modsætning hertil enkeltstående IPC fibre udviste en hurtig frigivelse af 80% af BSA inden 4 timer.
Dernæst vi kontrolleret frigivelse profil og bioaktivitet af VEGF hjælp PD-IPC scaffoninger. VEGF blev inkorporeret med en effektivitet på 75,5 ± 2,7%, og viste en vedvarende frigivelse i mindst 1 uge (figur 3A). Humane umbilical vene-endotelceller (HUVEC'er) blev podet på PD-IPC stilladser til bestemmelse af bioaktiviteten af VEGF. HUVEC'er på PD-IPC skeletter viste en betydelig stigning i Alamar blue reduktion og metabolisk aktivitet sammenlignet med glatte PD stilladser på dag 1, hvilket indikerer god konservering af VEGF-funktion efter at være frigivet fra PD-IPC scaffolds (figur 3B). Alamar blå reduktion på dag 3, 6 og 7 faldt at opnå sammenlignelige niveauer med almindelig PD stillads (figur 3B).
PCL-IPC komposit stilladser blev også testet for kontrolleret frigivelse og sammenlignet med enkeltstående IPC fibre. Vi indarbejdet NGF som repræsentant molekyle ind i PCL-IPC komposit stilladser med en inkorporering effektivitet 66,38 ± 2,71%. PCL-IPC komposit stilladser viste linjear langvarig frigivelse og ca. 80% kumulativ frigivelse efter 18 dages (figur 4A). På den anden side, IPC stand-alone fiber udviste en 70% eksplosiv frigivelse inden 24 timer efterfulgt af en stagnerende frigivelseshastighed. Ved hjælp af en PC12 neuritudvækst assay undersøgte vi bioaktiviteten af det frigivne NGF (figur 4B). Den neuritudvækst af PC12-celler dyrket på PCL-IPC kompositstillads release medier viste lignende niveauer med PC12 celler dyrket i 30 ng / ml NGF suppleret medium. Dette indikerer, at de frigivne NGF forblev bioaktive i mindst 7 dage.
Kombination af topografi og vedvarende vækstfaktor levering kan efterligne den cellulære mikromiljø bedre. Den alsidige metodologi PCL-IPC fabrikation tillod fremstillingen af en biochemically- og topografisk styret komposit stilladset. Vi fabrikeret en PCL-IPC kompositstillads med nano-størrelse riste struktur (NP-PCL-IPC stillads). Vi observerede den synergistiske effekt af topografi og vedvarende NGF frigivelse ved at vurdere neuronal differentiering af humane mesenkymale stamceller (hMSC'er) (figur 5). hMSC'er dyrket på NP-PCL-IPC sammensatte scaffolds viste højere ekspression af mikrotubulus-associeret protein 2 (MAP2), indikerer neuronal differentiering. På den anden side, MAP2 protein ekspression var betydeligt lavere i hMSC'er dyrket på PCL-IPC med kun NGF frigivelse eller mønstret PCL (NP-PCL).
Figur 1. Integrering af IPC fibre i hydrofile og hydrofobe stilladser. (A) Tegning af IPC fibre på grænsefladen af positivt (chitosan) og negativt (alginat) ladede polyelektrolyt løsninger. (B) Skematisk diagram, der viser inkorporeringen af IPC fibre i hydrofile PD løsning til at skabe PD-IPC Composit e stillads. (C) Skematisk diagram, der viser inkorporeringen af IPC fibre i hydrofobe PCL stillads til at skabe PCL-IPC kompositstillads. Dette tal er tilpasset fra Cutiongco et al., 2014. 7 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Kontrolleret frigivelse af BSA fra PD-IPC kompositstillads. BSA blev inkorporeret i PD-IPC sammensatte stilladser og dets frigivelse blev målt på forskellige tidspunkter under anvendelse af BCA-assay. Kumulative BSA frigivet tilvejebringes som en procentdel af den totale mængde BSA (i ug) indarbejdet i IPC fibre og er præsenteret som gennemsnit procent ± standardafvigelse. Dette tal er tilpasset fra Cutiongco et al., 2014. 7/www.jove.com/files/ftp_upload/53079/53079fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Kontrolleret frigivelse og bioaktivitet af VEGF fra PD-IPC kompositstillads. (A) Akkumuleret frigørelsesprofil af VEGF fra PD-IPC komposit stilladser. VEGF frigivelse blev målt på forskellige tidspunkter ved hjælp af ELISA specifik for VEGF. (B) Cellelevedygtighed af endotelceller dyrket på PD-IPC komposit scaffolds, som målt ved Alamar blue metabolisk assay. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af envejs ANOVA med Tukey post-hoc test. * Betegner p <0,05. Dette tal er tilpasset fra Cutiongco et al., 2014. 7 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Kontrolleret frigivelse og bioaktivitet af NGF fra PCL-IPC kompositstillads. (A) Akkumuleret frigørelsesprofil af NGF fra PCL-IPC komposit stilladser. NGF frigivelse blev målt på forskellige tidspunkter ved hjælp af ELISA er specifikt for NGF. Insert viser kumulativ frigivelsesprofil af NGF fra PCL-IPC stillads for første 8 timer. (B) Bioaktivitet af NGF som målt ved udvækst af PC12 neurale celler. PC12 udvækst blev målt gennem billedanalyse. Dette tal er tilpasset fra Teo et al., 2014. 2 Klik her for at se en større version af dette tal.
.jpg "/>
Figur 5. Differentiering af hMSC på NP-PCL-IPC stillads. Konfokal scanning mikroskopi billede af hMSC dyrket på forskellige sammensatte stilladser. (A) NP-PCL-IPC, (B) NP-PCL, (C) PCL-IPC, (D) Pristine PCL stilladser. Grøn plet betegner MAP2, en neuronal afstamning markør. Rød plet betegner F-actin, der viser den cellulære cytoskelet. Blåsplint betegner kernen. Dette tal er tilpasset fra Teo et al., 2014. 2 Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1. Karakteristik af biokemikalier, der anvendes til kontrolleret frigivelse fra sammensatte IPC stilladser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IPC fibre dannes ved interaktionen af to modsat ladede polyelektrolytter. Fremgangsmåden udnytter ekstraktion af komplekset fra grænsefladen af polyelektrolytter, letter en selvsamlende fremgangsmåde til stabil fiberdannelse. Mekanismen for IPC fiberdannelse sikrer, at enhver biomolekyle tilføjede i en tilsvarende ladet polyelektrolyt kan inkorporeres under kompleksdannelse processen. 10,11 Omvendt vil tilsætning af et biomolekyle i modsat ladede polyelektrolyt medfører øjeblikkelig udfældning. Den enkle fabrikation metode til IPC fibre egner alsidighed i at inkorporere forskellige biologiske materialer såsom celler, vækstfaktorer og små molekyler. Denne kritiske funktion i IPC fibre blev også observeret i både PD-IPC og PCL-IPC komposit stilladser, hvor vækstfaktorer med forskellige fysiske og biomolekylære egenskaber (opladning og molekylvægt) blev indarbejdet med høj effektivitet. I contrast, kan indkapslingseffektivitet hjælp mikrosfære metoder til VEGF og NGF være så lav som 16% 6 og 8% 13 hhv.
Både PD-IPC og PCL-IPC stilladser viste også tidsmæssige styring biomolekyle frigivelse. VEGF fra PD-IPC scaffolds viste lineær frigivelse i mindst 7 dage. I modsætning hertil rapporterede VEGF frigivelsesprofiler fra polymere mikrosfærer viste en initialudbrud frigivelse inden 24 timer, frigivelse af mindst 60% af det samlede VEGF indhold. 5,14,15 Ligeledes NGF viste sig at have lidt vækstfaktor levering fra PCL-IPC stilladser, mens andre polymere baseret vækstfaktor leveringssystemer viser et plateau for overgang fra 20 dage om frigivelse. 13,16 formentlig de forskellige komponenter i de sammensatte stilladser begge bidrager til vækstfaktor frigivelseskinetik. Polymer relaksationsmekanismer kan porøsitet og snoning i høj grad påvirke frigivelsen af hydrofile biomolekyler. 17 Derudover chemical karakteristika af det polymere stillads kan have elektrostatisk tiltrækning og frastødning i retning vækstfaktorerne, der påvirker biomolekyle frigivelse. Således karakteristika polymere stillads er kritisk ved bestemmelse frigivelsesprofiler og biomolekyler med tidsmæssigt kontrolleret frigivelse. For eksempel, mens PD stillads viste næsten lineær BSA frigivelse, en lignende kompositstillads anvendelse af poly (vinylalkohol) hydrogel manglede permeabilitet for BSA. 18 Polymere stilladser, som kan anvendes i kombination med IPC fibre kan kræve indledende test for at bestemme dens permeabilitet interval.
Foruden kontrolleret biokemisk frigivelse, evnen til at bevare bioaktiviteten af vækstfaktorer er et vigtigt træk for ethvert biomolekyle leveringssystem. Den barske alkaliske miljø i PD-opløsning og tilstedeværelsen af organisk opløsningsmiddel DCM i PCL har potentiale til at nedbryde enhver slags biomolekyler. F.eks mikrosfæreafgivelsessystem system, bruges dichlormethan viste en konsekvent tendens til aftagende bioaktivitet med stigende tidspunkterne på grund af nedbrydningen af NGF. 16. Ikke desto mindre vi observeret, at bioaktiviteten af VEGF og NGF opretholdes, yderligere gentager, at en vigtig fordel ved IPC fibre assimileret i det sammensatte stilladser.
Anvendelsen af en opofrende, biokompatibel polysaccharid eller polymer ramme, der let kan indarbejdes i bulk-stillads giver alsidighed til at skabe et kompositstillads med flere IPC fibre orienteret i forskellige konfigurationer. 7 Det er således nødvendigt, at de polymere skeletter, der skal anvendes med IPC fibre har kapacitet til yderligere assimilation i en bulk stilladset. Assimilation er vigtig i fuldt indlejring IPC fibre i den polymere stillads. Vi observerede dette fænomen i det hellige pullulan og PCL rammer, som begge blev let opløst i opløsningsmidlet af bulk PD ellerPCL stillads. Endvidere enkelt-trins fremgangsmåde til IPC fabrikation og biomolekyle inkorporering giver fleksibilitet til antallet af biomolekyler, som kan leveres af en enkelt sammensat stillads. Enkeltheden af metoden giver også finjustering af inkorporeringen effektivitet og frigivelseskinetik ved at ændre polyelektrolyt identitet eller koncentration. Den naturlige polyelektrolytter chitosan og alginat blev anvendt på grund af sin høje ladningstæthed og lighed til forskellige ECM kulhydrater, der findes i dyrevæv. Endnu methyleret collagen og terpolymeren 8,19 eller chitin og alginat 20 maj også anvendes til IPC fiberdannelse i varierende virkninger. Multiple IPC fibre frigiver forskellige biokemiske signaler med kan også opnås forskellige kinetik for at skabe en multifunktionel kompositstillads. For eksempel kan ekstracellulære matrix proteiner såsom fibronektin indlæses i IPC fibre giver en platform for rumligt kontrolleret celleadhæsion. 7 Vedvarendefrigivelse af antibiotika og vækstfaktorer er også ønskelige til vævsregenerering applikationer. Dette kan ske ved hjælp af PCL-IPC, som kan inkorporere hydrofobe, småmolekylelægemidler og hydrofile, proteinbaserede vækstfaktorer i forskellige rum i kompositstillads. 2
Vores præsenteret metodologi også tilladt fremstilling af et stillads med både topografiske og biokemiske signaler. Vi observerede, at NP-PCL-IPC stillads havde den højeste forøgelse af hMSC differentiering til den neuronal cellelinje, hvilket indebærer, at efterligne multiple aspekter af biofysiske og biokemiske cellulære niche er gavnligt i dirigere celle adfærd. Den lette den præsenterede metode tillader dets anvendelse til andre dannes mønstre polymere systemer såsom polyacrylamid 21 eller polyethylenglycol 22, forudsat at tværbindingsprocessen ikke vil påvirke IPC fiber integritet væsentligt. F.eks PD scaffolds var chOsen i denne undersøgelse for sin unikke tværbinding mekanisme, der forekommer i omgivelses- og vandige betingelser. 24. Dette kan potentielt give mere fysiologisk relevante substrater til in vitro- og in vivo-undersøgelser. Derudover kan indlejring IPC fibre i et kompositstillads overvinde manglen på mekanisk styrke af IPC fibre 23 ved at tilvejebringe trækstyrke. Faktisk blev PCL 25 valgt for sin høj mekanisk styrke.
Sammenfattende blev en simpel metode til at skabe sammensatte stillads til biomolekyle levering beskrevet. Vi viste, hvordan IPC fibre kan anvendes til vedvarende levering af biomolekyler, uden at dens bioaktivitet og inkorporeringen effektivitet. Vi viste dette ved at skabe sammensatte stilladser med to varianter: PD-IPC og PCL-IPC stilladser. Anvendelse af IPC fibre er ikke begrænset til inkorporering i PD- og PCL-baserede scaffolds, men kan potentielt udvides til andre polymere systemerog levere andre biomolekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Singapores Grundforskningsfond administreres af en af sine Research Centers of Excellence, i Mechanobiology Institute, Singapore. MFAC er støttet af Styrelsen for Videnskab, Teknologi og Forskning (Singapore) og nationale agentur for Forskning (Frankrig) fælles program under projektnummer 1122703037. BKKT understøttes af Mechanobiology Institute. Vi takker Mr. Daniel HC Wong for korrekturlæsning manuskriptet og Ms. Dawn JH Neo for at bistå i videoproduktion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pullulan | Hayashibara Inc Okayama Japan | Molecular weight (MW) 200 kDa. This material is pharmaceutical grade pullulan used to make pullulan frames and PD-IPC scaffolds. | |
| Dextran | Sigma Aldrich | D1037 | MW 500 kDa. This material is no longer being produced by Sigma Aldrich. Alternative suggested is catalog number 31392 (Sigma Aldrich). This material is used to make PD-IPC scaffolds. |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | Sodium bicarbonate must be slowly added to the pullulan-dextran polysaccharide solution. Rapid addition of sodium bicarbonate will result in precipitation. |
| Sodium Trimetaphosphate | Sigma Aldrich | T5508 | This chemical is hygroscopic and must be stored in the dehumidifying cabinet. Aqueous solution of sodium trimetaphosphate must always be made fresh. |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | This material is hazardous and must be handled with proper protective equipment such as nitrile gloves. |
| Chitosan | Sigma Aldrich | 448877 | MW 190-310 kDa. Acetylation degree of 75% to 85%. Purification of chitosan is required to create stable IPC fibers. |
| Acetic Acid | Merck | This can be replaced by another brand type. This material is corrosive and flammable. Protective equipment such as face shield, nitrile gloves, lab coat and shoe cover must be worn when handling this chemical in the fume hood. | |
| Alginic acid sodium salt from brown algae, low viscosity | Sigma Aldrich | A2158 | Dissolve in water overnight. Filter through sterile 0.2 µm syringe filter before use. Store at 4 °C. |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent | Dissolve in sterile PBS and filter using 0.2 µm syringe filter before use. | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | This kit was used to measure BSA release from PD-IPC scaffolds. |
| Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor | R&D systems | 293-VE | Dissolve growth factor in 0.2% heparin solution to a final concentration of 5 mg/ml. |
| Heparin Sodium Salt From Porcine | Sigma Aldrich | H3393 | This can be replaced by another brand type. Dissolve heparin salt in sterile water at a final concentration of 1% and filter through 0.2 µm syringe filter before use. |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Lonza | C2517A | This primary cell type was used in the assay to determine VEGF bioactivity after release from PD-IPC scaffolds. |
| Alamar blue | Life Technologies | DAL1025 | This is used to measure cell metabolic activity. Incubate Alamar blue with cells and maintain in standard cell culture conditions for 2 to 4 hours. Measure absorbance at 570 nm to determine Alamar blue percent reduction, which is correlated to the cell activity. |
| ScanVac Coolsafe Lyophilizer | Labogene | 7.001.200.060 | This is a non-programmable freeze dryer that operates at -105 to -110 °C. This can be replaced by other standard lab lyophilizers. |
| Polycaprolactone (PCL) | Sigma Aldrich | 181609 | MW 65 kDa. This is no longer being manufactured by Sigma Aldrich. This can be replaced by Sigma Aldrich catalog number 704105. |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | V800151 | This can be replaced by another brand type. This material is hazardous and must be handled in the fume hood. Protective equipment must be worn at all times when handling this chemical. |
| Polydimethylsiloxane (PDMS; 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow Corning | (240)4019862 | The elastomer kit comes with polymer base and crosslinker. Mixing the polymer base and crosslinker in different ratios will result in different stiffness of the PDMS. |
| Human Recombinant Beta-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D systems | 256-GF | Reconstituted in sterile DI water to a final concentration of 100 µg/ml. Aliquot and store in -20 °C until use. |
| Human Mesenchymal Stem Cells (hMSC) | Cambrex | This cell type was used in the assay to determine synergistic effect of NGF and nanotopography. | |
| Rat PC12 Pheochromocytoma Cells | ATCC | This cell type was used in the neurite outgrowth assay to determine bioactivity of NGF. After exposure to release media with NGF, measure number of cells with neurite extensions and normalize to total number of cells. | |
| Grade 93 filter paper | Whatman | Z699675 | This is used for the purification of chitosan after its precipitation with sodium hydroxide at pH 7. |
| Swing bucket centrifuge | Eppendorf | 5810R | To be used during the purification of chitosan using 1,200 x g speed. |
| Motor with mandrel rotating at constant speed | Rhymebus | RM5E | The motor is used for the fabrication of IPC fibers on pullulan or PCL frame. |
| Phosphate buffered saline | FirstBase | Sterilize through filtration (0.2 µm filter) and autoclave. | |
| 10-mm diameter Tissue Culture Polystyrene Dish (TCPS) | Greiner | The TCPS dish is used for casting of pullulan frame. | |
| Human VEGF ELISA kit | R&D systems | DVE00 | The ELISA kit is used for detection of VEGF in the release medium. |
| Human NGF ELISA kit | R&D systems | DY256 | The ELISA kit is used for detection of NGF in the release medium. |
| Plastic Coated Adhesive Tape | Bel-Art | 9040336 | The adhesive tape is used to securely stick the alligator clip to the rotating mandrel |
References
- Annabi, N., Tamayol, A., et al. 25th Anniversary Article: Rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine. Adv. Mater. 26 (1), 85-124 (2014).
- Teo, B. K. K., Tan, G. D. S., Yim, E. K. F. The synergistic effect of nanotopography and sustained dual release of hydrophobic and hydrophilic neurotrophic factors on human mesenchymal stem cell neuronal lineage commitment. Tissue Eng. Part A. 20 (15-16), 2151-2161 (2014).
- Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: general approaches and a review of recent developments. J. R. Soc. Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
- Sun, Q., Chen, R. R., Shen, Y., Mooney, D. J., Rajagopalan, S., Grossman, P. M. Sustained vascular endothelial growth factor delivery enhances angiogenesis and perfusion in ischemic hind limb. Pharm. Res. 22 (7), 1110-1116 (2005).
- Rui, J., Dadsetan, M., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).
- King, T. W., Patrick, C. W. Development and in vitro characterization of vascular endothelial growth factor (VEGF)-loaded poly(DL-lactic-co-glycolic acid)/poly(ethylene glycol) microspheres using a solid encapsulation/single emulsion/solvent extraction technique. J. Biomed. Mater. Res. 51 (3), 383-390 (2000).
- Cutiongco, M. F. A., Tan, M. H., Ng, M. Y. K., Le Visage, C., Yim, E. K. F. Composite pullulan-dextran polysaccharide scaffold with interfacial polyelectrolyte complexation fibers: A platform with enhanced cell interaction and spatial distribution. Acta Biomater. 10 (10), 4410-4418 (2014).
- Yow, S. Z., Quek, C. H., Yim, E. K. F., Lim, C. T., Leong, K. W. Collagen-based fibrous scaffold for spatial organization of encapsulated and seeded human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (6), 1133-1142 (2009).
- Yim, E. K. F., Wan, A. C. A., Le Visage, C., Liao, I. C., Leong, K. W. Proliferation and differentiation of human mesenchymal stem cell encapsulated in polyelectrolyte complexation fibrous scaffold. Biomaterials. 27 (36), 6111-6122 (2006).
- Liao, I. C., Wan, A. C., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Controlled release from fibers of polyelectrolyte complexes. J. Control. Release. 104 (2), 347-358 (2005).
- Wan, A. C. A., Liao, I. C., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Mechanism of fiber formation by interfacial polyelectrolyte complexation. Macromolecules. 37 (18), 7019-7025 (2004).
- Yim, E. K. F., Reano, R., Pang, S., Yee, A., Chen, C., Leong, K. W. Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells. Biomaterials. 26 (26), 5405-5413 (2005).
- Sun, H., Xu, F., Guo, D., Yu, H. Preparation and evaluation of NGF-microsphere conduits for regeneration of defective nerves. Neurol. Res. 34 (5), 491-497 (2012).
- Simón-Yarza, T., Formiga, F. R., Tamayo, E., Pelacho, B., Prosper, F., Blanco-Prieto, M. J. PEGylated-PLGA microparticles containing VEGF for long term drug delivery. Int. J. Pharm. 440 (1), 13-18 (2013).
- Patel, Z. S., Ueda, H., Yamamoto, M., Tabata, Y., Mikos, A. G. In vitro and in vivo release of vascular endothelial growth factor from gelatin microparticles and biodegradable composite scaffolds. Pharm. Res. 25 (10), 2370-2378 (2008).
- Sun, H., Xu, F., Guo, D., Liu, G. In vitro evaluation of the effects of various additives and polymers on nerve growth factor microspheres. Drug Dev. Int. Pharm. 40 (4), 452-457 (2014).
- Lee, P. I. Kinetics of drug release from hydrogel matrices. J. Control. Release. 2, 277-288 (1985).
- Cutiongco, M. F. A., Choo, R. K. T., Shen, N. J. X., Chua, B. M. X., Sju, E., Choo, A. W. L., Le Visage, C., Yim, E. K. F. Composite scaffold of poly(vinyl alcohol) and interfacial polyelectrolyte complexation fibers for controlled biomolecule delivery. Front. Bioeng. Biotechnol. 3 (3), 1-12 (2015).
- Yow, S. Z., Lim, T. H., Yim, E. K. F., Lim, C. T., Leong, K. W. A 3D Electroactive Polypyrrole-Collagen Fibrous Scaffold for Tissue Engineering. Polymers. 3 (1), 527-544 (2011).
- Leong, M. F., Toh, J. K. C., et al. Patterned prevascularised tissue constructs by assembly of polyelectrolyte hydrogel fibres. Nat. Commun. 4, 2353 (2013).
- Di Benedetto, F., Biasco, A., Pisignano, D., Cingolani, R. Patterning polyacrylamide hydrogels by soft lithography. Nanotechnology. 16 (5), S165 (2005).
- Revzin, A., Russell, R. J., et al. Fabrication of poly(ethylene glycol) hydrogel microstructures using photolithography. Langmuir. 17 (18), 5440-5447 (2001).
- Yim, E. K. F., Liao, I. C. Tissue compatibility of interfacial polyelectrolyte complexation fibrous scaffold: evaluation of blood compatibility and biocompatibility. Tissue Eng. Part A. 13 (2), 423-433 (2007).
- Chaouat, M., Le Visage, C., Autissier, A., Chaubet, F., Letourneur, D. The evaluation of a small-diameter polysaccharide-based arterial graft in rats. Biomaterials. 27, 5546-5553 (2006).
- Eshraghi, S., Das, S. Mechanical and microstructural properties of polycaprolactone scaffolds with one-dimensional, two dimensional, and three-dimensional orthogonally oriented porous architectures produced by selective laser sintering. Acta Biomater. 6, 2467-2476 (2010).
