Protocol
1. Herstellung von Polyelektrolytlösungen
- Reinige Chitosan, wie in Liao et al beschrieben. Kurz gesagt, erstellen Sie eine 1% (w / v) Lösung von Chitosan in 2% (v / v) Essigsäure und Vakuumfilter mit Grad 93-Filterpapier. Neutralisiert das Filtrat mit 5 M NaOH, bis der pH-Wert stabilisiert bis 7. Zentrifugieren Sie das ausgefallene Chitosan bei 1.200 × g für 10 min. Überstand dekantieren und fügen VE-Wasser, um das Chitosan zu waschen. Wiederholen Sie die Zentrifugation und Waschschritt noch zweimal. Einfrieren der ausgefallene Chitosan bei -80 ° C und lyophilisiere O / N, um die gereinigte Form zu erhalten. Bewahren Sie gereinigte Chitosan in einem entfeuchteten Schrank.
- Abwiegen 1 g gereinigtes Chitosan in eine sterile Gewebekulturschale. Platzieren des Chitosans in der Gewebekulturschale so nahe wie möglich an der UV-Lampe in der Sicherheitswerkbank und freizulegen, um UV-Licht für 15 min. Mit einer sterilen Pinzette, legen Sie die sterilisiert Chitosan in einen Glasbehälter. Chitosan aufzulösen Verwendung gefiltert 0.15M Essigsäure bis zu einer Endkonzentration zwischen 0,5% und 1% (w / v).
- Abwiegen 0,1 g Alginsäure-Natriumsalz und lösen sich in 10 ml destilliertem entionisiertem (DDI) Wasser, um eine 1% (w / v) Lösung zu erhalten. Mischen Sie die Alginsäurenatriumsalz für mindestens 2 Stunden auf dem Vortex-Mischer, um eine vollständige Auflösung zu gewährleisten. Filtern der Alginatlösung durch 0,2 & mgr; m-Spritzenfilter. Bewahren Sie die Alginat-Lösung bei 4 ° C.
- Rekonstituieren humanen rekombinanten Wachstumsfaktoren, wie den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) oder & beta; - Nervenwachstumsfaktor (NGF), wie vom Hersteller empfohlen.
2. Zeichnung der IPC Fibers
- Mischen Sie Proteine, Wachstumsfaktoren oder andere Biomoleküle in 10-20 ul-Aliquot der Polyelektrolyt-Lösung, die eine ähnliche Nettoladung hat. Biologische Moleküle mit negativen Nettoladung (zB Rinderserumalbumin [BSA]) sollte mit Alginat-Lösung gemischt werden. Biologische Moleküle mit positiven Nettoladung (zB VEGF) sollte mit gemischt werdenChitosan-Lösung.
- Legen Sie kleine Teilmengen (10-20 ul) von Chitosan und Alginat auf eine stabile ebene Fläche, die mit Parafilm abgedeckt ist. Die Tröpfchen aus Chitosan und Alginat sollte in enger Nachbarschaft angeordnet werden, jedoch nicht in Kontakt miteinander.
- Leicht tauchen jede Spitze auf einer Pinzette in die Chitosan und Alginat-Tröpfchen. Bringen Sie die Tropfen von Polyelektrolyten zusammen durch Kneifen der Zange. Wenn die Tröpfchen in Kontakt miteinander kommen, die Zange langsam senkrecht nach oben zu ziehen, um die IPC-Faser von der Schnittstelle der beiden Tröpfchen (1A) ziehen.
- Legen Sie das Ende des gezogenen IPC Faser an der Zange auf einem Kollektor, wie eine flache Polymergerüst auf einem rotierenden Dorn befestigt (siehe Kapitel 3 und 4). Drehen des Dorns mit einer festen Geschwindigkeit von 10 mm / s, um die Bildung einer einheitlichen und wulstfreie IPC Fasern ermöglichen. Die Erhöhung der Geschwindigkeit des Ziehens der Fasern IPC Kügelchen bilden, die eine schlagartige Freisetzung des eingearbeiteten verursachenbiochemischen und vorzeitige Beendigung Faser. 10
- Um zu bestimmen Einbaueffizienz, sammeln alle verbleibenden Flüssigkeiten links auf dem Parafilm durch Verdünnen mit 500 ul 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Messung der Faktor-Inhalts Protein oder das Wachstum in dem Rückstand durch BCA-Assay (für BSA), ELISA (für VEGF und NGF) oder einem entsprechenden Assay eingebaut Biomolekül detektieren.
3. Herstellung von Verbund Hydrogel Gerüst Pullulan-Dextran (PD) Polysaccharide und IPC Fibers
- Herstellung Opfer Pullulan Rahmen für IPC Fasersammel
- Abwiegen Pullulan Polysaccharid und mischen mit destilliertem deionisiertem (DDI) Wasser, um eine 20% erstellen (w / v) wässrigen Lösung. Mischen Sie die Pullulanlösung O / N, um die Homogenität zu gewährleisten.
- Guss 15 g Pullulan-Lösung in einen Durchmesser von 10 cm Gewebekultur Polystyrol (TCPS) Gericht. Trocknen Sie die Pullulanlösung O / N bei 37 ° C. Schneiden Sie die Pullulan Filme in 7mm x 7 mm quadratische Rahmen.
- Vorbereiten Pullulan-Dextran Polysaccharidlösung
- Erstellen Sie eine 30% (w / v) Lösung der Polysaccharide Pullulan und Dextran (3: 1-Verhältnis) in DDI Wasser. Mischungs O / N um die Homogenität der Polysaccharidlösung gewährleisten. Langsame Zugabe von Natriumhydrogencarbonat zu der Polysaccharid-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 20% zu erreichen (w / v). Mischungs O / N, um die Homogenität der Lösung sicherzustellen. Lagern Sie das Polysaccharid-Lösung bei 4 ° C.
- Sammeln IPC Fasern auf Pullulan Rahmen
- Befestigen Sie das Opfer Pullulan Rahmen (Abschnitt 3.1) mit einem Krokodilklemme. Haften die Krokodilklemme und Pullulan Rahmen auf dem Ende des sich drehenden Dorn mit Kunststoff beschichtetes Klebeband. Drehen des Dorns mit dem befestigten Rahmen mit einer konstanten Geschwindigkeit von 10 mm / sec. Pullulan Rahmen kann auf den sich drehenden Dorn in gewünschten Orientierungen befestigt werden.
- Zeichnen Sie die IPC-Fasern mit einer Pinzette (Abschnitt 1) und attach das gezogene Ende der IPC-Fasern auf die rotierende Pullulan Rahmen. Ziehen die IPC Fasern mit einer konstanten Geschwindigkeit. Bei Erreichen der terminalen Ende der IPC Faser, trockne die Fasern gegenüber dem Trägerrahmen die O / N bei RT.
- Einbetten IPC Fasern in PD Hydrogel Gerüst
- Um jedes Gramm Pullulan-Dextran-Lösung zu vernetzen, werden 100 & mgr; l von 11% (w / v) Natrium-Trimetaphosphat wässrige Lösung und 100 ul 10 M Natriumhydroxid. 7 Mischen der Lösung bei 60 UpM unter Verwendung einer Rührplatte für 1 bis 2 min. Nach der Zugabe von Natriumtrimetaphosphat und Natriumhydroxid wird die Polysaccharid-Lösung fast sofort zu vernetzen. Gießen Sie die viskose Polysaccharid-Lösung auf die Fasern-on-Frame-Konstrukt, um die IPC-Fasern vollständig einzubetten. Inkubieren der kombinierten Pullulan-Dextran-IPC Fasern (PD-IPC) bei 60 ° C für 30 min, um eine chemisch vernetzte Verbundgerüste (1B) zu bilden.
- ACHTUNG: Führen Sie Schritt 3.3.2 in der Abzugshaube und verwenden Sie geeignete Schutz equipment wie Essigsäure ist eine aggressive und brennbare.
- Zur Porenbildung in der PD-IPC Gerüst induzieren, tauchen die ganze Gerüst in 20% (w / v) Essigsäure für 20 min.
- Entfernen nicht umgesetzten Reagenzien durch Waschen PD-IPC Gerüste in 1X PBS für 5 min unter Schütteln bei 100 Umdrehungen pro Minute. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 mal.
- Entfernen Sie das überschüssige PBS und unverzüglich sperren PD-IPC Gerüste bei -80 ° CO / N. Lyophilisieren die Gerüste mindestens 24 Stunden vor der Verwendung in allen kontrollierten Freisetzung oder Bioaktivitätstests.
4. Herstellung von Verbundgerüst von PCL und IPC Fibers
ACHTUNG: Dichlormethan ist ein Gefahrstoff. Verwenden Sie den Abzug und persönliche Schutzausrüstung beim Umgang mit Dichlormethan.
- Erstellen unberührten und gemusterten PDMS Substrate
- Erstellen Sie eine neue, unberührte Polydimethylsiloxan (PDMS) Elastomer-Substrat mit einem Stück TCPS der gewünschten Abmessung mit weichen Lithographieprozess. Erstellen patteingeschaltet PDMS Substrate durch Verwendung von Standard-Weichlithographieverfahren von Poly (methylmethacrylat) Vorlagen mit der gewünschten Topographie. 12
- Herstellung Opfer PCL Rahmen für IPC Fasersammel
- Abwiegen PCL und lösen in Dichlormethan, um eine 0,9% (w / v) Lösung zu schaffen. Für jede 1 cm 2 Fläche des PDMS-Substrat, fallen 500 ul 0,9% PCL-Lösung. Lassen Sie das gesamte Lösungsmittel Dichlormethan vollständig in der Abzugshaube verdampfen. Wiederholen den Vorgang des Gießens 0,9% PCL, um die Folie auf die gewünschte Dicke zu verdicken. Entfernen Sie die getrockneten PCL-Film aus der PDMS-Substrat. Erstellen Sie ein Loch in der PCL-Rahmen mit einem angemessen dimensionierten Puncher. 2
- Sammeln IPC Fasern auf der PCL-Rahmen
- Befestigen Sie das Opfer PCL Rahmen mit Loch (von 4.2.1) auf einer Krokodilklemme. Halten Sie die Krokodilklemme auf den sich drehenden Dorn unter Verwendung kunststoffbeschichteten Klebeband. Befestigen Sie den gezogenen Ende des IPC Faser auf die PCL frame vor dem Start der Drehung mit einer konstanten Geschwindigkeit von 10 mm / s (Abschnitt 2). Nach dem Ende der IPC Faserziehen, Trocknen der Faser-on-Frame-Konstrukt O / N bei 4 ° C.
- Einbetten von Faser-on-Frame-Konstrukts in gemusterten PCL Substrat
- Drop 500 ul 0,9% PCL-Lösung auf das PDMS-Substrat, um eine unberührte oder gemusterten PCL Basis zu schaffen, je nach Bedarf. Guss mehrere Schichten von 0,9% PCL-Lösung ein Gerüst mit der gewünschten Dicke zu erhalten. Lassen Sie das gesamte Lösungsmittel Dichlormethan vollständig in der Abzugshaube verdampfen.
- Legen Sie die Faser-on-Frame-Konstrukt (Abschnitt 4.3.1) auf der Oberseite des Basis PCL. In 0,9% PCL-Lösung auf die Faser-auf-Rahmen zu konstruieren mehrmals, um die gewünschte Dicke zu erhalten und vollständig einzubetten die IPC-Fasern, Herstellen einer PCL-IPC Verbundgerüst (Abbildung 1c).
5. Messung der Freisetzung biologischer Stoffe aus Verbund IPC Gerüste
- Zeigen Verbund PD-IPC oderPCL-IPC Gerüsten und Stand-alone-IPC Fasern getrennt in einer 24-Well-Platte.
- Tauchen Sie das Gerüst und Standalone-IPC-Fasern mit 500 ul 1X PBS. Die Proben bei 37 ° C inkubiert. Sammeln PBS zu verschiedenen Zeitpunkten (Release-Medien) und ersetzen mit 500 ul 1X PBS.
- Messen der Menge an Protein oder Wachstumsfaktor in den Freisetzungsmedien mit einem BCA-Test (BSA), ELISA (VEGF und NGF) oder anderen geeigneten Assays für das kumulative Freisetzungsprofil für den einge Biomolekül berechnen.
6. Seeding von Zellen auf Composite-IPC Gerüste auf der freigegeben Biologische Arbeitsstoffe Testen Bioaktivität
- Sterilisieren Sie die lyophilisierten PD-IPC oder PCL-IPC Verbund Gerüste mit UV-Licht in der biologischen Sicherheitswerkbank für mindestens 20 min.
- Verwenden Standardzellkulturtechniken, um eine Zellsuspension von 2 x 10 5 Zellen in 200 & mgr; l Wachstumsmedium zu erhalten. Samen der konzentrierten Zellsuspension auf die Verbund Gerüste. After 20 min, top-up das Volumen des Wachstumsmediums, um die Gerüste vollständig untertauchen.
- Messen der Zellaktivität, durch Standardtechniken, wie Alamar Blau metabolischen Aktivitätstest PC12 Neuritenwachstum Assay oder Immunfluoreszenz.
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Representative Results
In diesem Artikel haben wir versucht, Verbund Gerüste mit IPC-Fasern für die verzögerte Freisetzung verschiedener Biomoleküle zu schaffen. Eigenschaften der in dieser Studie verwendeten Biomoleküle sind in Tabelle 1 gefunden. IPC Faser wurde in eine hydrophile PD Hydrogel eingebettet ist, um einen PD-IPC Verbundgerüst (1B) zu schaffen. Modellmolekuls BSA wurde zuerst untersucht, um die Durchführbarkeit der Verwendung eines Verbundgerüst zur kontrollierten Freisetzung Biomoleküls zu bestimmen. BSA wurde in PD-IPC Gerüste mit einem Wirkungsgrad von 45 ± 0,97% eingebracht. BSA aus dem PD-IPD Freigabe zeigte nahezu lineare Kinetik mit einer anfänglichen abgeschwächten artige Freisetzung, gefolgt von einer gleichzeitigen stabilen Zustand (Figur 2). Nach 2 Monaten erreicht BSA eine Gesamtfreisetzung von 97%. Im Gegensatz dazu zeigten Alone IPC Fasern eine schnelle Freisetzung von 80% BSA innerhalb von 4 Std.
Als nächstes haben wir das Freisetzungsprofil und Bioaktivität von VEGF kontrolliert mit PD-IPC scaffolds. VEGF wurde mit einem Wirkungsgrad von 75,5 ± 2,7% eingebracht und zeigten eine anhaltende Freisetzung für mindestens 1 Woche (3A). Menschlichen Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) wurden auf den PD-IPC Gerüste geimpft, um die Bioaktivität von VEGF bestimmen. HUVECs an den PD-IPC Gerüsten zeigte einen signifikanten Anstieg in Alamar Blau Reduktion und Stoffwechselaktivität im Vergleich zu Normal PD Gerüsten am Tag 1, was eine gute Erhaltung des VEGF-Funktion, nachdem sie von PD-IPC Gerüste (3B) freigegeben. Alamar Blau Reduktion an den Tagen 3, 6 und 7 verringert werden, um vergleichbare Ebenen mit der Ebene PD Gerüst (3B) zu erreichen.
Die PCL-IPC Verbund Gerüste wurden auch für die kontrollierte Freisetzung getestet und mit Standalone-IPC-Fasern. Wir eingebaut NGF als Vertreter Molekül in die PCL-IPC Verbundgerüste mit einer Einbaueffizienz von 66,38 ± 2,71%. PCL-IPC Verbund Gerüste zeigten Liniear verzögerter Freisetzung und etwa 80% kumulative Freisetzung nach 18 Tagen (4A). Auf der anderen Seite, IPC eigenständige Faser zeigte eine 70% Burst Release innerhalb von 24 Stunden, gefolgt von einer stagnierenden Freisetzungsrate. Verwendung einer PC12 Neuritenwachstum Assay untersuchten wir die Bioaktivität des frei NGF (4B). Das Neuritenwachstum von PC12-Zellen auf PCL-IPC Verbundgerüst Mitteilung Medien gezüchtet zeigten ähnliche Ebenen mit PC12-Zellen in 30 ng / ml NGF ergänzt Medien. Dies zeigt, dass das freigesetzte NGF blieb bioaktiven für mindestens 7 Tage.
Kombination von Topografie und anhaltende Wachstumsfaktor Lieferung kann die zelluläre Mikroumgebung besser zu imitieren. Die vielseitige Methode von PCL-IPC Herstellung erlaubt die Herstellung eines biochemically- topographisch gesteuerte Verbundgerüst. Wir fabriziert einen PCL-IPC Verbundgerüst mit Nano-Gitter-Struktur (NP-PCL-IPC Gerüst). Wir beobachteten die synergistische effect von Topographie und anhalt NGF-Freisetzung durch die Bewertung der neuronalen Differenzierung von humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs) (Abbildung 5). hMSCs auf die NP-PCL-IPC Verbund Gerüsten kultiviert zeigten höhere Expression des Mikrotubulus-assoziiertes Protein 2 (MAP2), was auf die neuronale Differenzierung. Auf der anderen Seite, war MAP2-Proteinexpression in hMSCs auf PCL-IPC mit nur NGF Mitteilung oder gemusterten PCL (NP-PCL) kultiviert wesentlich niedriger.
Figur 1. Der Einbau von IPC Fasern in hydrophile und hydrophobe Gerüsten. (A) Zeichnung IPC Fasern an der Schnittstelle positiv (Chitosan) und negativ (Alginat) geladenen Polyelektrolyten Lösungen. (B) Schematische Darstellung Einbau IPC Fasern in hydrophilen PD-Lösung auf PD-IPC composit erstellen e Schafott. (C) Schematische Darstellung Einbau IPC Fasern in hydrophoben PCL Gerüst PCL-IPC erstellen Verbundgerüst. Diese Zahl wird von Cutiongco et al. Angepasst, 2014 7 Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Die kontrollierte Freisetzung von BSA von PD-IPC Verbundgerüst. BSA wurde in PD-IPC Verbundgerüste eingebaut und seine Freilassung wurde zu verschiedenen Zeitpunkten mit BCA-Assay gemessen. Kumulative BSA freigesetzt wird als Prozentsatz der Gesamtmenge an BSA (in & mgr; g) in der IPC-Fasern eingearbeitet und dienen als mittlere Prozentsatz ± Standardabweichung. Diese Zahl wird von Cutiongco et al angepasst. 2014. 7/www.jove.com/files/ftp_upload/53079/53079fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Die kontrollierte Freisetzung und Bioaktivität von VEGF von PD-IPC Verbundgerüst. (A) Kumulierter Freisetzungsprofil von VEGF von PD-IPC Verbund Gerüste. VEGF-Freisetzung wurde zu verschiedenen Zeitpunkten unter Verwendung von ELISA spezifisch für VEGF gemessen. (B) Zelllebensfähigkeit von Endothelzellen auf PD-IPC Verbund Gerüsten gezüchtet, wie von Alamar Blau Stoffwechseltest gemessen. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung von Einweg-ANOVA mit Tukey-post-hoc-Test. * Zeigt p <0,05. Diese Zahl wird von Cutiongco et al angepasst. 2014 7 Klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen von dieser Figur.
Abbildung 4. Die kontrollierte Freisetzung und Bioaktivität von NGF von PCL-IPC Verbundgerüst. (A) Kumulierter Freisetzungsprofil von NGF von PCL-IPC Verbund Gerüste. NGF-Freisetzung wurde zu verschiedenen Zeitpunkten unter Verwendung von ELISA spezifisch für NGF gemessen. Insert zeigt kumulative Freisetzungsprofil von NGF von PCL-IPC Gerüst für die ersten 8 Std. (B) Bioaktivität von NGF durch Auswachsen von neuronalen PC12-Zellen gemessen. PC12 Auswuchs wurde durch Bildanalyse gemessen. Diese Zahl wird von Teo et al. Angepasst, 2014. 2 Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 5. Differenzierung von hMSC auf NP-PCL-IPC Gerüst. Die konfokale Scanning-Mikroskopie Bild von hMSC kultiviert auf verschiedenen Verbund Gerüste. (A) NP-PCL-IPC, (B) NP-PCL, (C) PCL-IPC, (D) Pristine PCL Gerüste. Grüner Fleck bezeichnet MAP2, einen neuronalen Linienmarker. Rote Fleck bezeichnet F-Actin, welche die zelluläre Zytoskelett. Bläue bezeichnet den Kern. Diese Zahl wird von Teo et al. Angepasst, 2014. 2 Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1. Eigenschaften von Biochemikalien für die kontrollierte Freisetzung von Verbund IPC Gerüste verwendet.
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Discussion
IPC Fasern durch die Interaktion von zwei entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyten gebildet sind. Das Verfahren nutzt die Gewinnung des Komplexes aus der Schnittstelle der Polyelektrolyte, einen Selbstorganisationsprozess für stabile Faserbildung erleichtert wird. Der Mechanismus der IPC Faserbildung sorgt dafür, dass jedes Biomolekül ergänzt in einen ähnlich geladenen Polyelektrolyten während der Komplexbildung eingearbeitet werden. 10,11 umge Zugabe eines Biomoleküls in die entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyten in momentanen Ausfällung führen. Das einfache Herstellungsmethode für IPC Fasern verleiht Vielseitigkeit in die verschiedene biologische Materialien wie Zellen, Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen. Diese kritische Merkmal der IPC-Fasern wurde auch in beiden PD-IPC und PCL-IPC Verbund Gerüste, in denen Wachstumsfaktoren mit unterschiedlichen physikalischen und molekularbiologischen Eigenschaften (Ladung und Molekulargewicht) wurden mit hoher Effizienz einge beobachtet. In contrast, kann Verkapselungseffizienz mit Mikrokügelchen Methoden für VEGF und NGF so günstig wie 16% 6 und 8% 13 ist, auf.
Sowohl PD-IPC und PCL-IPC Gerüste auch gezeigt, zeitliche Steuerung der Biomolekül-Release. VEGF von PD-IPC Gerüste zeigten lineare Freisetzung für mindestens 7 Tage. Im Gegensatz dazu berichteten VEGF Freisetzungsprofile von polymeren Mikrokügelchen zeigte einen anfänglichen Ausbruch Mitteilung innerhalb von 24 Stunden, die Freigabe von mindestens 60% des Gesamt VEGF Inhalt. 5,14,15 Ebenso NGF wurde gezeigt, dass Wachstumsfaktor Lieferung von PCL-IPC erlitten haben Gerüste, während andere Polymerbasis Wachstumsfaktor-Delivery-Systeme zeigen eine Hochebene der Release 20 Tagen nach Veröffentlichung. 13,16 Vermutlich die verschiedenen Komponenten der Verbund Gerüste beide zur Wachstumsfaktor Freisetzungskinetik. Polymer Relaxationsmechanismen, Porosität und Tortuosität kann die Freisetzung von hydrophilen Biomoleküle stark beeinflussen. 17 Darüber hinaus ist die chemische Eigenschaften des Polymergerüst kann elektrostatische Anziehung und Abstoßung in Richtung der Wachstumsfaktoren, die Biomolekül-Release beeinflußt. Somit sind die Eigenschaften des polymeren Gerüsts entscheidend dafür Freisetzungsprofile und Biomolekülen mit zeitlich gesteuerten Freisetzung. Zum Beispiel, während die PD Gerüst zeigte nahezu lineare BSA Release, eine ähnliche Verbundgerüst unter Verwendung von Poly (vinylalkohol) Hydrogel fehlte Permeabilität für BSA. 18 polymeren Gerüsten, die in Kombination mit dem IPC-Fasern verwendet werden können, erfordern Vorversuche auf ihre Durchlässigkeit zu bestimmen Angebot.
Neben der kontrollierten Freisetzung biochemischer, ist die Fähigkeit, die Bioaktivität von Wachstumsfaktoren zu behalten ein wichtiges Merkmal für jedes Biomolekül-Abgabesystem. Die harte alkalischen Milieu des PD-Lösung und der Gegenwart von organischen Lösungsmittel in DCM PCL das Potential haben, um jede Art von Biomolekülen verschlechtern. Zum Beispiel, strukturiert Lieferung system das Dichlormethan verwendet zeigte einen konsistenten Trend der abnehm Bioaktivität mit zunehmender Zeitpunkt infolge des Abbaus von NGF. 16. Gleichwohl haben wir festgestellt, daß die Bioaktivität von VEGF und NGF beibehalten wird, weiter bekräftigt, dass ein wesentlicher Vorteil der IPC Fasern innerhalb des Verbund assimiliert Gerüste.
Die Verwendung einer Opfer biokompatible Polysaccharid oder Polymerrahmen, der leicht in die Masse eingearbeitet werden können Gerüst verleiht die Vielseitigkeit, ein Verbundgerüst mit mehreren IPC Fasern in verschiedenen Konfigurationen ausgerichtet zu erstellen. 7 ist es somit notwendig, daß die polymeren Gerüste anzuwendenden mit IPC-Fasern haben die Kapazität für weitere Assimilation in einem Bulk-Gerüst. Die Assimilation ist in IPC-Fasern vollständig eingebettet in die Polymer-Gerüst wichtig. Wir haben beobachtet, dieses Phänomen in der Opfer Pullulan und PCL Rahmen, die beide leicht in dem Lösungsmittel des Schütt PD oder gelöstPCL Schafott. Weiterhin sind die Ein-Schritt-Verfahren zur Herstellung und IPC Biomolekül Einbau eine größere Flexibilität für die Anzahl von Biomolekülen, die durch eine einzelne Verbundgerüst zugeführt werden kann. Die Einfachheit der Methodik erlaubt auch die Feinabstimmung der Einbaueffizienz und Freisetzungskinetik durch Ändern Polyelektrolyt Identität oder Konzentration. Die natürliche Polyelektrolyten Chitosan und Alginat wurden aufgrund ihrer hohen Ladungsdichte und Ähnlichkeit mit verschiedenen ECM Kohlenhydraten in Tiergeweben verwendet. Doch methyliertem Kollagen und Terpolymer 8,19 oder Chitin und Alginat 20 kann auch für IPC Faserbildung zu unterschiedlichen Effekten verwendet werden. Mehrere IPC Fasern freigesetzt verschiedene biochemische Signale mit unterschiedlichen Kinetiken können auch erreicht werden, um eine multifunktionale Verbundgerüst zu erzeugen. Zum Beispiel kann die extrazelluläre Matrixproteine wie Fibronektin in IPC Fasern beladen eine Plattform für räumlich kontrollierte Zelladhäsion bereitzustellen. 7 AnhaltFreisetzung von Antibiotika und Wachstumsfaktoren sind auch für die Geweberegeneration Anwendungen wünschenswert. Dies kann durch Verwendung von PCL-IPC, die hydrophobe, niedermolekularen Substanzen und hydrophile, auf Protein basierenden Wachstumsfaktoren in verschiedenen Kompartimenten der Verbundgerüst integrieren können möglich sein. 2
Unsere stellte Methodik erlaubt auch die Herstellung eines Gerüsts mit sowohl topographische und biochemische Signale. Wir beobachteten, dass der NP-PCL-IPC Gerüst hatte die höchste Steigerung der hMSC Differenzierung in neuronalen Linie, was bedeutet, dass die Nachahmung mehrere Aspekte der biophysikalische und biochemische zelluläre Nische ist von Vorteil bei der Steuerung des Zellverhaltens. Die Leichtigkeit des stellte Methodik ermöglicht ihre Anwendung auf andere strukturierbare Polymersystemen wie Polyacrylamid 21 oder Polyethylenglykol 22, vorausgesetzt, dass der Vernetzungsprozess wird nicht signifikant beeinflusst IPC Faserintegrität. So wurden zum Beispiel PD Gerüste chOsen in dieser Studie für seine einzigartige Vernetzungsmechanismus, der in der Umgebungs wässrigen Bedingungen stattfindet. 24. Dies kann potentiell mehrere physiologisch relevanten Substrate für in vitro und in vivo-Studien. Darüber hinaus kann die Einbettung IPC Fasern in einem Verbundgerüst der Mangel an mechanischer Festigkeit IPC Fasern 23 durch Bereitstellen Zugfestigkeit überwinden. In der Tat, PCL 25 wurde für seine hohe mechanische Festigkeit gewählt.
Zusammenfassend wurde eine einfache Methode für die Erstellung von Composite-Gerüste für Biomolekül Liefer beschrieben. Wir haben gezeigt, wie IPC Fasern können für verzögerte Freisetzung von Biomolekülen, ohne seine biologische Aktivität und die Einbaueffizienz eingesetzt werden. Wir haben gezeigt, dies durch die Schaffung Verbundgerüste mit zwei Varianten: PD-IPC und PCL-IPC Gerüste. Anwendbarkeit IPC Fasern ist nicht auf den Einbau in PD- und PCL-basierten organischen beschränkt, sondern kann möglicherweise zu anderen Polymersystemen verlängert werdenund anderen Biomolekülen zu liefern.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Singapore National Research Foundation von einem seiner Research Centers of Excellence, die Mechanobiologie Institute, Singapur verabreicht unterstützt. MFAC wird von der Agentur für Wissenschaft, Technologie und Forschung (Singapur) und Nationalen Forschungsagentur (Frankreich) gemeinsame Programm unter Projektnummer 1122703037. Bkkt wird durch die Mechanobiologie Institute unterstützt unterstützt. Wir danken Herrn Daniel Wong HC für das Korrekturlesen des Manuskripts und Frau Morgendämmerung JH Neo zur Unterstützung bei der Videoproduktion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pullulan | Hayashibara Inc Okayama Japan | Molecular weight (MW) 200 kDa. This material is pharmaceutical grade pullulan used to make pullulan frames and PD-IPC scaffolds. | |
| Dextran | Sigma Aldrich | D1037 | MW 500 kDa. This material is no longer being produced by Sigma Aldrich. Alternative suggested is catalog number 31392 (Sigma Aldrich). This material is used to make PD-IPC scaffolds. |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | Sodium bicarbonate must be slowly added to the pullulan-dextran polysaccharide solution. Rapid addition of sodium bicarbonate will result in precipitation. |
| Sodium Trimetaphosphate | Sigma Aldrich | T5508 | This chemical is hygroscopic and must be stored in the dehumidifying cabinet. Aqueous solution of sodium trimetaphosphate must always be made fresh. |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | This material is hazardous and must be handled with proper protective equipment such as nitrile gloves. |
| Chitosan | Sigma Aldrich | 448877 | MW 190-310 kDa. Acetylation degree of 75% to 85%. Purification of chitosan is required to create stable IPC fibers. |
| Acetic Acid | Merck | This can be replaced by another brand type. This material is corrosive and flammable. Protective equipment such as face shield, nitrile gloves, lab coat and shoe cover must be worn when handling this chemical in the fume hood. | |
| Alginic acid sodium salt from brown algae, low viscosity | Sigma Aldrich | A2158 | Dissolve in water overnight. Filter through sterile 0.2 µm syringe filter before use. Store at 4 °C. |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent | Dissolve in sterile PBS and filter using 0.2 µm syringe filter before use. | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | This kit was used to measure BSA release from PD-IPC scaffolds. |
| Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor | R&D systems | 293-VE | Dissolve growth factor in 0.2% heparin solution to a final concentration of 5 mg/ml. |
| Heparin Sodium Salt From Porcine | Sigma Aldrich | H3393 | This can be replaced by another brand type. Dissolve heparin salt in sterile water at a final concentration of 1% and filter through 0.2 µm syringe filter before use. |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Lonza | C2517A | This primary cell type was used in the assay to determine VEGF bioactivity after release from PD-IPC scaffolds. |
| Alamar blue | Life Technologies | DAL1025 | This is used to measure cell metabolic activity. Incubate Alamar blue with cells and maintain in standard cell culture conditions for 2 to 4 hours. Measure absorbance at 570 nm to determine Alamar blue percent reduction, which is correlated to the cell activity. |
| ScanVac Coolsafe Lyophilizer | Labogene | 7.001.200.060 | This is a non-programmable freeze dryer that operates at -105 to -110 °C. This can be replaced by other standard lab lyophilizers. |
| Polycaprolactone (PCL) | Sigma Aldrich | 181609 | MW 65 kDa. This is no longer being manufactured by Sigma Aldrich. This can be replaced by Sigma Aldrich catalog number 704105. |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | V800151 | This can be replaced by another brand type. This material is hazardous and must be handled in the fume hood. Protective equipment must be worn at all times when handling this chemical. |
| Polydimethylsiloxane (PDMS; 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow Corning | (240)4019862 | The elastomer kit comes with polymer base and crosslinker. Mixing the polymer base and crosslinker in different ratios will result in different stiffness of the PDMS. |
| Human Recombinant Beta-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D systems | 256-GF | Reconstituted in sterile DI water to a final concentration of 100 µg/ml. Aliquot and store in -20 °C until use. |
| Human Mesenchymal Stem Cells (hMSC) | Cambrex | This cell type was used in the assay to determine synergistic effect of NGF and nanotopography. | |
| Rat PC12 Pheochromocytoma Cells | ATCC | This cell type was used in the neurite outgrowth assay to determine bioactivity of NGF. After exposure to release media with NGF, measure number of cells with neurite extensions and normalize to total number of cells. | |
| Grade 93 filter paper | Whatman | Z699675 | This is used for the purification of chitosan after its precipitation with sodium hydroxide at pH 7. |
| Swing bucket centrifuge | Eppendorf | 5810R | To be used during the purification of chitosan using 1,200 x g speed. |
| Motor with mandrel rotating at constant speed | Rhymebus | RM5E | The motor is used for the fabrication of IPC fibers on pullulan or PCL frame. |
| Phosphate buffered saline | FirstBase | Sterilize through filtration (0.2 µm filter) and autoclave. | |
| 10-mm diameter Tissue Culture Polystyrene Dish (TCPS) | Greiner | The TCPS dish is used for casting of pullulan frame. | |
| Human VEGF ELISA kit | R&D systems | DVE00 | The ELISA kit is used for detection of VEGF in the release medium. |
| Human NGF ELISA kit | R&D systems | DY256 | The ELISA kit is used for detection of NGF in the release medium. |
| Plastic Coated Adhesive Tape | Bel-Art | 9040336 | The adhesive tape is used to securely stick the alligator clip to the rotating mandrel |
References
- Annabi, N., Tamayol, A., et al. 25th Anniversary Article: Rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine. Adv. Mater. 26 (1), 85-124 (2014).
- Teo, B. K. K., Tan, G. D. S., Yim, E. K. F. The synergistic effect of nanotopography and sustained dual release of hydrophobic and hydrophilic neurotrophic factors on human mesenchymal stem cell neuronal lineage commitment. Tissue Eng. Part A. 20 (15-16), 2151-2161 (2014).
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