Protocol
高分子電解質溶液の調製
- 簡単に言えば。リャオらに詳述されるように、キトサンを精製し、グレード93濾紙を使用して、2％キトサンの1％（w / v）の溶液（v / v）の酢酸、真空フィルタを作成します。 pHは10分間1200×gで7遠心沈殿したキトサンに安定するまで5MのNaOHを使用して、ろ液を中和します。上清を除去し、キトサンを洗浄し、脱イオン水を加えます。遠心分離および洗浄工程をさらに2回繰り返します。 -80℃で析出したキトサンを凍結し、精製された形態を得るために、O / Nを凍結乾燥。除湿されたキャビネットに精製されたキトサンを保管してください。
- 無菌の組織培養皿に精製されたキトサン1gを量り分けます。生物学的安全キャビネット内のUVランプにできるだけ近い組織培養皿にキトサンを置き、15分間UV光にさらします。滅菌ピンセットを使用し、ガラス容器に滅菌キトサンを配置します。 0を使用して濾過し、キトサンを溶解します。（w / v）の0.5％と1％の間の最終濃度15M酢酸。
- アルギン酸ナトリウム塩を0.1gを秤量し、1％（w / v）の溶液を得、脱イオン（DDI）を蒸留水10mlに溶解します。完全な溶解を確実にするために、ボルテックスミキサー上に少なくとも2時間、アルギン酸ナトリウム塩を混ぜます。 0.2μmのシリンジフィルターを通してアルギン酸塩溶液をフィルタリングします。 4℃でのアルギン酸塩溶液を保管してください。
- 製造業者によって推奨されるように、神経成長因子（NGF）、 - 例えば、血管内皮増殖因子（VEGF）またはベータなどのヒト組換え増殖因子を再構成します。
IPC繊維の2デッサン
- 同様の正味の電荷を有する高分子電解質溶液の10〜20μlのアリコートに、タンパク質、成長因子または他の生体分子を混ぜます。正味の負電荷（例えば、ウシ血清アルブミン[BSA]）との生物学的分子は、アルギン酸塩溶液と混合されるべきです。正味の正電荷（例えば、VEGF）と生体分子と混合されるべきですキトサン溶液。
- パラフィルムで覆われている安定した平らな面にキトサンおよびアルギン酸塩の少量のアリコート（10〜20μl）を配置します。キトサンおよびアルギン酸塩の液滴が近接していないが、互いに接触して配置されるべきです。
- 軽くキトサンおよびアルギン酸液滴に鉗子のペアで各チップを浸します。鉗子をつまんで一緒に高分子電解質の液滴をもたらします。液滴が互いに接触すると、ゆっくりと2滴（ 図1A）の界面からIPC繊維を描画するために垂直上方鉗子を引きます。
- （セクション3と4を参照）、このような回転マンドレル上に固定された平らな高分子足場として集電体上に鉗子、上に描かれたIPCのファイバの端部を慎重に配置します。均一のとIPC繊維ビードレス形成を可能にするために10ミリメートル/秒の一定速度でマンドレルを回転させます。 IPC繊維の描画速度を増加させると、Incorporatedのバースト放出の原因となる、ビーズを形成します生化学的および早期ファイバ終端。10
- 取り込み効率を決定するために、残りのすべての液体が1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を500μlで希釈して、パラフィルム上に残さ集めます。 BCAの（BSAのための）アッセイ、（VEGFおよびNGFのための）ELISAまたは組み込まれた生体分子を検出するための適切なアッセイを介して残留物中のタンパク質または成長因子の含有量を測定します。
プルラン、デキストラン（PD）多糖類とIPC繊維の複合ヒドロゲル足場の3製作
- IPC繊維コレクションの犠牲プルランフレームを製作
- プルラン多糖を秤量し、20％（w / v）の水溶液を作成するために、蒸留脱イオン（DDI）水と混ぜます。均一性を確保するためにプルラン溶液O / Nを混ぜます。
- 直径10cmの組織培養ポリスチレン（TCPS）皿にプルラン溶液の15グラムをキャストします。 37℃でのプルラン溶液O / Nを乾燥させます。 7へのプルランフィルムをカット×7 mm角フレームミリ。
- プルラン、デキストラン多糖溶液を調製します
- DDI水中：（1比3）プルランおよびデキストラン多糖の30％（w / v）の溶液を作成します。多糖溶液の均一性を確保するために、O / Nを混ぜます。ゆっくりと（w / v）の20％の最終濃度を達成するために、多糖溶液に炭酸水素ナトリウムを追加。溶液の均一性を確保するために、O / Nを混ぜます。 4℃での多糖溶液を保管してください。
- プルランフレームにIPC繊維の収集
- ワニ口クリップを使用して犠牲プルランフレーム（3.1節）を貼り付けます。プラスチック被覆粘着テープを使用して、回転マンドレルの先端にワニ口クリップとプルラン枠を貼り付けます。 10ミリメートル/秒の一定速度で取り付けられたフレームと、マンドレルを回転させます。プルランフレームは、所望の方向で回転するマンドレル上に固定することができます。
- ピンセット（セクション1）とATTACを使用してIPC繊維を描きます時間回転プルランフレームにIPC繊維の描かれた終わり。一定速度でIPC繊維を描画します。 IPCファイバの終端に到達すると、RTでファイバ·オン·フレーム構築O / Nを乾燥させます。
- PDヒドロゲル足場にIPC繊維を埋め込みます
- プルラン、デキストラン溶液のすべてのグラムを架橋するために、ナトリウムトリメタホスフェート水溶液と100μlの10M水酸化ナトリウム（w / v）の11％の100μlを添加する。7 1〜2分間stirplateを用いて60 rpmで溶液を混合。トリメタリン酸ナトリウムおよび水酸化ナトリウムを添加した後、多糖類溶液は、ほとんどすぐに架橋します。 IPC繊維を完全に埋め込むための繊維·オン·フレーム構造物上に粘性多糖溶液を注ぎます。化学架橋複合足場（ 図1B）を形成するために30分間60℃で混合プルラン、デキストランIPC繊維（PD-IPC）をインキュベートします。
- 注意：ヒュームフードのステップ3.3.2を実行し、適切な保護エクイを使用酢酸等のpmentは腐食性、可燃性です。
- PD-IPC足場における細孔の形成を誘導するために、20分間、20％（w / v）の酢酸を全体足場を沈めます。
- 100rpmで振とうしながら5分間、1×PBSでPD-IPC足場を洗浄することにより未反応試薬を除去します。このステップを2回繰り返します。
- 過剰のPBSを除去し、直ちに-80°CO / NでPD-IPC足場を凍結。足場に任意の制御放出または生物活性アッセイに使用する前に少なくとも24時間を凍結乾燥。
PCLおよびIPC繊維の複合骨格の4製作
注意：ジクロロメタンは危険物です。ジクロロメタンを取り扱う際にヒュームフードや個人用保護具を使用します。
- 自然のままとパターン化PDMS基板を作成
- ソフトリソグラフィプロセスを使用して所望の寸法のTCPの一部を使用して、自然のままのポリジメチルシロキサン（PDMS）エラストマー基板を作成します。パットの作成希望の地形とテンプレートポリ（メチルメタクリレート）で、標準的なソフトリソグラフィ法を用いて、rned PDMS基板を12
- IPC繊維収集のための犠牲PCLフレームを製作
- PCLを秤量し、（w / v）の溶液を、0.9％を作成するために、ジクロロメタンに溶解します。 PDMS基板の各1cm 2の面積については、0.9％のPCL溶液500μlをドロップします。ジクロロメタン溶媒の全てが完全にドラフト内で蒸発することができます。所望の厚さに膜を厚くするために0.9％のPCLの鋳造プロセスを繰り返します。 PDMS基板から乾燥PCLフィルムを取り外します。適切にサイズのパンチャーを使用してPCLフレームに穴を作成します。2
- PCLフレームにIPC繊維の収集
- ワニ口クリップで（4.2.1）から穴犠牲PCLフレームを貼り付けます。プラスチック被覆粘着テープを使用して、回転マンドレル上にワニ口クリップを貼り付けます。 PCL FRAMにIPC繊維の描かれた端を取り付け10ミリメートル/秒（セクション2）の一定速度で回転を開始する前に、E。 IPC繊維描画終了後、4℃での繊維·オン·フレーム構造物O / Nを乾燥させます。
- 埋め込み繊維·オン·フレームは、パターン化されたPCL基板内に構築します
- 必要に応じて、自然のままの、またはパターン化されたPCLベースを作成するために、PDMS基板上に0.9％のPCL溶液500μlをドロップします。所望の厚さの足場を得るために、0.9％のPCL溶液の複数の層をキャスト。ジクロロメタン溶媒の全てが完全にドラフト内で蒸発することができます。
- PCLベースの上に、繊維·オン·フレームの構築物（4.3.1）を配置します。所望の厚さを得るために複数回を構築するファイバ·オン·フレームの上に0.9％のPCL溶液を添加し、完全にPCL-IPC複合骨格（ 図1C）の製造、IPC繊維を埋め込 みます。
コンポジットIPC足場からの生物学的薬剤の放出5.測定
- 複合PD-IPCを置きますかPCL-IPC足場とスタンドアロンIPC繊維を別々に24ウェルプレート中。
- 足場を浸し、スタンドアローンIPC繊維を1×PBSを500μlと。 37℃でサンプルをインキュベートします。種々の時点（リリースメディア）でPBSを収集し、1×PBSを500μlと交換してください。
- 組み込まれた生体分子の累積放出プロフィールを計算するためにBCAアッセイ（BSA）、ELISA（VEGFおよびNGF）又は他の適切なアッセイを使用して、放出媒体中のタンパク質または成長因子の量を測定します。
コンポジットIPC足場上の細胞の6播種リリース生物学的薬剤の生物活性をテストします
- 少なくとも20分間、生物学的安全キャビネット内のUV光を用いて凍結乾燥したPD-IPCまたはPCL-IPC複合足場を滅菌します。
- 200μlの増殖培地中に2×10 5細胞の細胞懸濁液を得るために、標準的な細胞培養技術を使用します。複合足場の上に濃縮された細胞懸濁液をシード。 AFTER 20分、完全に足場を水没する増殖培地のトップアップボリューム。
- このようなアラマーブルー代謝活性アッセイ、PC12神経突起伸長アッセイまたは免疫蛍光などの標準的な技術を介して細胞活性を測定します。
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Representative Results
本稿では、様々な生体分子の持続放出のためのIPC繊維との複合足場を作成しようとしました。本研究で用いた生体分子の特性を表1に見出される。IPC繊維が最初PD-IPC複合足場（ 図1B）を作成するために、親水性PDヒドロゲル中に包埋しました。モデル分子BSAは、第1の被制御生体分子の放出のための複合足場を使用することの実現可能性を決定するために試験しました。 BSAは45±0.97パーセントの効率でPD-IPC足場に組み込まれました。 PD-IPDから放出されたBSAは、付随的定常状態が続く最初の弱毒化されたバースト放出（ 図2）とほぼリニア動態を示しました。 2ヶ月後、BSAは97％の全放出を達成しました。対照的に、スタンドアロンIPC繊維が4時間以内にBSAの80％の急速な放出を示しました。
次に、我々は、PD-IPCのscaffoを使用して、VEGFの放出プロファイルと生物活性をチェックLDS。 VEGFは、75.5±2.7％の効率で組み込まれ、少なくとも1週間（ 図3A）のための持続放出を示しました。ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）は、VEGFの生物活性を決定するために、PD-IPC足場に播種しました。 PD-IPC足場のHUVECを、PD-IPC足場（ 図3B）から放出された後、VEGF機能 の良好な保存を示す、1日目に、プレーンPD足場と比較して、アラマーブルー還元および代謝活性の有意な増加を示しました。 3日目、6及び7にアラマーブルーの減少は、プレーンPD足場（ 図3B）と匹敵するレベルを達成するために減少しました。
PCL-IPC複合足場はまた、制御放出のためにテストされ、スタンドアロンのIPC繊維と比較しました。私たちは、66.38±2.71パーセントの取り込み効率とPCL-IPC複合足場に代表分子としてNGFを組み込みました。 PCL-IPC複合足場はラインを示しましたAR徐放および18日（ 図4A）の後に約80％累積放出。一方、IPCスタンドアロン繊維が停滞放出速度が続く24時間以内に70％のバースト放出を示しました。 PC12神経突起伸長アッセイを用いて、放出さNGF（ 図4B）の生物活性を調べました。 PCL-IPC複合足場リリースメディア上に成長させたPC12細胞の神経突起伸長は、30 ngの中で培養したPC12細胞と同様のレベルを示した/ mlのNGFはメディアを補いました。これはリリースされ、NGFは、少なくとも7日間の生理活性のままであることを示しています。
地形と持続的な成長因子の送達の組み合わせは、より良い携帯微小環境を模倣し得ます。 PCL-IPC製造の汎用性の高い方法論はbiochemically-と地形的に制御された複合骨格の製造を可能にしました。我々は、ナノサイズの格子構造（NP-PCL-IPC足場）とPCL-IPC複合足場を作製しました。私たちは、相乗EFを観察しました地形のfectとは、ヒト間葉系幹細胞（hMSC）（ 図5）のニューロン分化を評価することによってNGF放出を持続しました。 NP-PCL-IPC複合足場上で培養したhMSCは、ニューロン分化を示す、微小管関連タンパク質2（MAP2）のより高い発現を示しました。一方、MAP2タンパク質の発現は、NGF放出またはパターンPCL（NP-PCL）とPCL-IPC上で培養したhMSCが実質的に低かったです。
親水性と疎水性の足場にIPC繊維の図1.設立。正に（キトサン）の界面でのIPCの繊維（A）の描画と負（アルギン酸）に帯電した高分子電解質溶液。 PD-IPCコンポジットを作成するために、親水性のPD溶液にIPC繊維の取り込みを示す（B）概略図 E足場。 （C）PCL-IPC複合足場を作成するために、疎水性PCL足場でIPC繊維の取り込みを示す模式図。この図は、Cutiongco らから適応され、2014年7は 、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
PD-IPC複合骨格。BSAとBSAの図2制御放出は、PD-IPC複合足場内に組み込まれ、その放出は、BCAアッセイを用いて種々の時点で測定しました。放出された累積BSAは、濃度（μgで）IPC繊維に組み込まれ、平均値±標準偏差の割合として提示されたBSAの総量の割合として提供されています。この図は、Cutiongco らから適応される。、2014年7/www.jove.com/files/ftp_upload/53079/53079fig2large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3.制御放出およびPD-IPC複合足場からのVEGFの生物活性。（A）PD-IPC複合足場からのVEGFの累積放出プロフィール。 VEGFの放出は、VEGFに対して特異的ELISAを用いて種々の時点で測定しました。 （B）アラマーブルー代謝のアッセイによって測定されるように、PD-IPC複合足場上で成長した内皮細胞の細胞生存率。統計分析はTukeyの事後検定を用いて、一方向ANOVAを用いて行きました。 * p <0.05を示します。この図は、Cutiongco らから適応される。、2014年7 拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図の。
図4.制御放出及びPCL-IPC複合足場からのNGFの生物活性。（A）PCL-IPC複合足場からのNGFの累積放出プロフィール。 NGFの放出は、NGFのための具体的なELISAを用いて種々の時点で測定しました。挿入は、最初の8時間PCL-IPCの足場からのNGFの累積放出プロフィールを示します。 PC12神経細胞の増殖によって測定される（B）NGFの生物活性。 PC12伸長を画像解析により測定しました。この図は、テオらから適応され、2014年2は、 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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NP-PCL-IPCの骨格上のhMSCの図5.分化。のhMSCの共焦点走査型顕微鏡画像は、異なる複合足場上で培養。 （A）NP-PCL-IPC、（B）NP-PCL、（C）PCL-IPC、（D）プリスティンPCL足場。グリーン染色は、MAP2、ニューロン系統のマーカーを意味します。赤色染色は、細胞の細胞骨格を示し、Fアクチンを示します。ブルー染色は、核を示します。この図は、テオらから適応され、2014年2は、 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
表複合IPC足場からの制御放出のために使用される生化学物質の1特徴。
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Discussion
IPC繊維は、2つの反対に帯電した高分子電解質との相互作用によって形成されます。プロセスが安定した繊維形成のための自己組織化プロセスを容易にする、高分子電解質の界面からの複合体の抽出を利用します。 IPCの繊維形成の機構は同様に荷電した高分子電解質に添加される任意の生体分子は、錯体形成プロセス中に組み込むことができることを保証する。10,11逆に、反対に荷電した高分子電解質中への生体分子の添加は、瞬間的な沈殿が生じます。 IPC繊維のための簡単な製造方法には、細胞、増殖因子および小分子などの様々な生物学的材料を組み込んで汎用性を貸します。 IPC繊維のこの重要な特徴は、異なる物理的および生体分子の性質（電荷および分子量）と成長因子を高い効率で取り込まれたPD-IPCとPCL-IPC複合足場の両方で観察されました。コントラでSTは、VEGFおよびNGFのためのマイクロスフェアの方法論を使用してカプセル化効率は、それぞれ、16％6および8〜13％と低くすることができます。
PD-IPCとPCL-IPC足場の両方はまた、生体分子の放出の時間的制御を実証しました。 PD-IPC足場からのVEGFは、少なくとも7日間の直線的な放出を示しました。対照的に、ポリマー微小球からのVEGFの放出プロファイルは、総VEGF含有量の少なくとも60％を放出し、24時間以内に初期バースト放出を示したと報告した。5,14,15同様に、NGFは、PCL-IPCからの成長因子の送達を持続していることが示されました足場は、他のポリマーベースの成長因子送達システムはリリースの20日からの放出のプラトーを示している。13,16はおそらく、複合足場の異なるコンポーネントは、両方の成長因子放出動力学に貢献しています。ポリマー緩和機構は、気孔率及びねじれを大幅に親水性の生体分子の放出に影響を与えることができる。17また、Cを高分子足場のhemical特性は、生体分子の放出に影響する成長因子に向けて静電引力と反発力を有していてもよいです。このように、高分子足場の特性が時間的に制御された放出を有する放出プロファイルおよび生体分子を決定する上で重要です。 PDの足場は、ポリ（ビニルアルコール）を用いて同様の複合骨格をほぼリニアBSAの放出を示した例では、ヒドロゲルは、BSAに透過性を欠いていた。IPC繊維と組み合わせて使用することができる18ポリマー足場は、その浸 透性を決定するために予備試験を必要とするかもしれません範囲。
制御された生化学的な放出に加えて、成長因子の生物活性を保持する能力は、任意の生体分子の送達システムのための重要な特徴です。 PD液の過酷なアルカリ性環境とPCLのDCM中の有機溶媒の存在は、生体分子の任意の並べ替えを劣化する可能性があります。例えば、ミクロスフェア送達のジクロロメタンを使用ystem起因NGFの劣化に時点の増加に伴って生物活性を減少させるの一貫した傾向を示した。16それにもかかわらず、我々は、VEGFおよびNGFの生物活性が維持されることが観察され、さらにIPC繊維の重要な利点は、複合材料内に同化されることを反復します足場。
簡単にバルク骨格に組み込むことができる犠牲、生体適合性の多糖またはポリマーフレームの使用は、異なる構成に整列複数のIPC繊維と複合骨格を生成する汎用性を与える。7従って、ポリマー足場を適用することが必要ですIPC繊維とバルク足場へのさらなる同化する能力を持っています。同化プロセスは完全に高分子足場にIPC繊維を埋め込むのに重要です。我々は、犠牲プルラン及びPCLフレームで、この現象を観察し、両方の簡単バルクPDの溶媒に溶解された又はPCL足場。また、IPCの製造および生体分子の取り込みのための単一工程の方法は、単一の複合骨格によって送達することができる生体分子の数に柔軟性を提供します。方法の単純さはまた、高分子電解質の同一性または濃度を変更することによって取り込み効率および放出速度の微調整を可能にします。天然高分子電解質キトサンとアルギン酸は、その高い電荷密度および動物組織中に見られる様々なECMの炭水化物との類似性に使用されました。しかし、メチル化コラーゲンおよびターポリマー8,19またはキチンとアルギン酸塩20は、変化する効果にIPCの繊維形成のために使用することができます。異なる反応速度は、多機能性複合足場を作成するために達成することができるとともに、複数のIPC繊維は異なる生化学的手がかりをリリース。例えば、IPC繊維にロードフィブロネクチンなどの細胞外マトリックスタンパク質は、空間的に制御された細胞接着のためのプラットフォームを提供することができる。7持続抗生物質および増殖因子の放出は、組織再生用途のためにも望ましいです。これは、複合骨格の異なる区画に疎水性小分子薬物および親水性、タンパク質ベースの成長因子を組み込むことができるPCL-IPCを用いて可能である。2
私たちの提示方法も地形および生化学的手がかりの両方で足場の製造を可能にしました。我々は、NP-PCL-IPCの足場は生物物理学的および生化学的な細胞ニッチの複数の側面を模倣する細胞の挙動を導くのに有益であることを示唆し、神経系統へのhMSC分化の最高の増強を持っていたことを観察しました。提示方法の容易さは、ポリアクリルアミド21またはポリエチレングリコール22などの他のパターン化ポリマー系への適用を可能にする、架橋プロセスが大幅にIPC繊維整合性に影響しないことを提供しました。たとえば、PDの足場はCHました周囲及び水性条件で発生する独自の架橋メカニズムは、この研究でOSEN 24は、これが潜在的にそれ以上の生理学的インビトロおよびインビボ研究における関連する基板を提供することができます。また、複合骨格でIPC繊維を埋め込 むことは、引張強さを提供することにより、IPC繊維23の機械的強度の不足を克服することができます。実際に、PCL 25は 、高い機械的強度のために選択しました。
要約すると、生体分子の送達のための複合足場を作成するための簡単な方法を説明しました。我々は、その生物活性および取り込み効率を損なうことなく、生体分子の持続的送達のために使用することができる方法IPC繊維実証しました。 PD-IPCとPCL-IPC足場：我々は2つのバリエーションを有する複合足場を作成することでこれを示しました。 IPC繊維の適用は、PD-における取り込みおよびPCLベースの足場に限定されないが、潜在的に、他のポリマー系に拡張することができますおよび他の生体分子を提供します。
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Acknowledgments
この作品は、卓越性の研究センター、メカノ研究所、シンガポールのいずれかで投与シンガポール国立研究財団によってサポートされていました。 MFACは1122703037. BKKTがメカノ研究所によってサポートされている研究のための科学技術研究庁（シンガポール）と独立行政法人（フランス）プロジェクト番号の下での共同プログラムでサポートされています。私たちは、プルーフリーディングビデオ制作を支援するための原稿やさんドーンJHネオ氏ダニエル·HCウォンに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pullulan | Hayashibara Inc Okayama Japan | Molecular weight (MW) 200 kDa. This material is pharmaceutical grade pullulan used to make pullulan frames and PD-IPC scaffolds. | |
| Dextran | Sigma Aldrich | D1037 | MW 500 kDa. This material is no longer being produced by Sigma Aldrich. Alternative suggested is catalog number 31392 (Sigma Aldrich). This material is used to make PD-IPC scaffolds. |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | Sodium bicarbonate must be slowly added to the pullulan-dextran polysaccharide solution. Rapid addition of sodium bicarbonate will result in precipitation. |
| Sodium Trimetaphosphate | Sigma Aldrich | T5508 | This chemical is hygroscopic and must be stored in the dehumidifying cabinet. Aqueous solution of sodium trimetaphosphate must always be made fresh. |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | This material is hazardous and must be handled with proper protective equipment such as nitrile gloves. |
| Chitosan | Sigma Aldrich | 448877 | MW 190-310 kDa. Acetylation degree of 75% to 85%. Purification of chitosan is required to create stable IPC fibers. |
| Acetic Acid | Merck | This can be replaced by another brand type. This material is corrosive and flammable. Protective equipment such as face shield, nitrile gloves, lab coat and shoe cover must be worn when handling this chemical in the fume hood. | |
| Alginic acid sodium salt from brown algae, low viscosity | Sigma Aldrich | A2158 | Dissolve in water overnight. Filter through sterile 0.2 µm syringe filter before use. Store at 4 °C. |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent | Dissolve in sterile PBS and filter using 0.2 µm syringe filter before use. | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | This kit was used to measure BSA release from PD-IPC scaffolds. |
| Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor | R&D systems | 293-VE | Dissolve growth factor in 0.2% heparin solution to a final concentration of 5 mg/ml. |
| Heparin Sodium Salt From Porcine | Sigma Aldrich | H3393 | This can be replaced by another brand type. Dissolve heparin salt in sterile water at a final concentration of 1% and filter through 0.2 µm syringe filter before use. |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Lonza | C2517A | This primary cell type was used in the assay to determine VEGF bioactivity after release from PD-IPC scaffolds. |
| Alamar blue | Life Technologies | DAL1025 | This is used to measure cell metabolic activity. Incubate Alamar blue with cells and maintain in standard cell culture conditions for 2 to 4 hours. Measure absorbance at 570 nm to determine Alamar blue percent reduction, which is correlated to the cell activity. |
| ScanVac Coolsafe Lyophilizer | Labogene | 7.001.200.060 | This is a non-programmable freeze dryer that operates at -105 to -110 °C. This can be replaced by other standard lab lyophilizers. |
| Polycaprolactone (PCL) | Sigma Aldrich | 181609 | MW 65 kDa. This is no longer being manufactured by Sigma Aldrich. This can be replaced by Sigma Aldrich catalog number 704105. |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | V800151 | This can be replaced by another brand type. This material is hazardous and must be handled in the fume hood. Protective equipment must be worn at all times when handling this chemical. |
| Polydimethylsiloxane (PDMS; 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow Corning | (240)4019862 | The elastomer kit comes with polymer base and crosslinker. Mixing the polymer base and crosslinker in different ratios will result in different stiffness of the PDMS. |
| Human Recombinant Beta-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D systems | 256-GF | Reconstituted in sterile DI water to a final concentration of 100 µg/ml. Aliquot and store in -20 °C until use. |
| Human Mesenchymal Stem Cells (hMSC) | Cambrex | This cell type was used in the assay to determine synergistic effect of NGF and nanotopography. | |
| Rat PC12 Pheochromocytoma Cells | ATCC | This cell type was used in the neurite outgrowth assay to determine bioactivity of NGF. After exposure to release media with NGF, measure number of cells with neurite extensions and normalize to total number of cells. | |
| Grade 93 filter paper | Whatman | Z699675 | This is used for the purification of chitosan after its precipitation with sodium hydroxide at pH 7. |
| Swing bucket centrifuge | Eppendorf | 5810R | To be used during the purification of chitosan using 1,200 x g speed. |
| Motor with mandrel rotating at constant speed | Rhymebus | RM5E | The motor is used for the fabrication of IPC fibers on pullulan or PCL frame. |
| Phosphate buffered saline | FirstBase | Sterilize through filtration (0.2 µm filter) and autoclave. | |
| 10-mm diameter Tissue Culture Polystyrene Dish (TCPS) | Greiner | The TCPS dish is used for casting of pullulan frame. | |
| Human VEGF ELISA kit | R&D systems | DVE00 | The ELISA kit is used for detection of VEGF in the release medium. |
| Human NGF ELISA kit | R&D systems | DY256 | The ELISA kit is used for detection of NGF in the release medium. |
| Plastic Coated Adhesive Tape | Bel-Art | 9040336 | The adhesive tape is used to securely stick the alligator clip to the rotating mandrel |
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