Protocol
1. Préparation des solutions de polyélectrolytes
- Purifier chitosane, comme détaillé dans Liao et al. En bref, créer une solution à 1% de chitosane dans 2% (p / v) (v / v) d'acide acétique et de vide filtre à l'aide de grade 93 papier filtre. Neutraliser le filtrat à l'aide de NaOH 5M jusqu'à ce que le pH est stabilisé à 7. Centrifuger la chitosane précipité à 1200 xg pendant 10 min. Décanter le surnageant et ajouter de l'eau déminéralisée pour laver le chitosane. Répéter l'étape de centrifugation et de lavage deux fois de plus. Congeler le chitosane précipité à -80 ° C et lyophilize O / N pour obtenir la forme purifiée. Stockez chitosane purifié dans une armoire déshumidifié.
- Peser 1 g de chitosane purifié dans une boîte de culture de tissu stérile. Placez le chitosane dans la boîte de culture de tissu le plus près possible de la lampe UV dans l'enceinte de sécurité biologique et d'exposer à la lumière UV pendant 15 minutes. En utilisant des pinces stériles, placer le chitosane stérilisé dans un récipient en verre. Dissoudre chitosane en utilisant filtré 0.Acide acétique 15 M à une concentration finale comprise entre 0,5% et 1% (p / v).
- Peser 0,1 g de sel de sodium de l'acide alginique et dissoudre dans 10 ml d'eau distillée désionisée (DDI) pour obtenir une eau 1% (p / v). Mélanger le sel de sodium de l'acide alginique pendant au moins 2 heures sur le mélangeur vortex pour garantir une dissolution complète. Filtrer la solution d'alginate à travers le filtre de seringue de 0,2 um. Conserver la solution d'alginate à 4 ° C.
- Reconstituer les facteurs humains recombinants de croissance comme facteur de croissance vasculaire endothéliale (VEGF) ou bêta - facteur de croissance nerveuse (NGF), tel que recommandé par le fabricant.
2. Dessin de fibres de la CIB
- Mélanger les protéines, les facteurs de croissance ou d'autres biomolécules dans 10-20 pl aliquote de la solution de polyélectrolyte qui a une charge nette similaire. Les molécules biologiques avec charge négative (par exemple sérum-albumine bovine [BSA]) net doivent être mélangés avec une solution d'alginate. Les molécules biologiques avec charge nette positive (par exemple VEGF) doivent être mélangés avecsolution de chitosane.
- Placez petites portions (10-20 pi) de chitosane et d'alginate sur une surface plane et stable recouverte avec du parafilm. Les gouttelettes d'alginate et de chitosane doit être placé à proximité mais pas en contact les uns avec les autres.
- Tremper légèrement chaque astuce sur une paire de pinces dans les chitosane et alginate gouttelettes. Apportez les gouttelettes de polyélectrolytes ensemble en pinçant les forceps. Lorsque les gouttelettes entrent en contact les uns avec les autres, tirer lentement la pince verticalement vers le haut pour tirer la fibre IPC de l'interface des deux gouttelettes (figure 1A).
- Placez soigneusement l'extrémité de la fibre IPC tiré sur la pince sur un collecteur, comme un échafaudage polymère plat apposé sur un mandrin en rotation (voir la section 3 et 4). Tournez le mandrin à une vitesse fixe de 10 mm / s pour permettre la formation d'uniforme et sans bourrelet fibres de la CIB. L'augmentation de la vitesse de l'étirage des fibres IPC former des billes, ce qui entraînera une libération d'éclatement de incorporéterminaison de fibre biochimique et prématurée. 10
- Pour déterminer l'efficacité d'incorporation, de recueillir tous les liquides restants laissés sur le parafilm par dilution avec 500 pi de 1X tampon phosphate salin (PBS). Mesurer la teneur en protéine ou facteur de croissance dans le résidu par dosage BCA (pour BSA), ELISA (pour le VEGF et NGF) ou un test permettant de détecter les biomolécules incorporé.
3. La fabrication de composite hydrogel échafaudage de Pullulan-Dextran (PD) polysaccharide et fibres de la CIB
- Fabrication cadre de pullulane sacrificielle pour la collecte des fibres IPC
- Peser polysaccharide pullulane et mélanger avec distillée déminéralisée (DDI) de l'eau pour créer un 20% (p / v) solution aqueuse. Mélanger la solution de pullulane O / N pour assurer l'homogénéité.
- Cast 15 g de solution de pullulane dans un 10 cm de culture de tissu à diamètre polystyrène (TCPS) plat. Sécher la solution de pullulane O / N à 37 ° C. Couper les films de pullulane dans 7mm x 7 mm cadres carrés.
- Préparer une solution de polysaccharide pullulane-dextran
- Créer une solution à 30% de polysaccharides pullulane et le dextrane (v / p) (rapport 3: 1) dans l'eau DDI. Mélanger O / N pour assurer l'homogénéité de la solution de polysaccharide. Ajouter lentement dans du bicarbonate de sodium à la solution de polysaccharide pour obtenir une concentration finale de 20% (p / v). Mélanger O / N pour assurer l'homogénéité de la solution. Conserver la solution de polysaccharide à 4 ° C.
- Collecte des fibres de la CIB sur le cadre pullulane
- Fixez le cadre de pullulane sacrificielle (section 3.1) en utilisant une pince crocodile. Collez la pince crocodile et le cadre pullulane sur la fin du mandrin en rotation à l'aide de ruban adhésif plastifié. Tournez le mandrin avec le cadre apposée à une vitesse constante de 10 mm / sec. Le cadre de pullulane peut être apposé sur le mandrin tournant dans les orientations souhaitées.
- Dessiner les fibres de la CIB en utilisant une paire de pinces (section 1) et attach l'extrémité tirée des fibres de la CIB sur le cadre pullulane rotation. Dessiner les fibres de la CIB à une vitesse constante. En arrivant à l'extrémité terminale de la fibre IPC, sécher la construction O fibres-sur-cadre / N à température ambiante.
- Incorporation des fibres dans la CIB en PD hydrogel échafaudage
- Pour chaque gramme de réticuler la solution de pullulane-dextrane, ajouter 100 ul de 11% (p / v) de sodium et le trimétaphosphate solution aqueuse d'hydroxyde 100 ul de sodium 10M. 7 Mélanger la solution à 60 tpm en utilisant une plaque d'agitation pendant de 1 à 2 min. Après l'addition de trimétaphosphate de sodium et l'hydroxyde de sodium, la solution de polysaccharide se réticuler presque immédiatement. Verser la solution de polysaccharide visqueux sur la construction des fibres-sur-cadre pour intégrer pleinement les fibres de la CIB. Incuber les fibres pullulane-dextran-IPC combinées (PD-CIP) à 60 ° C pendant 30 min pour former un chimiquement réticulés échafaudages composites (figure 1B).
- ATTENTION: Effectuer l'étape 3.3.2 dans la hotte et utiliser equi de protection appropriépement que l'acide acétique est corrosif et inflammable.
- Pour induire la formation de pores dans l'échafaudage PD-IPC, plonger l'ensemble échafaudage dans 20% (p / v) d'acide acétique pendant 20 min.
- Retirer réactifs ayant pas réagi par lavage échafaudages PD-IPC en 1X PBS pendant 5 min en agitant à 100 rpm. Répétez cette étape deux fois.
- Retirer l'excès de PBS et de geler immédiatement les échafaudages PD-IPC à -80 ° CO / N. Lyophiliser les échafaudages au moins 24 heures avant l'utilisation dans toute libération ou de la bioactivité des essais contrôlés.
4. La fabrication de composite échafaudage de PCL et fibres de la CIB
ATTENTION: Le dichlorométhane est une substance dangereuse. Utilisez la hotte et l'équipement de protection personnelle lors de la manipulation du dichlorométhane.
- Création vierges et motifs PDMS substrats
- Créer un polydiméthylsiloxane vierge (PDMS) substrat élastomère en utilisant un morceau de l'EPTC de dimension souhaitée à l'aide processus de lithographie douce. Créer patteRNED PDMS substrats en utilisant des méthodes lithographiques standards mous de poly (méthacrylate de méthyle) des modèles avec la topographie désirée. 12
- Fabrication cadre PCL sacrificielle pour la collecte des fibres IPC
- Peser PCL et dissoudre dans du dichlorométhane pour créer un 0,9% (p / v) de solution. Pour chaque 1 cm2 de surface du substrat PDMS, déposer 500 pi de solution de PCL à 0,9%. Laissez la totalité du solvant dichlorométhane pour évaporer pleinement à la hotte. Répéter le processus de coulée de 0,9% PCL pour épaissir le film à l'épaisseur désirée. Retirez le film PCL séchée du substrat PDMS. Créez un trou dans le cadre PCL utilisant un perforateur de taille appropriée. 2
- Collecte des fibres de la CIB sur le cadre PCL
- Apposer le cadre PCL sacrificielle avec le trou (de 4.2.1) sur une pince crocodile. Collez la pince crocodile sur le mandrin en rotation en utilisant du ruban adhésif plastifié. Attachez l'extrémité de la fibre tirée IPC sur le Fram PCLe avant de commencer la rotation à une vitesse constante de 10 mm / sec (section 2). Après la fin de l'IPC fibrage, sécher la fibre sur châssis construction O / N à 4 ° C.
- Intégration fibres sur châssis construire dans le substrat PCL motifs
- Déposez 500 pi de solution de PCL de 0,9% sur le substrat PDMS pour créer une base vierge PCL ou à motifs, comme l'exige. Fonte des couches multiples de solution de PCL à 0,9% pour obtenir un échafaudage à l'épaisseur souhaitée. Laissez la totalité du solvant dichlorométhane pour évaporer pleinement à la hotte.
- Placez la construction fibre sur-cadre (section 4.3.1) sur le dessus de la base PCL. Ajouter la solution de PCL de 0,9% sur les plusieurs fois en fibres-sur-cadre construire pour obtenir l'épaisseur désirée et intégrer pleinement les fibres de la CIB, la fabrication d'un échafaudage composite PCL-CIB (figure 1C).
5. Mesure de la dissémination d'agents biologiques Composite IPC échafaudages
- Placez composite PD-IPC ouÉchafaudages PCL-CIB et autonome fibres de la CIB séparément dans une plaque de 24 puits.
- Immerger l'échafaud et autonome fibres IPC avec 500 pi de PBS 1X. Incuber les échantillons à 37 ° C. Recueillir PBS à divers points de temps (la libération des médias) et les remplacer par 500 pi de PBS 1X.
- Mesurer la quantité de protéines ou de facteur de croissance dans les médias de libération en utilisant un dosage BCA (BSA), ELISA (VEGF et NGF) ou un autre dosage approprié de calculer le profil de libération cumulatif pour la biomolécule incorporé.
6. L'ensemencement des cellules sur les échafaudages composites IPC pour tester la bioactivité des agents biologiques libérés
- Stériliser les échafaudages composites lyophilisés PD-CIB ou PCL-IPC en utilisant la lumière UV dans l'enceinte de sécurité biologique pendant au moins 20 min.
- Utiliser des techniques de culture cellulaire standard pour obtenir une suspension de cellules de 2 x 10 5 cellules dans 200 ul de milieu de croissance. Ensemencer la suspension cellulaire concentrée sur les échafaudages composites. After 20 min, top-up le volume de milieu de croissance pour submerger totalement les échafaudages.
- Mesurer l'activité des cellules par des techniques classiques telles que l'activité métabolique bleu Alamar dosage, le dosage de l'excroissance des neurites PC12 ou immunofluorescence.
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Representative Results
Dans cet article, nous avons cherché à créer des échafaudages composites à fibres de la CIB pour la libération prolongée de diverses biomolécules. Caractéristiques des biomolécules utilisées dans cette étude sont présentés au tableau 1. Fibres de la CIB ont d'abord été intégrées dans un PD hydrogel hydrophile pour créer un échafaudage composite PD-CIB (figure 1B). molécule modèle BSA a été testé d'abord de déterminer la faisabilité d'utiliser un échafaudage composite pour la libération contrôlée de biomolécules. BSA a été incorporé dans les échafaudages PD-IPC avec une efficacité de 45 ± 0,97%. BSA libérée du PD-IPD a montré une cinétique quasi-linéaires avec une version atténuée de salve initiale suivie par un état stable concomitante (Figure 2). Après 2 mois, BSA a réalisé une libération totale de 97%. En revanche, les fibres de la CIB autonomes présentaient une libération rapide de 80% de BSA dans les 4 heures.
Ensuite, nous avons vérifié le profil de libération et la bioactivité du VEGF utilisant Scaffo PD-IPClds. VEGF a été constituée avec un rendement de 75,5 ± 2,7%, et a montré une libération prolongée pendant au moins 1 semaine (figure 3A). Ombilical des cellules endothéliales de veine humaines (HUVEC) ont été ensemencées sur les échafaudages de PD-IPC pour déterminer la bioactivité du VEGF. HUVECs sur les échafaudages de PD-IPC a montré une augmentation significative de la réduction Alamar bleu et l'activité métabolique par rapport aux échafaudages PD plaine au jour 1, indiquant une bonne préservation de la fonction de VEGF après avoir été libéré des échafaudages PD-CIB (figure 3B). Alamar réduction bleue à 3 jours, 6 et 7 a diminué pour atteindre des niveaux comparables avec le PD échafaudage brut (figure 3B).
Les échafaudages composites PCL-CIB ont également été testés pour la libération contrôlée et comparés avec des fibres de la CIB autonomes. Nous avons incorporé comme une molécule NGF représentant dans les échafaudages composites PCL-IPC avec une efficacité d'incorporation de 66,38 ± 2,71%. PCL-IPC échafaudages composites a montré lignelibération prolongée ar et environ 80% de libération cumulatif après 18 jours (figure 4A). D'autre part, l'IPC autonome fibres a montré une libération de rafale de 70% dans les 24 heures suivi par un taux de libération stagnante. L'utilisation d'un dosage de l'excroissance des neurites PC12, nous avons examiné l'activité biologique du NGF libéré (figure 4B). La croissance des neurites des cellules PC12 cultivées sur PCL-IPC échafaudage composite libération médias ont montré des niveaux similaires avec des cellules PC12 cultivées en 30 ng / ml de NGF complétée médias. Ceci indique que le NGF bioactive libérée est restée pendant au moins 7 jours.
Combinaison de la topographie et de la livraison du facteur de croissance soutenue peuvent imiter le microenvironnement cellulaire mieux. La méthodologie polyvalente de fabrication PCL-IPC a permis la fabrication d'un biochemically- et échafaudage composite topographiquement contrôlée. Nous avons fabriqué un échafaudage composite PCL-IPC avec grilles structure de nano-taille (NP-PCL-IPC échafaudage). Nous avons observé l'ef synergiquefet de la topographie et soutenue NGF libération en évaluant la différenciation neuronale des cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh) (Figure 5). CSMh cultivées sur les échafaudages composites NP-PCL-CIP ont montré une plus forte expression de la protéine associée aux microtubules 2 (MAP2), indicatif de la différenciation neuronale. D'autre part, MAP2 expression de la protéine était sensiblement inférieure dans CSMh cultivées sur PCL-IPC avec seulement la libération de NGF ou à motifs PCL (NP-PCL).
Figure 1. L'incorporation de fibres dans la CIB en échafaudages hydrophiles et hydrophobes. (A) Dessin de fibres de la CIB à l'interface de manière positive (chitosane) et négativement (alginate) des solutions de polyélectrolytes chargés. (B) Schéma montrant l'incorporation de fibres de la CIB dans une solution de PD hydrophile pour créer PD-IPC Composit e échafaud. (C) Schéma montrant l'incorporation de fibres de la CIB dans hydrophobe échafaudage PCL pour créer PCL-IPC échafaudage composite. Ce chiffre est adapté de Cutiongco et al., 2014. 7 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. La libération contrôlée de BSA du PD-IPC échafaudage composite. BSA a été incorporé dans PD-IPC échafaudages composites et sa sortie a été mesurée à divers points de temps en utilisant un dosage BCA. BSA libérée cumulative est fourni sous forme de pourcentage de la quantité totale de BSA (en pg) incorporé dans les fibres de la CIB et sont présentées en tant que pourcentage moyen ± écart-type. Ce chiffre est adapté de Cutiongco et al., 2014. 7/www.jove.com/files/ftp_upload/53079/53079fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. libération contrôlée et la bioactivité du VEGF de PD-IPC échafaudage composite. (A) profil de libération cumulatif de VEGF de PD-IPC échafaudages composites. Libération de VEGF a été mesurée à différents points de temps en utilisant ELISA spécifique pour le VEGF. (B) La viabilité cellulaire des cellules endothéliales cultivées sur des échafaudages PD-CIB composites, telle que mesurée par dosage d'Alamar blue métabolique. L'analyse statistique a été effectuée à l'aide d'une analyse de variance avec le test post-hoc de Tukey. * Indique p <0,05. Ce chiffre est adapté de Cutiongco et al., 2014. 7 S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4. libération contrôlée et la bioactivité du NGF de PCL-IPC échafaudage composite. (A) de profil de libération cumulatif de NGF de PCL-IPC échafaudages composites. NGF de presse a été mesurée à différents points de temps en utilisant ELISA spécifique pour NGF. Insérer montre le profil de libération cumulée de NGF de échafaudage PCL-CIB pour la 8 premières heures. (B) la bioactivité du NGF tel que mesuré par excroissance de cellules neurales PC12. PC12 excroissance a été mesurée par analyse d'image. Ce chiffre est adapté de Teo et al., 2014. 2 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 5. Différenciation des hMSC sur échafaudage NP-PCL-CIB. Image de microscopie confocale à balayage de hMSC cultivées sur différents échafaudages composites. (A) NP-PCL-IPC, (B) NP-PCL, (C) PCL-IPC, (D) des échafaudages PCL Pristine. Tache verte dénote MAP2, un marqueur de lignée neuronale. Tache rouge représente F-actine, montrant le cytosquelette cellulaire. Bleuissement désigne le noyau. Ce chiffre est adapté de Teo et al., 2014. 2 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 1. Caractéristiques des produits biochimiques utilisés pour la libération contrôlée d'échafaudages IPC composites.
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Discussion
IPC fibres sont formées par l'interaction de deux polyélectrolytes de charges opposées. Le procédé utilise l'extraction du complexe à partir de l'interface des polyélectrolytes, en facilitant un processus d'auto-assemblage pour la formation de fibres stable. Le mécanisme de formation de fibres IPC assure que toute biomolécule ajouté dans un polyélectrolyte chargé de manière similaire peut être incorporé au cours du procédé de complexation. 10,11 A l'inverse, l'addition d'une biomolécule dans le polyélectrolyte de charge opposée se traduira par précipitation instantanée. La méthode de fabrication simple pour fibres CIB prête polyvalence en incorporant divers matériaux biologiques tels que des cellules, des facteurs de croissance et de petites molécules. Cette caractéristique essentielle de fibres de la CIB a également été observée dans les deux les échafaudages composites PD-CIB et PCL-CIB, où les facteurs de croissance avec différentes propriétés physiques et biomoléculaires (charge et poids moléculaire) ont été incorporés avec une grande efficacité. En contrepartiest, l'efficacité d'encapsulation en utilisant des méthodologies de microsphères de VEGF et NGF peut être aussi bas que 16% 6 et 8%, respectivement 13.
Les deux PD-CIB et échafaudages PCL-CIB ont également démontré contrôle temporel de biomolécules de presse. VEGF d'échafaudages PD-CIB a montré une libération linéaire pendant au moins 7 jours. En revanche, ont rapporté des profils de libération de VEGF de microsphères polymères ont montré une libération d'explosion initiale dans les 24 heures, la libération d'au moins 60% de la teneur en VEGF totale. 5,14,15 même, NGF a été démontré avoir subi la livraison du facteur de croissance de la PCL-IPC échafaudages, tandis que d'autres systèmes d'administration de facteur de croissance basée polymères-montrent un plateau de presse à partir de 20 jours de diffusion. 13,16 Vraisemblablement, les différents composants des échafaudages composites contribuent à la fois facteur de croissance cinétique de libération. Mécanismes de relaxation polymère, la porosité et la tortuosité peuvent grandement affecter la libération de biomolécules hydrophiles. 17 En outre, la cCHIMIQUE caractéristiques de l'échafaudage polymère peuvent avoir attraction électrostatique et la répulsion à l'égard des facteurs de croissance qui affecte biomolécules libération. Ainsi, les caractéristiques de l'échafaudage polymère sont critiques dans la détermination de profils de libération et de biomolécules à libération contrôlée dans le temps. Par exemple, alors que l'échafaudage pour PD a montré libération de BSA quasi-linéaire, une matrice de support composite similaire en utilisant le poly (alcool vinylique) hydrogel manquait de perméabilité à la BSA. 18 échafaudages polymères qui peuvent être utilisés en combinaison avec des fibres IPC peut nécessiter des essais préliminaires pour déterminer sa perméabilité gamme.
En plus de la libération contrôlée biochimique, la capacité de conserver l'activité biologique de facteurs de croissance est une caractéristique importante de tout système de délivrance de biomolécule. Le milieu alcalin dur de la solution de PD et la présence de solvant organique dans du DCM PCL ont le potentiel de dégrader toute sorte de biomolécules. Par exemple, la livraison de microsphères système qui a utilisé du dichlorométhane a montré une tendance constante de diminuer avec l'augmentation de la bioactivité timepoint raison de la dégradation du NGF. 16 Néanmoins, nous avons observé que la bioactivité du NGF VEGF et est maintenue, réitérant en outre que un avantage clé de fibres de la CIB sont assimilés dans le composite échafaudages.
L'utilisation d'un polysaccharide biocompatible ou d'un cadre sacrificielle polymère qui peut être facilement incorporé dans l'échafaudage en vrac donne la polyvalence pour créer une matrice de support composite avec plusieurs fibres alignées CIB dans différentes configurations. 7 Ainsi, il est nécessaire que les échafaudages polymères à appliquer avec des fibres de la CIB avoir la capacité pour plus d'assimilation dans un échafaudage en vrac. Le processus d'assimilation est important dans l'intégration complète des fibres de la CIB dans le échafaudage polymère. Nous avons observé ce phénomène dans le pullulane et sacrificiel PCL trames, qui ont tous deux été facilement dissous dans le solvant de la PD en vrac ouÉchafaud PCL. En outre, la méthode en une seule étape pour IPC fabrication et biomolécules incorporation donne de la souplesse au nombre de biomolécules qui peuvent être livrés par un seul échafaudage composite. La simplicité de la méthode permet également de réglage fin de l'efficacité de l'incorporation et de la cinétique de libération en changeant l'identité de polyélectrolyte ou de concentration. Les polyélectrolytes naturels chitosane et de l'alginate ont été utilisés en raison de sa haute densité de charge et de la similarité de divers hydrates de carbone trouvés ECM dans les tissus animaux. Or, le collagène méthylé et 8,19 terpolymère ou la chitine et de l'alginate 20 peut également être utilisé pour la formation de fibres IPC à des effets variables. Plusieurs fibres libèrent CIB différents indices biochimiques avec des cinétiques différentes peuvent également être réalisés pour créer un échafaudage composite multi-fonctionnel. Par exemple, les protéines de la matrice extracellulaire comme la fibronectine chargés en fibres CIB peuvent fournir une plate-forme pour l'adhésion cellulaire contrôlée spatialement. 7 Sustainedlibération des antibiotiques et des facteurs de croissance sont également souhaitables pour des applications de régénération tissulaire. Cela peut être possible en utilisant PCL-IPC, qui peut incorporer hydrophobes, médicaments à petites molécules et, facteurs de croissance à base de protéines hydrophiles dans les différents compartiments de l'échafaudage composite. 2
Notre méthodologie présentée également permis la fabrication d'un échafaudage avec les deux repères topographiques et biochimiques. Nous avons constaté que l'échafaud NP-PCL-IPC avait la plus forte amélioration de la différenciation hMSC dans la lignée neuronale, ce qui implique que imitant multiples aspects de la niche cellulaire biophysique et biochimique est bénéfique à diriger le comportement des cellules. La facilité de la méthodologie présentée permet son application à d'autres systèmes polymères tels que le Polyacrylamide en motif ou le polyethylene glycol 21 22, à condition que le procédé de reticulation ne sera pas affecter de manière significative l'intégrité de la fibre CIB. Par exemple, échafaudages PD étaient chosen dans cette étude pour son mécanisme de réticulation unique qui se produit dans des conditions ambiantes et aqueuses. 24 Cela peut potentiellement fournir plus physiologiquement pertinents pour substrats in vitro et in vivo. En outre, l'incorporation des fibres de la CIB dans un échafaudage composite peut pallier le manque de résistance mécanique des fibres de la CIB en fournissant 23 résistance à la traction. En effet, PCL 25 a été choisi pour sa haute résistance mécanique.
En résumé, une méthode simple pour créer des échafaudages composites pour la livraison de biomolécules a été décrit. Nous avons démontré comment fibres IPC peut être utilisé pour la livraison soutenue de biomolécules sans compromettre sa bioactivité et l'efficacité d'incorporation. Nous avons montré cela en créant des échafaudages composites avec deux variations: PD-CIB et échafaudages PCL-CIB. Applicabilité de fibres IPC ne se limite pas à l'incorporation dans les PD et échafaudages à base de PCL, mais peut être potentiellement étendue à d'autres systèmes polymèreset pour fournir d'autres biomolécules.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le National Research Foundation de Singapour administré par l'un de ses centres de recherche d'excellence, l'Institut Mechanobiology, Singapour. MFAC est soutenu par l'Agence pour la science, la technologie et la recherche (Singapour) et l'Agence nationale pour la recherche (France) programme commun sous le numéro de projet 1122703037. BKKT est soutenu par l'Institut Mechanobiology. Nous remercions M. Daniel HC Wong pour la relecture du manuscrit et Mme Dawn JH Neo pour aider à la production vidéo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pullulan | Hayashibara Inc Okayama Japan | Molecular weight (MW) 200 kDa. This material is pharmaceutical grade pullulan used to make pullulan frames and PD-IPC scaffolds. | |
| Dextran | Sigma Aldrich | D1037 | MW 500 kDa. This material is no longer being produced by Sigma Aldrich. Alternative suggested is catalog number 31392 (Sigma Aldrich). This material is used to make PD-IPC scaffolds. |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | Sodium bicarbonate must be slowly added to the pullulan-dextran polysaccharide solution. Rapid addition of sodium bicarbonate will result in precipitation. |
| Sodium Trimetaphosphate | Sigma Aldrich | T5508 | This chemical is hygroscopic and must be stored in the dehumidifying cabinet. Aqueous solution of sodium trimetaphosphate must always be made fresh. |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | This material is hazardous and must be handled with proper protective equipment such as nitrile gloves. |
| Chitosan | Sigma Aldrich | 448877 | MW 190-310 kDa. Acetylation degree of 75% to 85%. Purification of chitosan is required to create stable IPC fibers. |
| Acetic Acid | Merck | This can be replaced by another brand type. This material is corrosive and flammable. Protective equipment such as face shield, nitrile gloves, lab coat and shoe cover must be worn when handling this chemical in the fume hood. | |
| Alginic acid sodium salt from brown algae, low viscosity | Sigma Aldrich | A2158 | Dissolve in water overnight. Filter through sterile 0.2 µm syringe filter before use. Store at 4 °C. |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent | Dissolve in sterile PBS and filter using 0.2 µm syringe filter before use. | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | This kit was used to measure BSA release from PD-IPC scaffolds. |
| Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor | R&D systems | 293-VE | Dissolve growth factor in 0.2% heparin solution to a final concentration of 5 mg/ml. |
| Heparin Sodium Salt From Porcine | Sigma Aldrich | H3393 | This can be replaced by another brand type. Dissolve heparin salt in sterile water at a final concentration of 1% and filter through 0.2 µm syringe filter before use. |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Lonza | C2517A | This primary cell type was used in the assay to determine VEGF bioactivity after release from PD-IPC scaffolds. |
| Alamar blue | Life Technologies | DAL1025 | This is used to measure cell metabolic activity. Incubate Alamar blue with cells and maintain in standard cell culture conditions for 2 to 4 hours. Measure absorbance at 570 nm to determine Alamar blue percent reduction, which is correlated to the cell activity. |
| ScanVac Coolsafe Lyophilizer | Labogene | 7.001.200.060 | This is a non-programmable freeze dryer that operates at -105 to -110 °C. This can be replaced by other standard lab lyophilizers. |
| Polycaprolactone (PCL) | Sigma Aldrich | 181609 | MW 65 kDa. This is no longer being manufactured by Sigma Aldrich. This can be replaced by Sigma Aldrich catalog number 704105. |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | V800151 | This can be replaced by another brand type. This material is hazardous and must be handled in the fume hood. Protective equipment must be worn at all times when handling this chemical. |
| Polydimethylsiloxane (PDMS; 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow Corning | (240)4019862 | The elastomer kit comes with polymer base and crosslinker. Mixing the polymer base and crosslinker in different ratios will result in different stiffness of the PDMS. |
| Human Recombinant Beta-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D systems | 256-GF | Reconstituted in sterile DI water to a final concentration of 100 µg/ml. Aliquot and store in -20 °C until use. |
| Human Mesenchymal Stem Cells (hMSC) | Cambrex | This cell type was used in the assay to determine synergistic effect of NGF and nanotopography. | |
| Rat PC12 Pheochromocytoma Cells | ATCC | This cell type was used in the neurite outgrowth assay to determine bioactivity of NGF. After exposure to release media with NGF, measure number of cells with neurite extensions and normalize to total number of cells. | |
| Grade 93 filter paper | Whatman | Z699675 | This is used for the purification of chitosan after its precipitation with sodium hydroxide at pH 7. |
| Swing bucket centrifuge | Eppendorf | 5810R | To be used during the purification of chitosan using 1,200 x g speed. |
| Motor with mandrel rotating at constant speed | Rhymebus | RM5E | The motor is used for the fabrication of IPC fibers on pullulan or PCL frame. |
| Phosphate buffered saline | FirstBase | Sterilize through filtration (0.2 µm filter) and autoclave. | |
| 10-mm diameter Tissue Culture Polystyrene Dish (TCPS) | Greiner | The TCPS dish is used for casting of pullulan frame. | |
| Human VEGF ELISA kit | R&D systems | DVE00 | The ELISA kit is used for detection of VEGF in the release medium. |
| Human NGF ELISA kit | R&D systems | DY256 | The ELISA kit is used for detection of NGF in the release medium. |
| Plastic Coated Adhesive Tape | Bel-Art | 9040336 | The adhesive tape is used to securely stick the alligator clip to the rotating mandrel |
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