التصوير متحد البؤر قياس التقلبات الكالسيوم داخل الهيولى العضلية شبكية من مثقف خلايا العضلات الملساء عن طريق الحنق المستندة إلى

Introduction

كاليفورنيا ²⁺ هو أيون المهم جدا وجدت في وفرة في كل خلية واحدة في الجسم. لها أدوار هامة في العديد من الوظائف الخلوية المختلفة، بما في ذلك النمو والانتشار، والهجرة، وموت الخلايا المبرمج ^1-4. ومن الثابت أن الكالسيوم ²⁺ يمكن أن تؤثر هذه العمليات سواء من خلال الإجراءات المباشرة وغير المباشرة، وبالتالي، يمكن أن التغييرات في تركيزات داخل الخلايا العادية من هذا أيون تؤدي بسهولة إلى نتائج سلبية على الخلايا المتضررة. يعتبر ريال كأكبر الكالسيوم داخل الخلايا ²⁺ مخزن داخل الخلية ^5. تتم المحافظة على مستوى الولاية ثابتة من الكالسيوم ²⁺ في كل من ريال والسيتوبلازم عادة من خلال تغير مستمر داخل وخارج كا ²⁺ -transporting قنوات هذه العضية. وترتبط ظروف ضاغطة المفروضة على الخلايا الناتجة عن أي شكل من أشكال الإصابة أو المرض عادة مع تغييرات كبيرة في ريال كا ²⁺ التي تذهب على أن يكون لها تأثيرات طويلة الأمد على أنهalth للخلية. في أشد الحالات، وعدم قدرة خلية أكد لاستعادة والحفاظ على حالة الاستقرار ريال كا ²⁺ مستويات قد تتوج حتى في الموت موت الخلايا المبرمج ^6-8.

الأبحاث الحالية إلى الخلوية الكالسيوم ²⁺ ديناميات محدودة بسبب حقيقة أن اختبار عدد قليل من الدراسات العضيم الكالسيوم ²⁺ المحتوى المخزن مباشرة ^9-11. الممارسة الأكثر شيوعا بدلا من ذلك ينطوي على قياس هيولي مستويات الكالسيوم ²⁺ كما القياسات غير المباشرة للتغيرات في ريال كا ²⁺ محتوى ^12-14. في هذه التجارب، كاليفورنيا ²⁺ التي يسببها عادة يتم الافراج عن ريال من خلال استخدام وكلاء الدوائية مما تسبب في استنزاف العضية (على سبيل المثال thapsigargin). ثم يتم استخلاص استنتاجات فيما يتعلق تغييرات على ريال كا ²⁺ على أساس التقلبات في هيولي تركيزات الكالسيوم ^2+. وعلى الرغم من القدرة المتبقية للمحققين لرسم هذه الاستنتاجات في أماه دوارnner، وهذه الطريقة من قياس ريال كا ²⁺ بشكل واضح بطريقة غير مباشرة إلى جمع مثل هذه المعلومات، مع الكثير من القيود المتعلقة بتفسير البيانات التي تم جمعها. من أجل تجاوز هذا القيد واضح، فمن الضروري لقياس كمية من الكالسيوم ²⁺ وجدت مباشرة داخل الشبكة اللمعية ريال.

حيوية في النتيجة النهائية لتكون قادرة على تسجيل مباشرة داخل اللمعة ريال مستويات الكالسيوم ²⁺ هي أدوات زراعة الخلايا ومؤشر الكالسيوم ²⁺ المستخدمة. للبيانات المشار إليها في المخطوطة الحالية، من المهم أن نلاحظ أن VSMCs المستخدمة جاءت من خط الخلايا المجمدة. كانت الخلايا المزروعة في المتوسط ​​التعديل النسر Dulbecco وفي (DMEM) + 10٪ مصل العجل (سي إس) عبر الممرات 22-26 لالتجارب المذكورة، المحتضنة في ثابت 37 درجة مئوية مع 5٪ CO ₂ العرض. باستخدام الطريقة الحالية، على سبيل المثال، قد نمت الخلايا بنجاح كبير على خليط من البروتين الذي يحاكي خارج الخليةالبيئة من العديد من أنواع مختلفة من الأنسجة ^(15). هام للنجاح على طول الوريد ريال كا ²⁺ البحث هو نوع من خليط من البروتين المستخدمة؛ في هذه الحالة، كانت منخفضة عامل النمو متنوعة اللازمة لتجنب مكونات هذه الأداة من التأثير على العادية الكالسيوم ²⁺ الإشارات والحركات التي تحدث باستمرار داخل الخلايا التي تم اختبارها. في أعقاب النمو الناجح للخلايا اختبار، ويجب أيضا أن قدم مؤشر الكالسيوم ²⁺ بفعالية لهذه الخلايا المستزرعة. وقد أصبح هذا ممكنا باستخدام ناقلات الفيروسة الغدانية الذي يحمل ²⁺ مؤشر D1SR الكالسيوم المقيمين ريال. لتحقيق الكفاءة ترنسفكأيشن عالية، ويجب أن تكون المحتضنة الخلايا مع ناقلات فيروسية ل36-48 ساعة على الأقل قبل التصوير. هذا المستحضر يوفر أداة موثوقة لقياس الكالسيوم ²⁺ العابرين داخل تجويف ريال مع دقة عالية والتكاثر.

مؤشر D1SR المستخدمة في هذا البروتوكول هو البديل معدلة من D1ER الكالسيوم ²⁺ طndicator الذي تم إنشاؤه في الأصل من قبل مختبر الدكتور روجر تسيان في جامعة كاليفورنيا، سان دييغو، الولايات المتحدة الأمريكية ^9،16. وD1ER الأصلي ينتمي إلى الجيل الثاني من المشفرة وراثيا مؤشرات الكالسيوم ²⁺ دعا cameleons التي تعرض الحساسيات الكالسيوم ²⁺ على نطاق أوسع من ذلك بكثير (0،5 حتي 160 ميكرومتر) بالمقارنة مع الكالسيوم ²⁺ المؤشرات السابقة ^9،16. وD1SR البديل الجديد، هدية عينية من الدكتور واين تشن (جامعة ألبرتا، كندا)، ومع ذلك، يحمل تسلسل كالسيكويسترين متحولة (بدلا من تسلسل calreticulin كما في D1ER الأصلي). وكالسيكويسترين متحولة وخفض ملزم لكا ²⁺ أن يلغي قضية تتنافس مع كالسيكويسترين الذاتية في الربط إلى الكالسيوم ²⁺ داخل التجويف ريال ^11. مؤشر D1SR يحمل اقتطاع تعزيز السماوي ببروتين (CFP) والبروتين أصفر فلوري (YFP) التي تربط بواسطة بروتين رابط يحتوي كالمودولين المعدلة (CAM) وM13 (رانه الببتيد 26 عاما بقايا من الميوسين كيناز ضوء سلسلة التي تربط لكام) متواليات. تم تعديل تسلسل كام M13 لمنع M13 من الربط إلى كالمودولين الذاتية. أيضا، لضمان الاحتفاظ ريال، تمت إضافة تسلسل كالسيكويسترين في نهاية 5'من CFP ^11. وعندما يرتبط الكالسيوم ^2+، يذهب المجال كام M13 من خلال التغييرات متعلق بتكوين التي تؤدي إلى زيادة في نقل الطاقة بين CFP المرافقة وYFP، والتي يتم تسجيلها على أنها زيادة في كثافة إشارة الحنق. من ناحية أخرى، عندما ينخفض ​​تركيز الكالسيوم ريال اللمعية ^2+، يذهب المجال كام M13 من خلال التغييرات متعلق بتكوين العكسية، مما أدى إلى انخفاض في نقل الطاقة بين CFP المرافقة وYFP، وانخفاض كبير في الحنق كثافة إشارة .

Protocol

بيان الأخلاق: أجريت جميع التجارب والإجراءات بالاتفاق مع المبادئ التوجيهية مختبر السلامة الأحيائية التابع لجامعة كولومبيا البريطانية في فانكوفر، كندا.

1. إعداد أطباق 35 ملم الثقافة زجاج القاع للمتحد البؤر المجهري القائم الحنق،

1. إعداد لوحات باستخدام ساعة الإجراء التالي 36-48 قبل التجارب.
2. استرداد اختيار خليط من البروتين هلامي و 0.25٪ التربسين-EDTA من -20 ° C التخزين والاحتفاظ بها في حمام الثلج المحمول حتى الاستخدام.
   ملاحظة: يجب أن تتعرض خليط من البروتين طلاء فقط لRT لفترة وجيزة من الوقت لمنع خليط من ترسيخ قبل الاستخدام. حل التربسين وينبغي أيضا إبقاء المبرد لحين الحاجة إليها. بدلا من ذلك، التربسين يمكن استرجاعها من -20 ° C التخزين بعد الانتهاء من الخطوة 1.5.
3. إعداد 1:25 التخفيف من خليط من البروتين: DMEM (أي مصل المضافة، برود). نقل حجم مناسب من البروتين / خليط DMEM إلى كل لوحة يجري إعدادها. لمدة 35 لوحات القاع الزجاجي ملم، إضافة ما يقرب من 200 ميكرولتر لتغطية كامل دائرة الزجاج الداخلية على الجزء السفلي من لوحة.
4. ترك لوحات على الجلوس لمدة 30 دقيقة على الأقل داخل مجلس الوزراء السلامة وفي RT. DMEM الدافئ مع 10٪ NCS إلى 37 درجة مئوية في حمام ماء خلال هذه الفترة الزمنية.
5. التربسين الحار في حمام مائي إلى 37 درجة مئوية قبل على الفور إلى الخطوات التالية.
6. إزالة DMEM حاليا في قارورة الثقافة باستخدام ماصة الزجاج والشفط. غسل أرضية قارورة مع دافئ برنامج تلفزيوني العقيمة لإزالة DMEM بقايا المتبقية.
7. طرد مثقف من قبل خلايا العضلات الملساء من أسفل القارورة:
   ملاحظة: تأسست قارورة يوما لهذه الخطوة للسماح للخلايا للوصول إلى confluency المطلوب (حوالي 80٪) قبل إعداد لوحة. وعلقت خلايا أصلا في قارورة في 20 مل من DMEM مع 10٪ NCS وحضنت عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO ₂ العرض لمدة 24 ساعة، وبعد ذلك كان DMEM العرض بالانتعاش وأعيدت الخلايا الحاضنة. تم تحديث DMEM عشيةراي 48 ساعة التالية هذه الخطوات الأولية حتى وصلت الخلايا confluency.
   1. غسل قارورة بسرعة مع 1 مل من التربسين ثم قم بإزالة 1 مل التربسين باستخدام الشفط.
   2. إضافة في 1 مل أخرى من التربسين ويترك لفترة أطول (حوالي 30-60 ثانية)، الحف قارورة لضمان انزيم يجعل الاتصال مع الجزء السفلي بأكمله من القارورة.
   3. لاحظ كم خلايا يكون فصل تحت المجهر حتى راض فصل من القارورة. بديل حل الحف التربسين والتحقق مفرزة الخلية حتى راض عن نسبة الخلايا فصل من القارورة.
      ملاحظة: يمكن إرجاع القارورة إلى حاضنة لحوالي 30-60 ثانية لتسريع هذه العملية عند 37 درجة مئوية.
   4. مرة واحدة وقد تم فكها الخلايا باستخدام التربسين، إضافة DMEM الطازجة مع 10٪ NCS إلى قارورة لوقف رد الفعل التربسين (حجم كاف بحيث يشكل التربسين 1/8 ^عشر من الحجم الكلي في قارورة).
      ملاحظة: على سبيل المثال، عند استخدام الثقافة قارورة 250 مل، وهذا من شأنهتضاف 7 مل DMEM إلى 1 مل من التربسين أن يؤدي إلى 8 مل من محلول الخلية.
8. نقل مما أدى حل الخلية من القارورة إلى (المسمى) 50 مل أنبوب مخروطي نظيف.
9. إضافة 1 مل DMEM جديدة بالإضافة إلى 10٪ NCS إلى كل لوحة يجري إعداد (المتوسطة يكفي لتستمر 24 ساعة).
10. عكس بلطف أنبوب يحتوي على حل الخلية عدة مرات لتفريق أي بيليه قد شكلت.
11. ماصة المطلوب حجم حل الخلية المختلطة بلطف في كل لوحة.
    ملاحظة: الموصى به عدد SMCS مطلي لهذا البروتوكول هو 0،5-0،8 × 10 ⁶ في 35 أطباق ثقافة ملم. قد تختلف هذه الأرقام اعتمادا على نوع من الخلايا، وينبغي أن يتم اختبارها وتعديلها من قبل كل مختبر.
12. دوامة كل لوحة بدقة في اتجاه عقارب الساعة / عكس اتجاه عقارب الساعة لضمان التوزيع العادل للخلايا عبر أسفل الزجاج.

2. عابر ترنسفكأيشن مع الفيروسة الغدانية المتجه حمل المؤشر D1SR الكالسيوم ²⁺

1. وبعد إضافة ليdium وحل الخلية إلى كل لوحة، وترك لوحات لاحتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO ₂ العرض لا يقل عن 1 ساعة للسماح للخلايا لإرفاق بشكل صحيح على الزجاج على الجزء السفلي من الأطباق. تحقق لوحات تحت المجهر في 15 دقيقة فترات حتى يتم إرفاق الخلايا بشكل واضح.
2. استرداد قسامة اتش-D1SR من -80 ° C التخزين والاحتفاظ بها في حمام الثلج المحمول لنقل لمجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
3. ماصة الجرعة المطلوبة (تعدد إصابة 100) من D1SR مبردة إلى كل لوحة.
   ملاحظة: حساب لحجم محلول الفيروسة الغدانية اللازمة لكل لوحة تعتمد على عيار الفيروس في محلول المخزون الأصلي، الذي يقدم بوصفه وحدة لوحة تشكيل (PFU). بناء على خبرتنا، ونحن نوصي وافر من العدوى (وزارة الداخلية) 100، التي يتم تفسيرها كرقم أو فيروس الجزيئات اللازمة لتصيب خلية واحدة العضلات الملساء (SMC) في لوحة الثقافة.
4. احتضان الخلايا المصابة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO ₂ العرض O / N.
5. وفي اليوم التالي، تجديد الخلايا مع 1 مل من DMEM جديدة بالإضافة إلى 10٪ NCS.
6. احتضان لوحات في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ O / N.

3. قياس ريال اللمعية الكالسيوم ²⁺ عن طريق القائم على الحنق التصوير متحد البؤر

1. وعقب O / N الحضانة، وإزالة مستنبت من لوحة.
2. غسل لوحة الثقافة مع 1 مل دافئ عازلة الفسيولوجية HEPES-PSS تحتوي على (في mmol·L ^{- 1)} كلوريد الصوديوم 140، الجلوكوز 10، بوكل 5، HEPES 5، CaCl ₂ 1.5 و MgCl ₂ 1 (7.4 درجة الحموضة) ثلاث مرات.
3. إضافة 1 مل دافئ HEPES العازلة-PSS الطازجة مباشرة قبل الشروع في تسجيل.
4. أداء التصوير الأولي باستخدام تطبيق الحنق SE (الحساس الانبعاثات) (أو ميزة مشابهة) على البرامج المرتبطة المجهر متحد البؤر ل.
   1. مرة واحدة تطبيق مفتوح، انقر فوق في علامة التبويب "إعداد" لضبط الإعدادات لتحقيق الظروف التجريبية المطلوبة.
   <لى> يدويا تغيير إعدادات القناة بحيث الخلايا المثارة في تسلسل في 440 نانومتر (للمتبرع والحنق قنوات) و 513 نانومتر (لقناة متقبل). جمع موجات الانبعاثات في 488 نانومتر (لالمانحة) و 535 نانومتر (عن الحنق ومتقبل).
   2. تعيين شدة الضوء في نقل 15٪، مع 150 مللي الإثارة وقت التعرض للخلايا (تسجيل الوقت لمدة ثلاثة المانحة متتابعة CFP، الحنق، وقنوات متقبل YFP) و 10 ثانية فترات بين التعرض.
5. استقرار لوحة على المسرح المجهر.
6. استخدم زر "لايف" للتحقق دقة وضوح الصورة. قرص إعدادات أخرى حتى يتم التوصل إلى قرار المرجوة.
7. لا تزال تحت علامة التبويب "إعداد"، التقاط صورة من العينة باستخدام الزر "التقاط صورة".
8. الانتقال إلى علامة التبويب "التقييم"، اختر الطريقة المناسبة لحساب الكفاءات الحنق للتجارب يجري. طريقة 3، وذلك باستخدام حساب Ratiometric [E _ألف (ط) = B / A]، فمن المستحسن لالتجارب التي تنطوي cameleons مثل مؤشر D1SR.
9. التحول إلى علامة التبويب "الرسم البياني" لتكون قادرة على مراقبة قيم الكثافة يجري تسجيلها في شكل رسم بياني أثناء التجربة.
10. رسم العائد على الاستثمار في عارض الصور لمراقبة متوسط ​​كثافة المقابلة لهذه المنطقة من الفائدة على الرسم البياني أثناء سير التجربة.
    ملاحظة: محقق أن تختار أيضا لرسم رويس متعددة ويكون المقابل يتم تسجيل شدة وعرضها في وقت واحد على الرسم البياني. بدلا من ذلك، قد المحققين الخطوط العريضة لدوروا واحد للتسجيل الأولي، والشروع في مخطط رويس متعددة في وقت لاحق عن طريق فتح ملف التجربة على نسخة موجهة تحليل البيانات من البرنامج.
    ملاحظة: يمكن العثور على مزيد من التفاصيل بشأن الخطوات اللازمة لانشاء التجارب القائمة على الحنق في الحنق أدلة المعالج التطبيق. إذا لم يتم تجهيز المجهر مع معالج الحنق، وبروتوكول التالي يمكن استخدامها لإعداد معلمات لتسجيل يدويا.
11. بدء التسجيل والسماح جمع البيانات لمدة 3 دقائق على الأقل لضمان تسجيل القاعدية المطرد للإشارة قبل إدخال عامل من الفائدة.
12. إدخال الكالسيوم ²⁺ -moving وكيل (على سبيل المثال 2 ميكرومتر thapsigargin؛ 100 نانومتر endothelin-1) كأداة لالمستنفدة ريال كا ^2+، قبل pipetting يدويا جرعة محددة سلفا مباشرة إلى لوحة في مكان أقرب إلى المنطقة ذات الاهتمام الوجود سجلت ممكن. مواصلة تسجيل لفترة ما بعد العلاج المطلوب.
13. القبض على ratiometric الحنق الصور المتسلسلة (512 × 512 بكسل) مع هدف النفط الغمر 63X المجهر متحد البؤر مقلوب باستخدام تطبيق الحنق SE.
14. جمع البيانات الناتجة عن التصوير من مجموعة من 5-10 SMCS في كل منطقة من الفائدة (ROI) وبعد ذلك شكل وتحليلها باستخدام البرمجيات القائمة على الإحصاءات.
    1. لحفظ البيانات لاستخدامها لاحقا، انقر بزر الماوس الأيمن فوق تتبع المسجل واختر الخيار "تصدير" لسافالبريد جدول البيانات مع تسجيل شدة إشارة متوسط ​​على القرص اختار المحقق.
    2. تطبيع البيانات من كل تجربة على حدة عن طريق قسمة كل نقطة البيانات قيمة كثافة بدءا وحظ في نقطة زمنية 0 ثانية.
    3. استيراد البيانات تطبيع من جداول البيانات إلى ملف مشروع البرنامج الإحصائي عن طريق نسخ ولصق يدويا صفوف البيانات ذات الصلة من الأصلي جدول / ثانية.
    4. تولد تلقائيا الرسوم البيانية المقابلة لمجموعات البيانات الذي تم لصقه في البرنامج.
       ملاحظة: الإعدادات الافتراضية للبرنامج توليد الرسوم البيانية خط من البيانات التي تم استيرادها. نوع من الرسم البياني عرض يمكن تعديل عن طريق النقر على زر "اختيار نوع مختلف من الرسم البياني" تحت عنوان "التغيير" مداخل وجدت داخل شريط الأدوات الرئيسي.
    5. بيانات تجمع تمثل محاكمات مستقلة متعددة ضمن مجموعة أكبر من تجارب مماثلة في ورقة بيانات واحدة لتنتج أثر متوسط ​​لاختبار محددة يؤديها.
4. إعداد حشوية الكالسيوم ²⁺ المؤشر
1. حل 0.0125 ز Pluronic حمض (PA) في 1 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) في أنبوب microcentrifuge الأسود (قد يكون لتدفئة أنبوب في حمام ماء الهاتف الجوال لمساعدة بحل السلطة الفلسطينية).
2. استرداد أنبوب (50 ميكروغرام) من حشوية الكالسيوم ²⁺ مؤشر صبغ (فلوو-04:00) من -20 ° C التخزين.
3. التفاف أنبوب الصبغة في احباط لحمايتها قدر الإمكان من الاتصال مع الضوء.
4. ماصة 45 ميكرولتر من الحل DMSO + السلطة الفلسطينية في الأنبوب الذي يحتوي على الصبغة. التفاف حل DMSO + سلطة الفلسطينية في احباط وتخزينها في RT.
5. خلط محتويات أنبوب دقيق من قبل pipetting الحل صعودا وهبوطا عدة مرات. بدلا من ذلك، يصوتن أنبوب الصبغة لمدة 10 دقيقة.
   ملاحظة: إما طريقة توزيع دقيق لصبغ جميع أنحاء حل DMSO + سلطة الفلسطينية ستكون كافية. بل هو مجرد مسألة تفضيل المحقق. إذا اختار محقق ليصوتن الحل، فإنهوينبغي أن يتم في منطقة / غرفة معزولة حيث لن تتأثر غيرها من الضوضاء. يجب محقق أيضا استخدام الخمارات الثقيلة لحماية الأذنين.
   1. إذا sonicating حل، إدراج أنبوب احباط الملفوفة التي تحتوي على الصبغة داخل حامل أنبوب الرغوة ومكان داخل الكامل sonicator باث 2/3 (مع DH ₂ O).
   2. sonicator باث مكان في منطقة معزولة / الغرفة وآلة السلطة على (ضمان أغطية الرأس الواقية في مكان قبل الشروع في عملية صوتنة). ترك الغرفة وترك الجهاز يعمل لمدة 10 دقيقة قبل اغلاقه واسترجاع الأنبوب (الحفاظ على ملفوفة في احباط للحماية من الضوء لأطول فترة ممكنة).
6. قسامة الحل الآن مختلطة تماما في أنابيب microcentrifuge الظلام (5 ميكرولتر في الأنبوب، يجب أن تكون قادرة على تقديم 10 أنابيب المجموع).
7. التفاف كل أنبوب قسامة في احباط. أنابيب التسمية وتخزينها في المجففة في -20 ظروف درجة مئوية حتى الاستخدام.

5. قياس حشوية الكالسيوم ²⁺

1. اتبع الخطوات في 1،1-1،12 لإعداد لوحات ثقافة SMCS الأورطي الفئران.
2. إزالة مستنبت من لوحة في 48 ساعة بعد الثقافة.
3. إزالة قسامة معدة مسبقا من حشوية الكالسيوم ²⁺ مؤشر (5 ميكرولتر) من -20 ° C التخزين والاحتفاظ بها في حمام الثلج المحمول حتى الاستخدام.
4. غسل لوحة الثقافة مع 1 مل دافئ عازلة الفسيولوجية HEPES-PSS تحتوي على (في mmol·L ^{- 1)} كلوريد الصوديوم 140، الجلوكوز 10، بوكل 5، HEPES 5، CaCl ₂ 1.5 و MgCl ₂ 1 (7.4 درجة الحموضة) ثلاث مرات.
5. مزيج المؤشر مع 1 مل من الحارة HEPES-PSS وتحميله على لوحة الثقافة.
6. احتضان SMCS مع المؤشر لمدة 1 ساعة على RT (24 درجة مئوية).
7. إزالة المؤشر من لوحة الثقافة وتغسل مع 1 مل الدافئة الفسيولوجية HEPES-PSS عازلة ثلاث مرات.
8. إضافة 1 مل دافئ HEPES العازلة-PSS الطازجة مباشرة قبل الشروع في تسجيل.
9. التقاط الصور المتسلسلة (512 × 512 بكسل) مع 63X سالهدف ايل-غمر متحد البؤر مقلوب المجهر.
   1. يدويا تغيير الإعدادات بحيث الخلايا المثارة في 488 نانومتر، ويتم جمع انبعاث موجات في 555 نانومتر مع سرعة المسح الضوئي 700 هرتز.
   2. تعيين شدة الضوء في نقل 15٪، مع 150 مللي ثانية وقت التعرض الإثارة من الخلايا (مقدار الوقت الذي تتعرض الخلايا لضوء على فترات زمنية محددة أثناء التسجيل) و 5 فترات ثانية بين التعرض.
10. استقرار لوحة على المسرح المجهر وبدء التسجيل.
11. سجل لمدة 3 دقائق على الأقل لضمان تسجيل القاعدية المطرد للإشارة قبل إدخال عامل من الفائدة.
12. إدخال الكالسيوم ²⁺ عامل -moving (على سبيل المثال 2μM thapsigargin) كأداة لالمستنفدة ريال كا ²⁺ (كما هو موضح في الخطوة 3.16) ويستمر لتسجيل المبلغ المطلوب من الوقت بعد العلاج.
13. سجل إشارة كثافة استخدام البرمجيات المجهر معين عن طريق حساب متوسط ​​الاشتراكية مضانgnals (F / F ₀₎ من مجموعة من 5-10 SMCS في كل منطقة من الفائدة (ROI). جمع وتنسيق وتحليل البيانات الناتجة عن التصوير باستخدام برامج تحليل البيانات. نرى خطوات 3.18.1-3.18.5 لوصف جمع البيانات وتحليلها باستخدام هذا البرنامج.

Representative Results

ويوفر هذا القسم أمثلة من النتائج التي يمكن الحصول عليها باستخدام الطريقة الموصوفة لالتقاط البيانات تركيز الكالسيوم ²⁺ اللمعية ريال سعودي، مقارنة مع الطريقة المستخدمة عادة لقياس غير مباشر تغييرات على العضيم الكالسيوم ²⁺ تركيزات مخزن من خلال مراقبة التقلبات في هيولي الكالسيوم ²⁺ .

ويبين الشكل 1A لقطة من المنطقة ذات الاهتمام (ROI) من ثقافة SMC transfected مع اتش D1SR في قناة YFP (514 نانومتر الإثارة / 535 الانبعاثات نانومتر). كما هو مبين، على الرغم من كل SMCS إيجابية للتعبير D1SR، فمن الواضح أن مستويات التعبير عن مؤشر D1SR تختلف بين الخلايا المختلفة داخل نفس العائد على الاستثمار. ويبين الشكل 1B الإسقاط 2-D لصورة مضان من SMC transfected مع D1SR اتش (قناة YFP)، الذي يقدم صورة واضحة من الكالسيوم ²⁺ التوزيعداخل الشبكة اللمعية ريال توسعية. ويعرض الشكل 1C توزيع مؤشر D1SR في تصريح خاص ل باستخدام CFP (440/488 نانومتر)، الحنق (440/535 نانومتر)، وYFP (514/535 نانومتر) مرشحات الفرقة تمرير.

وتبين لنا أيضا أمثلة من آثار إشارة الكالسيوم ²⁺ تم الحصول عليها من رصد حركة هذه الأيونات المستهدفة في ريال، وذلك باستخدام اختبار واضح من التعرض الحاد للخلايا إلى وكيل ريال تفريغ thapsigargin (2 ميكرون) (الشكل 2). كما هو مبين في الشكل 2A و 2B، thapsigargin يؤدي الى انخفاض في ريال كا ²⁺ المحتوى ([كا ^2+] _{ريال سعودي).}

في الشكل 3A، لقد أظهرنا صور تمثيلية من SMCS مثقف محملة حشوية الكالسيوم ²⁺ مؤشر تعامل مع ريال تفريغ thapsigargin وكيل (2 ميكرومتر). ذروة عابرة لوحظ في سجل الكالسيوم ²⁺ إشارة ( 2+ إطلاقها في السيتوبلازم من SMC، على الرغم من أن مصدر العابرين الكالسيوم ²⁺ لا يمكن تحديدها بشكل واضح.

ويبين الشكل 4A لقطات تمثيلية من SMCS مثقف معربا عن ريال الكالسيوم مؤشر D1SR وتعامل مع 100 نيوتن متر من endothelin-1. كما هو مبين في كل 4A الأرقام و4B، endothelin-1 يؤدي الى انخفاض بطيء، ولكنه ثابت في محتوى الكالسيوم ريال مقاسا انخفاضا في إشارة D1SR الحنق. كما هو واضح، وبروتوكول الحنق ratiometric تسمح أهمية الدراسة من الكالسيوم ²⁺ الحركات المرتبطة مباشرة لطريقة العمل للعامل المستخدمة. قياس مباشرة حركة هذا أيون إلى / من أكبر متجر الكالسيوم ²⁺ في الخلية بهذه الطريقة غير مفيدة في تقديم نتائج ممثل من الكالسيوم المتعلقة تصرفات ريال أو بسبب تغير ²⁺ ديناميات مباشرة الصورة في بيئة التجويف ريال.

الشكل 1. توزيع ريال كا ²⁺ D1SR المؤشر في الفئران SMCS الأبهري. (A) صورة الممثل تصور ثقافة SMC transfected مع D1SR ناقلات andenoviral في آخر إصابة 48 ساعة. (ب) 2-D إسقاط صورة مضان توزيع D1SR في تصريح خاص ل مثقف باستخدام قناة YFP (514 نانومتر الإثارة / 535 الانبعاثات نانومتر). (C) لقطة تمثيلية من SMC transfected مع مؤشر D1SR باستخدام CFP (440/488 نانومتر)، الحنق (440/535 نانومتر)، وYFP (514/535 نانومتر) مرشحات الفرقة تمرير. الحانات النطاق = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

/files/ftp_upload/53912/53912fig2.jpg "/>
الشكل 2. Thapsigargin يؤدي إلى انخفاض كبير في [كا ^2+] _ريال. (A) في الوقت الحقيقي لقطات pseudocolor (قناة الحنق) من الفئران مثقف SMCS الأورطي transfected مع D1SR وتعامل مع 2 ميكرومتر من thapsigargin تظهر انخفاضا في كثافة إشارة تشير انخفاض كبير في ريال كا ²⁺ محتوى بسبب الناجم عن thapsigargin الكالسيوم ²⁺ الافراج عنهم. (ب) تتبع ممثل لF / F قيمة ₀ في SMCS مثقف تعامل مع 2 ميكرومتر thapsigargin يؤكد انخفاض كبير في [كا ^2+] _ريال. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فاي جوري 3. Thapsigargin يؤدي إلى زيادة كبيرة في هيولي الكالسيوم ²⁺ ([كا ^2+] _ط). (A) لقطات التمثيلية للفأر SMCS الأورطي مثقف محملة حشوية الكالسيوم ²⁺ المؤشر، وتعامل مع 2 ميكرومتر من thapsigargin. كما هو مبين، thapsigargin يؤدي إلى زيادة كبيرة في كثافة إشارة داخل السيتوبلازم ويرجع ذلك إلى إطلاق سراح الكالسيوم ²⁺ من ريال. (ب) تتبع ممثل لF / F قيمة ₀ في SMCS مثقف تعامل مع 2 ميكرومتر من thapsigargin. وتعتبر الزيادة يصور في إشارة الكالسيوم ²⁺ أن تكون متناسبة مع كمية من الكالسيوم ²⁺ صدر من ريال الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

er.within الصفحات = "1">
الشكل 4. Endothelin-1 يسبب انخفاضا كبيرا في [كا ^2+] _ريال. (A) في الوقت الحقيقي لقطات pseudocolor (قناة الحنق) من الفئران مثقف SMCS الأورطي transfected مع D1SR وتعامل مع 100 نانومتر endothelin-1 تظهر ببطء ولكن انخفاض مطرد في كثافة إشارة يشير إلى انخفاض كبير في ريال محتوى الكالسيوم ²⁺ بسبب الناجم عن endothelin الكالسيوم ²⁺ الإفراج عن ريال. (ب) تتبع ممثل لF / F قيمة ₀ في SMCS مثقف تعامل مع 100 نيوتن متر من endothelin-1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يصف هذا البروتوكول ترنسفكأيشن من VSMCs مع اتش D1SR لدراسة الكالسيوم ²⁺ تركيزات داخل تجويف ريال. وتسمح هذه الطريقة لقياس المباشر من الكالسيوم ²⁺ ضمن هذه العضية وكذلك حركتها إلى / من ريال نتيجة لتطبيق مختلف وكلاء الحركة الكالسيوم. هذا الأسلوب لديه العديد من المزايا للمحققين يعملون من أجل التوصل إلى فهم شامل لكيفية إدخال تغييرات على مستويات ريال وهيولي الكالسيوم ²⁺ تؤثر على صحة الخلوية الشاملة وكيف يمكن لهذه التغيرات مترابطة. المراقبة التقليدية من الخلايا حركة الكالسيوم ²⁺ ينطوي على تتبع التغيرات إلى هيولي مستويات الكالسيوم ²⁺ فقط. ميزة هامة المستمدة من استخدام D1SR أو ما شابه ذلك يبني، ولذلك، هو القدرة على رصد حركة هذه الأيونات التي تنطوي على عضية محددة مثل ريال، بدلا من الاضطرار إلى استنتاجات غامضة حول تأثير منبهات على ريال من قبلمراقبة غير مباشرة تغييرات على هيولي الكالسيوم ²⁺ مستويات الناجمة عن هذا التلاعب. على نفس المنوال، العوامل التي تعمل على التأثير ريال كا ²⁺ على وجه التحديد يمكن استخدامها بشكل أكثر كفاءة لتقييم آثارها على كل عضية والخلوية تركيز على مستوى الخلية كا ²⁺ والصحة العامة. ومن المقرر ان هذه المزايا التي ترنسفكأيشن من الخلايا المستزرعة مع D1SR يوفر أكثر مباشرة، وكذلك مجاني، طريقة لقياس تغييرات على ريال المستويات داخل اللمعة الكالسيوم ^2+. أيضا من أهمية هو حقيقة أن هذا النموذج يوفر أداة لقياس التغيرات في كا ²⁺ التركيز داخل شبكة ريال ردا على وكلاء الدوائية أو الفسيولوجية التي هي معروفة للحث على الإجهاد الخلوية أو الردود وظيفية محددة. ولن يكون هذا ممكنا عن طريق توليد منحنى المعايرة لمؤشر D1SR في أي خلية من الاهتمام. ومن ثم يمكن حساب تركيز الكالسيوم داخل ER / ريال عن طريق معايرة نسبة D1SR تطبيع (F / F ₀) ضد منحنى المعايرة القياسية كما هو موضح سابقا ^{10 و 11.}

وجود قيود على بروتوكول المبين هنا هو نقص المعلومات المتاحة على استخدام بناء D1SR في أنواع الخلايا الأخرى. وأثبتت هذه الطريقة حتى الآن ناجحة لSMCS الفئران في دراساتنا عدة مرات ^13-15، على الرغم من استخدامها مع أنواع الخلايا الأخرى لديها حتى الآن كانت محدودة. لنجاح هذه الطريقة، فمن الأهمية بمكان أن يتم اتخاذ جميع الاحتياطات اللازمة لضمان تطور صحي من الخطوات ثقافة الخلية. ولذلك فمن المهم أن استخدام المواد الملائمة التي تتيح نمو الخلايا على لوحات، مثل العديد من المواد الجيلاتينية البروتين على أساس متاحة للشراء التي ثبت لتعزيز النمو كاف من SMCS الأورطي الفئران على لوحات الفحص المجهري القاع الزجاجي. تقلب في نجاح ترنسفكأيشن مع D1SR والتصوير لاحقة يمكن ملاحظة إذا لم يتم إعداد الخلايا خلال الممرات الخاصة بهم الأمثل وفي confluency عالية. التغييرات إلى phenotype ملازمة لاستخدام لفترات طويلة من خط الخلية نفسه قد يؤدي إلى ترنسفكأيشن الأمثل وإشارة ضعيفة تم الحصول عليها خلال مرحلة التصوير. ولذلك فإن القيود المتورطين في استخدام هذه الطريقة هي أساسا تلك التي لا مفر من عمل زراعة الخلايا المطلوب، والتجارب باستخدام بناء D1SR يجب أن يكون مستعدا ل36-48 ساعة على الأقل قبل تنفيذها لضمان confluency خلايا للتصوير و الوقت الكافي للحضانة من تزايد الخلايا التي تحتوي على اتش.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate)	Life technologies	11995-065	Warm in 37 °C water bath before use
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml	Corning	356230	Keep at -20 °C until right before use
Newborn Calf Serum	Sigma-Aldrich		Keep at -20 °C until right before use
35 mm glass-bottomed plates	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 ml 0.2 μM vented blue plug seal cap flask	BD Falcon	353136
Trypsin/EDTA Solution	Life technologies	25200056	Keep at -20 °C until right before use
50 ml Polypropylene Conical Tube	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Gift
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Keep at -20 °C until right before use
1.5 ml Black Microcentrifuge Tubes	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.