Introduction
钙离子是人体的每一个细胞中大量存在一个非常重要的离子。它有许多不同的细胞功能，包括生长，增殖，迁移，凋亡和1-4显著的作用。这是公认的Ca 2+可以通过直接和间接的行为影响这些过程，因此，改变该离子的正常细胞内浓度可以很容易地得到用于受影响的细胞中的负面结果。的SR被认为是细胞5内的最大细胞内Ca 2+存储。同时在SR和胞质钙离子稳态水平，通过不断变化进入和退出这个细胞器的钙 -transporting渠道的正常维护。由于任何形式的伤害或疾病在细胞施加的压力条件通常与SR钙离子的去到对长期影响他显著变化相关细胞ALTH。在最严重的情况下，一个强调细胞无法收回，并保持稳定状态SR钙离子水平甚至可能死亡的细胞凋亡6-8高潮。
目前的研究到细胞钙动力学的事实，一些研究试验细胞器的 Ca 2+存储内容直接9-11限制。最常见的做法，而不是涉及SR 钙含量12-14胞质钙离子水平的变化间接测量的测量。在这些实验中，钙离子通常诱导从SR通过使用引起细胞器的耗尽药剂（ 如毒胡萝卜素）的释放。结论然后就基于在细胞质的 Ca 2+浓度的波动变化到SR 的 Ca 2+绘制。尽管剩余研究者以一种迂回的马得出这样的结论的能力nner，SR 钙这种测量方法显然是来收集这些信息，提供关于收集的数据的解释很多局限性一种间接的方式。为了绕过此明确的限制，有必要测量的 Ca 2+的SR管腔网络内直接发现的量。
至关重要的是能够直接记录腔内的SR 的 Ca 2+水平的最终结果是细胞培养工具和所用的钙离子指 示剂。在当前的手稿中引用的数据，必须指出，使用血管平滑肌细胞从冷冻的细胞系来是很重要的。细胞在Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM）+ 10％新生小牛血清（NCS）以上的概述实验的通道22-26，在一个恒定的37℃，5％CO 2的供应孵育培养。使用当前的方法，例如，细胞已经非常成功地生长在模拟胞外蛋白质混合物许多不同类型的组织15的环境。重要的是沿着SR Ca的静脉成功2+研究是用于蛋白质混合物的类型;在这种情况下，一个低生长因子各种必要避免从影响常规的Ca 2+信号和运动不断测试的细胞内发生的该工具的组件。以下的试验细胞的成功的增长，所述钙离子指 示剂也必须有效地引入到这些培养细胞。这已经通过使用携带SR-驻留的 Ca 2+指示剂D1SR的腺病毒载体成为可能。实现了高转染效率，细胞必须用病毒载体孵育成像前至少36-48小时。该制剂提供了测量的Ca以高精度和再现性的SR腔内2+瞬变的可靠工具。
在这个协议中使用D1SR指标是D1ER钙的改良变种2+我最初由钱永健博士的实验室在加州大学圣地亚哥分校，美国9,16创建ndicator。原始D1ER属于第二代的遗传编码的 Ca 2+指标称为cameleons，超过一个更广泛的范围（0.5-160微米）显示的 Ca 2+敏感性与先前的 Ca 2+指标9,16。该新变种D1SR，韦恩Chen博士（加拿大阿尔伯塔大学）是一种恩赐，但是，携带突变集钙蛋白序列（而不是钙网蛋白序列原D1ER）。突变体肌集钙蛋白具有结合降低的 Ca 2+，消除在对SR管腔11内结合的 Ca 2+内源性肌集钙蛋白竞争的问题。该D1SR指标进行截断的增强型青色荧光蛋白（CFP）和黄色荧光蛋白（YFP），其结合含改性钙调素（CAM）和一个M13连接蛋白（T他26个残基结合CAM）序列的肌球蛋白轻链激酶的肽。凸轮M13序列已被修饰以防止M13的结合内源性钙调蛋白。同时，为了确保SR滞留，一个集钙蛋白序列已经添加CFP 11的5'端。当结合的 Ca 2+，凸轮-M13域经过导致的增加的侧翼CFP和YFP，其被记录为一个增加的FRET信号强度之间的能量传递的构象变化。另一方面，当SR管腔的 Ca 2+的浓度下降，凸轮-M13域经过反向构象变化，从而导致在侧翼CFP和YFP，并在FRET信号强度的显著降之间的能量传递减少。
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Protocol
伦理学声明：所有实验和程序与不列颠哥伦比亚省，温哥华，加拿大大学的实验室生物安全指导方针达成协议进行。
1. 35毫米玻璃底培养皿准备基于FRET的共聚焦显微镜
- 使用以下步骤36-48小时前实验制备平板。
- -20℃存储检索选择胶状蛋白质混合物和0.25％胰蛋白酶-EDTA，并保存在移动冰浴中，直到使用。
注：包衣蛋白混合物应该只暴露于室温的时间，以防止该混合物从使用前固化短暂。直到需要胰蛋白酶溶液也应保持冷藏;可替代地，胰蛋白酶可为-20℃存储以下步骤1.5完成检索。 - 准备1:25稀释蛋白混合物：DMEM（不添加血清，冷冻）。转运蛋白的混合物/ DMEM适当的体积正在准备每盘。 35毫米的玻璃底板，加入大约200微升完全覆盖在盘底内层玻璃圆。
- 离开板坐安全柜内，并在室温至少30分钟。在这段时间内暖含10％NCS的到37℃在水浴中。
- 接下来的步骤前夕温暖的胰蛋白酶在水浴至37℃。
- 除去DMEM使用玻璃吸管和吸入当前正在培养瓶中。用温无菌PBS烧瓶洗楼，除去残存的DMEM残留物。
- 逐出瓶底部的预先培养平滑肌细胞：
注：烧瓶成立天到这一步，以允许板制备前细胞以达到所需的汇合（约80％）。细胞最初悬浮在烧瓶的20ml DMEM中，用10％NCS和在37℃，5％CO 2的供给培养24小时，DMEM供应之后被刷新，并放回细胞培养箱中。 DMEM进行了改版前夕直到细胞达到汇合RY 48小时以下的初始步骤。- 洗1毫升胰蛋白酶迅速瓶中，然后用吸拆下1个ml的胰蛋白酶。
- 加在再过1 ml胰蛋白酶和离开较长时期（约30-60秒），嗖嗖烧瓶以确保酶使用该烧瓶的整个底部接触。
- 观察有多少细胞已经在显微镜下分离直至满意与瓶分离。备用嗖嗖胰蛋白酶溶液和检查细胞脱离，直到满意与瓶分离的细胞比例。
注：将烧瓶可以返回到培养箱中约30-60秒，以加快在37℃下此过程。 - 一旦细胞已被使用胰蛋白酶脱落，用10％NCS的添加新鲜的DMEM向烧瓶以停止胰蛋白酶反应（足够容积，使胰蛋白酶形成1/8在烧瓶总体积）。
注意：例如，使用250毫升的培养瓶中时，这会为7的10ml DMEM加到1 ml胰蛋白酶的导致在8ml细胞溶液。
- 转让所得从烧瓶到一个干净的（标记的）50ml锥形管中的细胞溶液。
- 加入1毫升的新鲜DMEM加10％NCS每块板正在准备（足以媒体要持续24小时）。
- 轻轻颠倒含有管细胞溶液多次分手可能已经形成的任何沉淀。
- 吸管所需轻轻混合细胞溶液到各板的体积。
注：镀金此协议的建议平滑肌细胞数量是0.5-0.8×10 6？35 100mm培养菜肴。这些数字可根据细胞类型而有所不同，应通过每个实验室进行测试和修改。 - 旋流每块板彻底顺时针/逆时针，以确保整个玻璃底细胞的平等分配。
2.瞬时转染与腺病毒载体携带D1SR 钙指标
- 在加入我的dium和细胞溶液到每个平板，离开板在37℃，5％的CO 2供给孵育至少1小时，以允许细胞正常附着到玻璃上的菜肴底部。在15分钟的间隔在显微镜下检查板直至细胞被清楚地附着。
- 检索来自-80℃下贮存的腺病毒 - D1SR等分和保持在移动冰浴输送到生物安全柜。
- 吸管所需剂量冷冻D1SR到各板的（100感染复数）。
注：对于每板所需的腺病毒溶液的体积计算取决于在原始原料溶液，这是作为在噬斑形成单位（PFU）的病毒滴度。根据我们的经验，我们建议的100感染复数（MOI），它被解释为对感染的培养板一次平滑肌细胞（SMC）所需的数量或病毒颗粒的多重性。 - 孵育感染的细胞在37℃，5％的CO 2供给O / N。
- 第二天，补充细胞用1毫升新鲜的DMEM加10％NCS。
- 在5％CO 2 O / N在37℃孵育，在湿润的培养箱板上。
3. SR鲁米的Ca 2+测量使用基于FRET的共焦成像
- 继O / N孵化，请从平板培养基。
- 用含1毫升温生理的HEPES-PSS缓冲液洗涤培养板（在mmol·L - 1）的NaCl 140，葡萄糖10，氯化钾5，HEPES 5， 氯化钙 1.5和MgCl 2的1（pH7.4）中三次。
- 1毫升新鲜温暖的HEPES-PSS缓冲录制开始前立即添加。
- 执行使用的共聚焦显微镜的相关软件的FRET SE（敏排放）的应用程序（或类似功能），最初的影像。
- 一旦应用程序打开，点击进入“设置”选项卡以调整设置以达到理想的实验条件。 <LI>手动更改频道设置，使细胞的序列很高兴在440纳米（供体和FRET通道）和513 nm（用来受体通道）。在488纳米（供体）和535纳米（FRET为和受体）收集的发射波长。
- 设置的光的强度在15％的透射率，与细胞（记录时间为三个连续的CFP给体，FRET，和YFP受体通道）和曝光之间10秒的时间间隔的150毫秒励磁曝光时间。
注：研究者还可以选择绘制多个ROI，并有相应的强度被记录并在图表上同时显示。可替代地，调查人员可能概述了初始记录单个投资回报率，并继续由该软件的数据取向分析版本打开实验文件概述在稍后的时间多个ROI。
注：建立基于FRET的实验所需的步骤的详细内容可在FRET应用程序向导手册中找到。如果在显微镜没有配备FRET的向导，以下方案可用于设置的参数手动录音。
- 要保存供以后使用的数据，在右键单击该记录的跟踪，并选择“导出”选项SAVE中的电子表格与研究者的选择驱动器上记录的平均信号强度。
- 通过将每个数据点由在时间点0秒观察到的起始强度值正常化从每个单独的实验数据。
- 通过手动复制并从原来的电子表格/秒粘贴相关数据行从电子表格到一个统计程序的项目文件导入规范化的数据。
- 自动生成对应于粘贴到程序中的数据集的曲线图。
注：该程序的默认设置生成导入的数据线图。显示的图表类型可以通过点击下面的“更改”的主要工具栏中找到航向“选择不同类型的图形”按钮进行修改。 - 代表一个较大基团的相同实验中的多个独立试验成单个数据片池数据以产生用于执行的特定测试的平均跟踪。
- 在1ml的黑色微量离心管二甲基亚砜（DMSO）的溶解0.0125克聚醚酸（PA）（可能需要暖管中流动水浴，以帮助溶解PA）。
- 检索来自-20℃下贮存的胞质钙指示剂染料（的Fluo-4 AM）的一个管（50微克）。
- 包裹染料的管在箔来保护它尽可能从与光接触。
- 吸移管45微升的DMSO + PA溶液到含有染料的管构成。裹在室温在箔和存储DMSO + PA解决方案。
- 吹打的解决方案上下多次调匀管的内容。可替代地，超声处理的染料管10分钟。
注：在整个DMSO + PA解决方案足以彻底分配染料无论哪种方法;它仅仅是研究者的偏好的问题。如果研究者选择超声处理解决方案，应的一隔离区/房间，其他人会受到噪声的影响来完成。研究者还应该使用重型消声器，以保护耳朵。- 如果超声解决方案，将铝箔包裹管含发泡管座和地方的2/3（与卫生署2 O）超声器里面洗澡里面的染料。
- 在隔离区/室和动力机在地方超声波仪浴（确保保护帽到位启动超声处理之前）。留有余地，离开机器关了之，检索管（保持在铝箔包裹避光，只要可能的话）之前，运行10分钟。
- 分装现在充分混合溶液到暗离心管（每管5微升，应该能够使10管总数）。
- 包装在铝箔等分各管。标签管并存储在干燥剂在-20°C条件下直至使用。
5.细胞质的Ca 2+测量
- 按照1.1-1.12步骤准备大鼠主动脉平滑肌细胞培养板。
- 从在48小时后培养板除去培养基。
- 除去-20℃存储胞质的 Ca 2+指示剂（5微升）的预先制备的等分试样，并在移动冰浴保持直至使用。
- 用含1毫升温生理的HEPES-PSS缓冲液洗涤培养板（在mmol·L - 1）的NaCl 140，葡萄糖10，氯化钾5，HEPES 5， 氯化钙 1.5和MgCl 2的1（pH7.4）中三次。
- 混合指示剂用1毫升温HEPES-PSS的，它加载到培养皿。
- 孵育平滑肌细胞与在RT指示器1小时（24℃）。
- 从培养板去除指示器，并用1毫升温生理的HEPES-PSS缓冲三次洗涤。
- 1毫升新鲜温暖的HEPES-PSS缓冲录制开始前立即添加。
- 捕捉序列图像（512×512像素），具有63XØ共聚焦显微镜倒置的IL-浸泡的目的。
- 手动改变设置，使得细胞被激发在488nm，和发射波长在700赫兹的扫描速度555nm处收集。
- 设置的光的强度在15％的透射率，与细胞的150毫秒励磁曝光时间（记录过程中的细胞暴露于光以指定的时间间隔的时间量）和曝光之间5秒的间隔。
- 稳定在显微镜舞台板，并开始录制。
- 记录至少3分钟，以确保信号的一个稳定的基础记录引入感兴趣的试剂之前。
- 引进的 Ca 2+ -moving剂（ 如 2μM毒胡萝卜素），作为消耗的SR 的 Ca 2+（如在步骤3.16中所述），并继续录制时间后处理的所需量的工具。
- 使用特定显微镜的软件通过平均荧光SI记录信号强度gnals（F / F 0）从5-10平滑肌细胞中感兴趣区域（ROI）的每个区域的群集。收集，格式和分析使用数据分析软件从成像结果数据。请参阅使用本软件的步骤3.18.1-3.18.5用于数据收集的描述和分析。
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Representative Results
本部分提供了可以使用上述方法来捕获的SR管腔Ca 2+浓度的数据来获得的结果的例子，相对于间接测量的变化，通过观察在细胞质的Ca波动细胞器的 Ca 2+商店浓度通常采用的方式2+ 。
图1A示出的与YFP通道（514 nm激发/ 535nm处发射）D1SR腺病毒转染的SMC培养的感兴趣区域（ROI）的区域的快照。如图所示，虽然所有的SMC是阳性D1SR表达，显而易见的是，对于D1SR指示器的表达水平相同的ROI内的不同小区之间变化。 图1B示出与D1SR染的SMC的荧光图像的2-D投影腺病毒（YFP通道），其中介绍钙分布的清晰图像膨胀的SR管腔网络内。 图1C呈现使用CFP（488分之440纳米），FRET（535分之440纳米）和YFP（五百三十五分之五百十四纳米）的带通滤波器在SMC D1SR指示器分布。
我们还表明，从监测中的SR这个目标离子的运动得到的钙信号迹线的实施例中，使用细胞的急性暴露的清晰测试一个SR排空剂毒胡萝卜素（2μM）（ 图2）。如在图2A和2B所示，毒胡萝卜素诱导的SR的Ca 2+的含量（内[Ca 2+]，SR）的下降。
在图3A中 ，我们已经表明装载有与SR排空剂毒胡萝卜素（2μM）处理的细胞质的 Ca 2+指示剂培养平滑肌的代表性图像。在记录的钙离子信号的瞬间观察到峰（
图4A示出表达的SR钙指示剂D1SR和内皮素-1的100纳米处理培养的平滑肌的有代表性的快照。如在这两个图4A和4B所示，内皮素-1诱导如通过D1SR FRET信号的下降测量SR中的钙含量缓慢，但稳定的下降。明显看出，在比率量度FRET协议重要允许的Ca研究2+直接相关的代理的动作的模式的动作中使用。直接测量在以这种方式在电池这种离子的运动到从最大的 Ca 2+储存/是有帮助的直接2+动力学提供结果代表的Ca涉及到SR的行动或由于改变 S IN SR腔内环境。
图1. 分布在大鼠主动脉平滑肌细胞的SR 钙指标D1SR的。（A）的形象代表描绘了SMC文化在48小时后感染D1SR andenoviral载体转染。 （B）在培养的SMC用YFP的信道（514毫微米激发/ 535nm处发射）D1SR分布的荧光图像的二维投影。 （C）的使用CFP（488分之440纳米），FRET（535分之440纳米）和YFP（五百三十五分之五百十四纳米）的带通滤波器D1SR指示剂染的SMC的代表性快照。比例尺= 10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图2. thapsigargin触发导致一个显著下跌钙离子浓度 的SR（A）实时培养的大鼠主动脉平滑肌细胞转染D1SR和2微米毒胡萝卜素处理显示信号强度指示减少伪快照（FRET频道）在SR 钙含量是由于毒胡萝卜素诱导的钙释放一个显著下跌。 （ 二 ）在与2微米毒胡萝卜素证实了钙离子浓度 SR一个显著下跌处理平滑肌细胞培养F / F 0值代表的痕迹。 请点击此处查看该图的放大版本。
网络连接古尔3. thapsigargin触发导致细胞质的Ca显著上升2+（[ 钙 离子浓度 ）。 （A）装载胞质钙指标，并与毒胡萝卜素的2μM处理培养的大鼠主动脉平滑肌细胞的代表快照。如图所示，毒胡萝卜素导致细胞质内信号强度的显著增加由于钙从SR的释放2+。 （B）用于与毒胡萝卜素的2μM处理培养的平滑肌细胞F / F 0值代表跟踪。在钙离子信号所描述的增加被认为是与从SR释放的钙离子量。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.内皮素-1引起的显著下跌钙离子浓度 的SR（A）实时培养的大鼠主动脉平滑肌细胞转染D1SR和100纳米处理的伪快照（FRET通道）内皮素-1呈现出缓慢但稳步下降的信号强度指示中的SR的Ca 2+的含量由于用于SR内皮素诱导的Ca 2+释放一个显著下降。 （ 二 ）在与内皮素-1的100纳米治疗平滑肌细胞培养F / F 0值代表的痕迹。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
这个协议描述平滑肌的转染与D1SR腺病毒到SR的内腔中研究的 Ca 2+的浓度。此方法允许的 Ca 2+的此细胞器中的直接测量，以及它的运动进/出SR的不同钙移动剂的应用的结果。该方法对朝更改SR和胞质钙离子水平如何影响整体的健康细胞，以及这些变化是相互关联的一个全面的了解调查工作的许多优点。细胞内Ca 2+的移动的传统观测涉及改变仅细胞质的 Ca 2+水平的跟踪。从使用D1SR或类似构建体的一个重要的优点，因此，是监测涉及特定细胞器该离子的运动，如SR，而不是具有吸取激动剂对SR由效应模糊结论的能力间接观察到的变化通过这种操纵引起的胞质钙离子水平。沿着同样，投放到影响药物的SR 的 Ca 2+具体地说，可以更有效地使用，以评估其在两个细胞器和细胞全细胞的 Ca 2+的浓度和总的健康影响。正是由于这些优点，与D1SR培养细胞的转染提供测量改变腔内的SR 的 Ca 2+水平的更直接的，以及免费，方法。也很重要的是，这种模型提供了用于响应于已知会诱导细胞应激或特定功能反应的药理学或生理学剂测量SR网络内钙的变化2+浓度的工具的事实。这将通过在感兴趣的任何细胞产生用于D1SR指示器的校准曲线是可能的。在ER / SR内钙离子浓度就可以通过校准标准化D1SR比（F / F 0计算）抗如前面10，11中所述的标准校准曲线。
这里列出的协议的一个限制是对使用其他类型的细胞D1SR结构的可用信息的缺乏。这种方法至今已证明是成功的大鼠平滑肌细胞在我们的研究中多次13-15，但它与其他类型的细胞利用迄今是有限的。对于这种方法的成功，这是至关重要的，采取所有的预防措施以保证在细胞培养的步骤健康发展。使用适当的材料，允许在平板上，如已被证明促进玻璃底镜板的大鼠主动脉平滑肌细胞的充分生长的许多基于蛋白质的凝胶状可供购买的物质的细胞生长是重要的。如果在它们的最佳通道，并在高汇合未制备的细胞能够观察到变异的转染与D1SR和随后成像的成功。更改为phenotype固有长时间使用相同的细胞系，可能会导致在成像阶段而得到次优的转染和弱信号。因此，在使用这种方法的牵连的局限性主要是那些由通过所需的细胞培养物的工作必然，作为使用D1SR构建实验必须至少36-48小时的执行之前要准备，以确保细胞的汇合成像和足够的时间与腺病毒生长的细胞的培养。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作是由健康研究加拿大学院资助[MOP-1112666至CVB＆ME]支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate) | Life technologies | 11995-065 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml | Corning | 356230 | Keep at -20 °C until right before use |
| Newborn Calf Serum | Sigma-Aldrich | Keep at -20 °C until right before use | |
| 35 mm glass-bottomed plates | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| 250 ml 0.2 μM vented blue plug seal cap flask | BD Falcon | 353136 | |
| Trypsin/EDTA Solution | Life technologies | 25200056 | Keep at -20 °C until right before use |
| 50 ml Polypropylene Conical Tube | BD Falcon | 352070 | |
| D1SR | N/A | N/A | Gift |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8779 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Fluo 4-AM | Life technologies | F-23917 | Keep at -20 °C until right before use |
| 1.5 ml Black Microcentrifuge Tubes | Argos Technologies | T7100BK | |
| Leica TCS SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application) | Leica Microsystems | ||
| GraphPad Prism 5.0 | GraphPad Software, Inc. |
References
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