Introduction
Ca2 + är en mycket viktig jon finns i överflöd inom varje enskild cell i kroppen. Det har viktiga roller i många olika cellfunktioner, inklusive tillväxt, proliferation, migration och apoptos 1-4. Det är väl etablerat att Ca2 + kan påverka dessa processer genom både direkta och indirekta åtgärder, och därför ändras till den normala intracellulära koncentrationen av denna jon kan lätt leda till negativa konsekvenser för drabbade celler. SR anses vara den största intracellulära Ca2 + butik i cellen 5. Steady state-nivåer av Ca2 + i både SR och cytoplasman normalt upprätthålls genom konstant flöde in i och ut ur Ca2 + -transporting kanaler i denna organell. Stressiga förhållanden åläggs celler på grund av någon form av skada eller sjukdom i allmänhet förknippas med betydande förändringar i SR Ca 2 + som går på att ha långvariga effekter på hanALTH av cellen. I de svåraste fallen, oförmågan av en stressad cell återhämta sig och bibehålla steady state SR Ca2 + nivåer kan även kulminera i döden genom apoptos 6-8.
Aktuell forskning om cellulära Ca2 + dynamik begränsas av det faktum att några studier testet organell Ca2 + lagra innehåll direkt 9-11. Den vanligaste praxis innebär istället mätning av cytoplasmiska Ca 2 + nivåer som indirekta mätningar av förändringar i SR Ca 2 + innehåll 12-14. I dessa experiment är Ca2 + vanligt förmås att frigöras från SR genom användning av farmakologiska medel som orsakar organell är utarmning (t.ex. tapsigargin). Slutsatser dras sedan med avseende på förändringar i SR Ca 2 + baserat på fluktuationer i cytoplasmiska Ca 2 + koncentrationer. Trots möjligheten som återstår för utredarna att dra sådana slutsatser i en rondell manner, är denna metod för SR Ca 2 + mätningen klart ett indirekt sätt att få fram sådan information, med många begränsningar om tolkningen av insamlade data. För att kringgå detta tydlig begränsning, är det nödvändigt att mäta mängden av Ca2 + hittades direkt i SR luminala nätverket.
Vital till det slutliga resultatet av att kunna spela in direkt intraluminala SR Ca 2 + nivåer är cellodlings verktyg och Ca2 + indikator. För de data som refereras i den aktuella manuskriptet, är det viktigt att notera att VSMC användes kom från en frusen cellinje. Celler odlades i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) + 10% serum från nyfödd kalv (NCS) över passager 22-26 för de beskrivna experimenten, inkuberades vid en konstant 37 ° C med 5% CO2 försörjningen. Med användning av den aktuella metoden, till exempel, celler har mycket framgångsrikt odlas på en proteinblandning som simulerar den extracelluläramiljö med många olika typer av vävnad 15. Viktigt för framgång längs venen av SR Ca 2 + forskning är den typ av proteinblandning som används; i det här fallet var en låg tillväxtfaktor mängd nödvändig för att undvika komponenter i det här verktyget från att påverka den vanliga Ca2 + signalering och rörelser som förekommer ständigt inom de testade cellerna. Efter framgångsrik tillväxt av testceller, Ca 2 + indikator måste också effektivt införas för att dessa odlade celler. Detta har blivit möjligt genom att använda en adenovirusvektor som bär SR-bor Ca 2 + indikator D1SR. Att uppnå en hög transfektionseffektivitet, måste cellerna inkuberas med virala vektorer under minst 36 till 48 h före avbildning. Denna beredning ger ett pålitligt verktyg för att mäta Ca 2 + transienter inom SR lumen med hög noggrannhet och reproducerbarhet.
D1SR indikator som används i detta protokoll är en modifierad variant av D1ER Ca2 + indicator som ursprungligen skapades av Dr Roger Tsien laboratorium vid University of California, San Diego, USA 9,16. Den ursprungliga D1ER tillhör en andra generation av genetiskt kodade Ca2 + indikatorer kallas cameleons som visar Ca2 + känsligheter över ett mycket bredare spektrum (0,5-160 pM) jämfört med tidigare Ca2 + indikatorer 9,16. Den nya varianten D1SR, en slags gåva från Dr. Wayne Chen (University of Alberta, Kanada), men bär en mutant calsequestrin sekvens (i stället för en kalretikulin sekvens som i den ursprungliga D1ER). Mutanten calsequestrin har en reducerad bindning till Ca2 + som eliminerar problemet att konkurrera med endogen calsequestrin i bindning till Ca 2 + i SR lumen 11. Den D1SR Indikatorn bär en stympad förbättrad cyan fluorescerande protein (GFP) och den gula fluorescerande protein (YFP) som binder genom en länkprotein innehållande modifierad calmodulin (CAM) och M13 (than 26-rest-peptid av myosin lätta kedjan kinas som binder till CAM) sekvenser. Cam-M13-sekvensen har modifierats för att förhindra M13 från att binda till endogen kalmodulin. Dessutom, för att säkerställa SR retention, en calsequestrin sekvens har lagts på 5'-änden av GFP 11. När den är bunden till Ca 2+, går CaM-M13-domänen genom konformationsförändringar som resulterar i en ökning av energiöverföringen mellan den flankerande GFP och YFP, som registreras som en ökning i FRET signalintensitet. Å andra sidan, när koncentrationen av SR luminal Ca 2 + droppar, går CaM-M13-domänen genom omvända konformationsförändringar, vilket resulterar i en minskning av energiöverföringen mellan den flankerande GFP och YFP, och en betydande nedgång i FRET signalintensitet .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Alla experiment och förfaranden genomfördes i samförstånd med Laboratory Biosafety riktlinjer University of British Columbia, Vancouver, Kanada.
1. Framställning av 35 mm glasbotten odlingsskålar för FRET-baserade konfokalmikroskopi
- Förbereda plattor med användning av följande procedur 36-48 h före experiment.
- Hämta valt geléform proteinblandning och 0,25% trypsin-EDTA från -20 ° C lagring och hålla dem i mobil isbad fram till användning.
OBS: Beläggningsproteinblandningen bör endast utsättas för RT under en kort tidsperiod för att förhindra blandningen från att stelna före användning. Trypsinlösning bör också hålla kylt tills det behövs; alternativt kan trypsin hämtas från -20 ° C lagring efter slutförandet av steg 1,5. - Bered en 1:25 utspädning av proteinblandning: DMEM (utan tillsatt serum, kyld). Överför lämplig volym av proteinblandning / DMEM till varje platta förbereds. För 35 mm glasbottnade plattor, tillsätt ca 200 l för att helt täcka inre glas cirkel på botten av plattan.
- Låt plattorna sitta i minst 30 minuter inne i säkerhetsskåpet och vid RT. Varm DMEM med 10% NCS till 37 ° C i vattenbad under denna tidsperiod.
- Varmt trypsin i vattenbad till 37 ° C omedelbart före nästa steg.
- Ta bort DMEM som är närvarande i odlingsflaskan med hjälp av en glaspipett och sug. Tvätta golvet i kolven med varmt steril PBS för att avlägsna kvarvarande DMEM rester.
- Rubba tidigare odlade glatta muskelceller från kolv botten:
OBS: Flask bildades dagar till det här steget för att tillåta cellerna att nå önskad konfluens (ca 80%) innan platt förberedelse. Cellerna ursprungligen upphängd i kolven i 20 ml DMEM med 10% NCS och odlades vid 37 ° C med 5% CO2 tillförsel under 24 timmar, varefter DMEM utbudet var uppdateras och celler återfördes till inkubatorn. DMEM var uppdateras every 48 timmar efter dessa första steg tills cellerna nådde konfluens.- Tvätta kolv snabbt med 1 ml trypsin och sedan ta bort en ml trypsin med hjälp av sug.
- Lägg i ytterligare 1 ml trypsin och låt stå längre tid (ca 30-60 sek), swishing kolv för att säkerställa att enzymet kommer i kontakt med hela botten av kolven.
- Se hur mycket celler har lossnat under ett mikroskop tills nöjd med separation från kolven. Alternate swishing trypsinlösning och kontrollera cell lossnar tills nöjd med andelen celler separerade från kolven.
OBS: Kolven kan returneras till inkubatorn i ca 30-60 sek för att påskynda denna process vid 37 ° C. - När cellerna har lossnat användning av trypsin, tillsätt färskt DMEM med 10% NCS till kolven för att stoppa trypsin reaktion (tillräcklig volym så att trypsin bildar 1/8: e av den totala volymen i flaska).
OBS: Till exempel, vid användning av en 250 ml odlingskolv, skulle dettavara 7 ml DMEM tillsätts till 1 ml av trypsin för att resultera i 8 ml cellösning.
- Överföring resulterande cell lösning från kolven till en ren (märkta) 50 ml koniska rör.
- Tillsätt 1 ml färsk DMEM plus 10% NCS till varje platta förbereds (tillräckligt medel för att hålla 24 timmar).
- Vänd försiktigt rör innehållande cell lösning flera gånger för att bryta upp någon pellet som kan ha bildats.
- Pipettera önskad volym av försiktigt blandad cell lösningen i varje platta.
OBS: rekommenderas SMC antal pläterade för detta protokoll är 0,5-0,8 x 10 6 per 35 mm odlingsskålar. Dessa siffror kan variera beroende på celltypen och ska testas och modifieras av varje laboratorium. - Snurra varje platta ordentligt medurs / moturs för att säkerställa en jämn fördelning av celler över glasbotten.
2. Transient transfektion med adenovirala vektor som bär D1SR Ca 2 + Indikator
- Efter tillsats av migDIUM och cell lösning till varje platta, låt plattorna inkubera vid 37 ° C med 5% CO2 tillförseln under minst en timme för att tillåta cellerna att fästa ordentligt till glas på botten av rätter. Kontrollera plattor under ett mikroskop med 15 minuters intervall tills cellerna är tydligt bifogas.
- Hämta adenovirus-D1SR alikvot från -80 ° C lagring och hålla mobil isbad för att transportera till biologisk säkerhet skåp.
- Pipett önskade dosen (infektionsmultiplicitet av 100) av den kylda D1SR till varje platta.
OBS: Beräkningen för volymen av adenovirus lösning som behövs per platta beror på virustiter i den ursprungliga stamlösningen, som presenteras som plackbildande enhet (PFU). Baserat på vår erfarenhet, rekommenderar vi en mångfald av infektion (MOI) av 100, vilket tolkas som siffer eller viruspartiklar som behövs för att infektera en glatta muskelceller (SMC) i odlingsplattan. - Inkubera de infekterade cellerna vid 37 ° C med 5% CO2 tillförsel O / N.
- Nästa dag, fylla cellerna med 1 ml av färsk DMEM plus 10% NCS.
- Inkubera plattorna i en fuktad inkubator vid 37 ° C i 5% CO 2 O / N.
3. Mätning av SR Luminal Ca2 + Använda FRET-baserade Confocal Imaging
- Följande O / N inkubation, ta bort odlingsmediet från plattan.
- Tvätta odlingsplatta med 1 ml varm fysiologiska HEPES-PSS buffert innehållande (i mmol·L - 1) NaCl 140, glukos 10, KCl 5, HEPES 5, CaCl2 1,5 och MgCl2 1 (pH 7,4) tre gånger.
- Tillsätt 1 ml färsk varm HEPES-PSS buffert omedelbart före initiering av inspelningen.
- Utför inledande avbildning med FRET SE (sensibiliserade Emission) ansökan (eller liknande funktion) på konfokalmikroskop är tillhörande programvara.
- När ansökan är öppen, klickar på "Setup" fliken för att justera inställningarna för att uppnå önskade experimentella betingelser. <li> manuellt ändra kanalinställningarna så att celler exciteras i följd vid 440 nm (för givaren och FRET kanaler) och 513 nm (för acceptor kanal). Samla emissionsvåglängder på 488 nm (för donator) och 535 nm (för FRET och acceptor).
- Ställa in intensiteten av ljus vid 15% transmission, med 150 ms excitation exponeringstid av celler (inspelningstid för tre sekventiella GFP donator, FRET, och YFP acceptor-kanaler) och 10 sec intervall mellan exponeringar.
OBS: forskare kan också välja att rita flera ROI och har motsvarande intensiteter registreras och visas samtidigt på grafen. Alternativt kan utredarna beskriva en enda ROI för första inspelning, och fortsätt att beskriva flera ROI vid ett senare tillfälle genom att öppna experimentet filen på en dataanalys-orienterad version av programvaran.
OBS: Ytterligare detaljer om de åtgärder som krävs för att ställa in FRET-baserade experiment kan hittas i FRET manualer ansökan guiden. Om mikroskopet inte är utrustad med FRET guiden kan följande protokoll användas för att ställa in parametrar förinspelningen manuellt.
- Att spara data för senare användning, högerklicka över den registrerade kurvan och välj "Export" för att save kalkylbladet med inspelade medelsignalnivåer på utredarens valda enheten.
- Normalisera data från varje enskild experiment genom att dividera varje datapunkt från utgångsintensitetsvärdet observerades vid tidpunkten 0 sek.
- Importera normaliserade data från kalkylblad till en statistisk fil programprojekt genom att manuellt kopiera och klistra in relevanta datarader från sin ursprungliga kalkylblad / sek.
- Automatiskt generera grafer som motsvarar de datamängder klistras in i programmet.
OBS: Programmets standardinställningar genererar linjediagram från importerade data. Typ av diagram som visas kan ändras genom att klicka på "Välj en annan typ av diagram" knappen under "Change" rubrik inom huvudverktygsraden. - Pool data som representerar flera oberoende försök inom en större grupp av identiska experiment till en enda datablad för att producera ett genomsnittligt spår för det specifika test som utförs.
- Lös upp 0,0125 g Pluronic Acid (PA) i 1 ml dimetylsulfoxid (DMSO) i en svart mikrocentrifugrör (har att värma röret i mobil vattenbad för att hjälpa lösa upp PA).
- Hämta ett rör (50 ^ g) av den cytoplasmatiska Ca 2 + indikatorfärgämne (Fluo-4 AM) från -20 ° C lagring.
- Linda röret av färgämnet i folie för att skydda den så mycket som möjligt från kontakt med ljus.
- Pipettera 45 | il av DMSO + PA-lösning in i röret som innehåller färgämnet. Wrap DMSO + PA-lösning i folie och förvara vid rumstemperatur.
- Blanda innehållet i röret noggrant genom att pipettera lösningen upp och ner flera gånger. Alternativt sonikera färgningshylsan under 10 min.
OBS: Båda metoderna av noggrant fördela färgämnet i hela DMSO + PA-lösning kommer att vara tillräcklig; det är helt enkelt en fråga om utredarens önskemål. Om utredaren väljer att sonikera lösningen, detbör göras i ett isolerat område / rum där andra kommer att påverkas av buller. Utredaren bör också använda tunga ljuddämpare för att skydda öronen.- Om sonikering lösning sätter folie förpackade rör innehållande färgämnet i en skum rörhållare och plats inne i 2/3 (med dH 2 O) ultraljudbadet.
- Placera sonikator bad i isolerat område / rum och maskinen på (se skyddande huvudbonad är på plats före ultraljudsbehandling process initierar). Lämna rummet och lämna maskin som kör i 10 minuter innan du stänger av den och hämta röret (hålla inslagna i folie för att skydda mot ljus så länge som möjligt).
- Alikvotera nu grundligt blandade lösningen i mörk mikrocentrifugrör (5 l per rör, bör kunna göra 10 rör totalt).
- Wrap varje alikvot rör i folie. Etikett rör och lagra i torkmedel vid -20 ° C förhållanden fram till användning.
5. Mätning av cytoplasmatisk Ca2 +
- Följ stegen i 1,1-1,12 att förbereda odlingsplattor av råttaorta SMC.
- Avlägsna odlingsmediet från plattan vid 48 h efter odling.
- Ta bort den tidigare beredda portion av cytoplasma Ca 2 + indikator (5 l) från -20 ° C lagring och behålla mobil isbad fram till användning.
- Tvätta odlingsplatta med 1 ml varm fysiologiska HEPES-PSS buffert innehållande (i mmol·L - 1) NaCl 140, glukos 10, KCl 5, HEPES 5, CaCl2 1,5 och MgCl2 1 (pH 7,4) tre gånger.
- Blanda indikatorn med 1 ml varm HEPES-PSS och ladda den på odlingsplattan.
- Inkubera SMCs med indikatorn under 1 h vid RT (24 ° C).
- Ta bort indikatorn från odlingsplatta och tvätta med 1 ml varm fysiologiska HEPES-PSS buffert tre gånger.
- Tillsätt 1 ml färsk varm HEPES-PSS buffert omedelbart före initiering av inspelningen.
- Fånga seriebilder (512 x 512 pixlar) med en 63X oil-immersionsobjektiv av konfokal inverterat mikroskop.
- manuellt ändra inställningarna så att celler exciteras vid 488 nm och emissionsvåglängderna samlas vid 555 nm med en skanningshastighet på 700 Hz.
- Ställ in ljusintensiteten vid 15% transmission, med 150 ms excitation exponeringstid av celler (den tid som celler utsätts för ljus vid utsedda tidsintervall under inspelning) och 5 sek intervall mellan exponeringarna.
- Stabilisera plattan på mikroskop scenen och börja spela in.
- Registret under åtminstone tre minuter för att säkerställa en stadig basal inspelning av signalen före införandet medlet av intresse.
- Införa Ca2 + -moving medel (t.ex. 2 | iM tapsigargin) som ett verktyg för att tömma SR Ca 2 + (såsom beskrivs i steg 3,16) och fortsätt inspelning för önskad tid efter behandlingen.
- Spela signalstyrkan med hjälp av mikroskop-specifika program genom att ta medelvärdet fluorescens signals (F / F 0) från ett kluster av 5-10 SMC i varje region av intresse (ROI). Samla, format, och analysera data från avbildning med dataanalys programvara. Se steg 3.18.1-3.18.5 för beskrivning av datainsamling och analys med hjälp av denna programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta avsnitt ges exempel på resultat som kan uppnås med hjälp av den beskrivna metoden för att fånga SR luminala Ca2 + koncentrationsdata, jämfört med vanligtvis används sättet för indirekt mätning av ändringar i organell Ca2 + butikskoncentrationer genom att observera variationer i cytoplasma Ca2 + .
Figur 1A visar en ögonblicksbild av ett område av intresse (ROI) i SMC kultur transfekterad med D1SR adenovirus i YFP kanalen (514 nm excitation / 535 nm emission). Såsom visas, även om alla SMC är positiva för D1SR uttryck, är det uppenbart att de expressionsnivåer för D1SR indikator varierar bland olika celler inom samma ROI. Figur 1B visar en 2-D projektion av en fluorescensbild av en SMC transfekterades med D1SR adenovirus (YFP kanal), som presenterar en tydlig bild av Ca2 + distributionsinom den expansiva SR luminala nätverk. Figur 1C visar D1SR indikator fördelning i SMC med användning av GFP (440/488 nm), FRET (440/535 nm) och YFP (514/535 nm) bandpassfilter.
Vi visar också exempel på Ca 2 + signal spår som erhållits från att övervaka förflyttningen av denna riktade jon i SR, med hjälp av den klara testet av akut exponering av celler för en SR tömningsmedel tapsigargin (2 M) (Figur 2). Såsom visas i fig 2A och 2B, inducerar tapsigargin en droppe i SR Ca 2 + innehåll ([Ca2 +] SR).
I figur 3A, har vi visat representativa bilder av odlade SMC laddade med den cytoplasmatiska Ca 2 + indikator behandlas med SR tömningsmedel tapsigargin (2 ^ M). Den observerade övergående toppen i inspelade Ca2 + signal (
Figur 4A visar representativa bilder av odlade SMC uttrycker SR kalciumindikatorn D1SR och behandlades med 100 nm av endotelin-1. Såsom visas i både figurerna 4A och 4B, endotelin-1 inducerar en långsam, men stadig nedgång i SR kalciumhalt, mätt med en droppe i D1SR FRET-signal. Som framgår, den kvotmetriska FRET protokollet tillåter viktigare studie av Ca2 + rörelser direkt relaterade till verkningsmekanismen av medlet som används. Direkt mäta denna jon rörelse i / från den största Ca2 + butik i cellen på detta sätt är användbar för att tillhandahålla resultat representativa för Ca2 + dynamik direkt hör till SR åtgärder eller på grund av förändring si SR lumen miljö.
Figur 1. Fördelning av SR Ca 2 + indikator D1SR i råttaorta SMC. (A) representant avbildar SMC kultur transfekterad med D1SR andenoviral vektor vid 48 h efter infektion. (B) 2-D projektion av en fluorescens bild av D1SR distribution i en odlad SMC använder YFP kanal (514 nm excitation / 535 nm emission). (C) Representant ögonblicksbild av en SMC transfekterades med D1SR indikatorn med GFP (440/488 nm), FRET (440/535 nm) och YFP (514/535 nm) bandpassfilter. Skalstrecken = 10 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
/files/ftp_upload/53912/53912fig2.jpg "/>
Figur 2. tapsigargin orsakar en betydande nedgång i [Ca2 +] SR. (A) i realtid Pseudoögonblicksbilder (FRET kanal) av odlade råttaorta SMC transfekterade med D1SR och behandlades med 2 iM tapsigargin visar en minskning i signalintensitet indikerar en betydande nedgång i SR Ca 2 + innehåll på grund av tapsigargin-inducerad Ca2 + release. (B) representant spår för F / F 0 värde i odlade SMC behandlade med 2 iM tapsigargin bekräftar en betydande nedgång i [Ca2 +] SR. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
figur 3. tapsigargin orsakar en betydande ökning av cytoplasmiska Ca 2 + ([Ca2 +] i). (A) Representativa bilder av odlade råttaorta SMC laddade med cytoplasma Ca2 + indikator, och behandlas med 2 iM tapsigargin. Såsom visas, tapsigargin orsakar en signifikant ökning av signalintensiteten i cytoplasman på grund av frisättning av Ca2 + från SR. (B) representant spår för F / F 0 värde i odlade SMC behandlade med 2 iM tapsigargin. Den visade ökningen av Ca2 + signal anses vara proportionell mot mängden av Ca2 + frigörs från SR. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Endotelin-1 orsakar en betydande nedgång i [Ca2 +] SR. (A) i realtid Pseudoögonblicksbilder (FRET kanal) av odlade råttaorta SMC transfekterade med D1SR och behandlades med 100 nm endotelin-1 visar en långsam men stadig minskning av signalstyrka indikerar en betydande nedgång i SR Ca 2 + innehåll på grund av endotelin-inducerad Ca2 + övergång till SR. (B) representant spår för F / F 0 värde i odlade SMC behandlade med 100 nm av endotelin-1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver transfektion av VSMC med D1SR adenovirus att studera Ca2 + koncentrationer inom lumen av SR. Denna metod gör det möjligt att direkt mätning av Ca2 + i denna organell samt dess rörelse in / ut ur SR som ett resultat av tillämpningen av olika kalcium rörliga medel. Denna metod har många fördelar för utredare som arbetar mot en omfattande förståelse av hur förändringar i SR och cytoplasmiska Ca 2 + nivåer påverka den totala cellulär hälsa och hur dessa förändringar hänger ihop. Traditionell observation av intracellulär Ca2 + rörelse innebär spårning av ändringar endast cytoplasmiska Ca 2 + nivåer. En viktig fördel som härrör från att använda D1SR eller liknande konstruktioner, därför är förmågan att övervaka denna jon rörelse i ett specifikt organell som SR, i stället för att dra vaga slutsatser om effekten av agonister på SR genomindirekt iakttagande av förändringar mot cytoplasmiska Ca2 + nivåer som orsakas av sådan manipulering. Längs samma anda, medel som tjänar till att påverka SR Ca 2 + specifikt kan användas mer effektivt för att bedöma deras effekter på både organell och celltäckande cellulära Ca 2 + koncentrationer och allmänna hälsa. Det är på grund av dessa fördelar att transfektion av odlade celler med D1SR ger en mer direkt, liksom gratis, metod för att mäta ändringar i intraluminala SR Ca2 + nivåer. Av betydelse är det faktum att denna modell ger ett verktyg för att mäta förändringar i Ca 2 + koncentration inom SR nätet som svar på farmakologiska eller fysiologiska medel som är kända för att inducera cellulär stress eller specifika funktionella svar. Detta kommer att vara möjligt genom att generera en kalibreringskurva för D1SR indikator i vilken cell som helst av intresse. Kalciumkoncentrationen inom ER / SR kan då beräknas genom att kalibrera normaliserade D1SR förhållandet (F / F 0) Mot standardkalibreringskurva som beskrivits tidigare 10, 11.
En begränsning av det protokoll som beskrivs här är bristen på information som finns tillgänglig om användning av D1SR konstruktionen i andra celltyper. Denna metod har hittills visat sig vara framgångsrik för råtta SMC i våra studier flera gånger 13-15, även om dess användning med andra celltyper har hittills varit begränsad. För att lyckas med denna metod, är det viktigt att alla åtgärder vidtas för att säkerställa en sund utveckling av de cellodlings steg. Det är därför viktigt att använda ett lämpligt material som tillåter celltillväxt på plattor, såsom många proteinbaserade gelatinösa substanser som finns att köpa som har visat sig främja tillräcklig tillväxt av råttaorta SMC på glasbottnad mikroskopi plattor. Variabilitet i framgången för transfektion med D1SR och efterföljande avbildning kan observeras om cellerna inte är beredda under sin optimala passager och vid hög konfluens. Ändringar phenotype inneboende långvarig användning av samma cellinje kan resultera i suboptimal transfektion och svag signal erhålls under avbildningssteget. Begränsningarna inblandade i användningen av denna metod är därför i huvudsak de som gjorts oundviklig av den erforderliga cellodlingsarbete, som experiment som använder D1SR konstruktionen måste vara beredd på åtminstone 36-48 timmar före deras genomförande för att säkerställa konfluens av celler för avbildning och tillräcklig tid för inkubation av växande celler med adenovirus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av medel från den kanadensiska Institutes of Health Research [MOP-1112666 till CVB & ME].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate) | Life technologies | 11995-065 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml | Corning | 356230 | Keep at -20 °C until right before use |
| Newborn Calf Serum | Sigma-Aldrich | Keep at -20 °C until right before use | |
| 35 mm glass-bottomed plates | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| 250 ml 0.2 μM vented blue plug seal cap flask | BD Falcon | 353136 | |
| Trypsin/EDTA Solution | Life technologies | 25200056 | Keep at -20 °C until right before use |
| 50 ml Polypropylene Conical Tube | BD Falcon | 352070 | |
| D1SR | N/A | N/A | Gift |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8779 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Fluo 4-AM | Life technologies | F-23917 | Keep at -20 °C until right before use |
| 1.5 ml Black Microcentrifuge Tubes | Argos Technologies | T7100BK | |
| Leica TCS SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application) | Leica Microsystems | ||
| GraphPad Prism 5.0 | GraphPad Software, Inc. |
References
- Hennings, H., Michael, D., Cheng, C., Steinert, P., Holbrook, K., Yuspa, S. H. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Whitfield, J. F., et al. The roles of calcium and cyclic AMP in cell proliferation. Ann N Y Acad Sci. 339 (1), 216-240 (1980).
- Nicotera, P., Orrenius, S.
- Wei, C., Wang, X., Chen, M., Ouyang, K., Song, L. S., Cheng, H. Calcium flickers steer cell migration. Nature. 457 (7231), 901-905 (2009).
- Ashby, M. C., Tepikin, A. V. ER calcium and the functions of intracellular organelles. Sem Cell Dev Biol. 12 (1), 11-17 (2001).
- Mattson, M. P. ER calcium and Alzheimer's disease: in a state of flux. Sci signal. 3 (114), (2010).
- Rutkowski, D. T., Kaufman, R. J. A trip to the ER: coping with stress. Trends Cell Biol. 14 (1), (2004).
- Schroder, M., Kaufman, R. J. ER stress and the unfolded protein response. Mutat Res. 569 (1-2), 29-63 (2005).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).
- Poburko, D., Liao, C. H., van Breemen, C., Demaurex, N. Mitochondrial regulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in vascular smooth muscle cells. Circ Res. 104 (1), 104-112 (2009).
- Esfandiarei, M., Fameli, N., Choi, Y. Y., Tehrani, A. Y., Hoskins, J. G., van Breemen, C. Waves of calcium depletion in the sarcoplasmic reticulum of vascular smooth muscle cells: an inside view of spatiotemporal Ca2+ regulation. PloS one. 8 (2), e55333 (2013).
- Cobbold, P. H., Rink, T. J. Fluorescence and bioluminescence measurement of cytoplasmic free calcium. Biochem J. 248 (2), 313-328 (1987).
- Park, M. K., Ashby, M. C., Erdemli, G., Petersen, O. H., Tepikin, A. V. Perinuclear, perigranular and sub-plasmalemmal mitochondria have distinct functions in the regulation of cellular calcium transport. The EMBO journal. 20 (8), 1863-1874 (2001).
- Lovett, J. L., Sibley, L. D. Intracellular calcium stores in Toxoplasma gondii govern invasion of host cells. J Cell Sci. 116 (14), 3009-3016 (2003).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
- Palmer, A. E., et al. Ca2+ indicators based on computationally redesigned calmodulin-peptide pairs. Chem Biol. 13 (5), 521-530 (2006).
