Måling av kalsium svingninger i løpet av sarkoplasmatisk retikulum av dyrkede glatte muskelceller Bruke FRET basert Confocal Imaging

Introduction

Ca ^{2 +} er et meget viktig ion finnes i overflod i hver eneste celle i kroppen. Den har viktige roller i mange ulike cellulære funksjoner, inkludert vekst, spredning, migrasjon, og apoptose ^1-4. Det er godt etablert at Ca2 ⁺ kan påvirke disse prosessene gjennom både direkte og indirekte handlinger, og derfor kan endringer i de vanlige intracellulære konsentrasjoner av dette ion lett resultere i negative resultater for berørte celler. SR er regnet som den største intracellulære Ca ²⁺ butikken i cellen ^fem. Steady state nivåer av Ca ²⁺ i både SR og cytoplasma er normalt vedlikeholdt gjennom konstant forandring inn i og ut av Ca ²⁺ -transporting kanaler av denne organeller. De stressende forhold pålagt celler på grunn av noen form for skade eller sykdom er ofte forbundet med betydelige endringer i SR Ca ²⁺ som går på å ha langvarige effekter på hanalth av cellen. I de mest alvorlige tilfeller av manglende evne en stresset celle gjenopprette og opprettholde stabil tilstand SR Ca ²⁺ nivåer kan også munne ut i død ved apoptose ^6-8.

Nåværende forskning på cellulære Ca ²⁺ dynamikken er begrenset av det faktum at få studier test organ Ca ²⁺ lagre innhold direkte ^9-11. Den vanligste praksisen i stedet innebærer måling av cytoplasmatiske Ca ²⁺ nivå som indirekte målinger av endringer i SR Ca ²⁺ innhold ^12-14. I disse forsøk er Ca ²⁺ vanligvis indusert til å bli frigitt fra SR ved bruk av farmakologiske midler som forårsaker organeller sin uttømming (f.eks thapsigargin). Konklusjoner blir dratt med hensyn til endringer i SR Ca ²⁺ basert på svingninger i cytoplasma Ca ²⁺ konsentrasjoner. Til tross for muligheten rester for etterforskere å trekke slike konklusjoner i en rundkjøring manner, er denne metoden for SR Ca ^{2 +} måling klart en indirekte måte for å fange opp slike opplysninger, med mange begrensninger vedrørende tolkningen av innsamlede data. For å omgå denne klar begrensning, er det nødvendig å måle mengden av Ca ²⁺ funnet direkte i SR luminal nettverket.

Avgjørende for det endelige resultat av å være i stand til direkte å ta opp intraluminale SR Ca ^{2 +} nivåene er cellekulturverktøy og Ca2 ⁺ indikator som brukes. For data som det refereres til i det aktuelle manuskript, er det viktig å merke seg at VSMCs brukt kom fra en frossen cellelinje. Celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) + 10% nyfødt kalveserum (NCS) i løpet av 22-26 passasjer for de skisserte eksperimentene, ble inkubert med en konstant 37 ° C med _5% CO2 tilførsel. Ved å bruke den aktuelle fremgangsmåten, for eksempel celler som har vært meget vellykket dyrkes på en proteinblanding som simulerer det ekstracellulæremiljø av mange forskjellige typer av vev ^15. Viktig for å lykkes langs vein av SR Ca ²⁺ forskning er en type protein blanding som brukes; i dette tilfellet, en lav vekstfaktor variasjon var nødvendig for å unngå komponenter av dette verktøyet fra å påvirke det faste Ca ²⁺ signalering og bevegelser stadig forekommer innenfor de testede cellene. Etter vellykket vekst av testceller, Ca ²⁺ indikatoren må også være effektivt introdusert til disse dyrkede celler. Dette har blitt mulig ved hjelp av en adenovirus vektor som bærer SR-bosatt Ca ²⁺ indikator D1SR. For å oppnå en høy transfeksjonseffektivitet, må cellene inkubert med virale vektorer i minst 36-48 timer før avbildning. Dette preparatet gir et pålitelig verktøy for å måle Ca ^{2 +} transienter innen SR lumen med høy nøyaktighet og reproduserbarhet.

D1SR indikator som brukes i denne protokollen er en modifisert variant av D1ER Ca ²⁺ i-indikator som opprinnelig ble skapt av Dr. Roger Tsien laboratorium ved Universitetet i California, San Diego, USA ^9,16. Den opprinnelige D1ER tilhører en andre generasjon av genetisk kodede Ca ^{2 +} indikatorer som kalles cameleons som viser Ca ²⁺ følsomheter over et mye bredere område (0,5 til 160 uM) i forhold til tidligere Ca ^{2 +} indikatorer ^9,16. Den nye varianten D1SR, en slags gave fra Dr. Wayne Chen (University of Alberta, Canada), derimot, bærer en mutant calsequestrin sekvens (i stedet for en calreticulin sekvens som i den opprinnelige D1ER). Mutant calsequestrin har en redusert binding til Ca ²⁺ som eliminerer problemet med å konkurrere med endogent calsequestrin i binding til Ca ²⁺ i SR lumen ^11. Den D1SR indikatoren bærer en avkortet forbedret cyan fluorescerende protein (CFP) og gul fluorescerende protein (YFP) som binder med en linker proteinholdig modifisert kalmodulin (CaM) og M13 (tHan 26-rest peptid av myosin-lettkjede-kinase som binder seg til cam) sekvenser. CAM-M13 sekvensen har blitt endret for å hindre M13 fra binding til endogene calmodulin. Også, for å sikre SR oppbevaring, en calsequestrin sekvens har blitt lagt på 5 'enden av CFP ^11. Når bundet til Ca ^2+, går CAM-M13 domene gjennom konformasjonsforandringer endringer som resulterer i en økning i energioverføringen mellom flanke CFP og YFP, som er ført som en økning i FRET signal intensitet. På den annen side, når konsentrasjonen av SR luminal Ca ^{2 +} synker, går CaM-M13 domene gjennom omvendte konformasjonsendringer, noe som resulterer i en reduksjon i energioverføringen mellom de flankerende CFP og YFP, og et betydelig fall i FRET signalintensitet .

Protocol

Etikk uttalelse: Alle eksperimenter og prosedyrer ble utført i samsvar med de Laboratory biosikkerhet retningslinjene fra University of British Columbia, Vancouver, Canada.

1. Utarbeidelse av 35 mm Glass-bunn Kultur Retter for FRET basert konfokalmikroskopi

1. Forbered plater med følgende prosedyre 36-48 timer før eksperimenter.
2. Hent valgt geléaktige proteinblanding og 0,25% trypsin-EDTA fra -20 ° C lagring og holde dem i mobile isbad inntil bruk.
   MERK: Belegget proteinblanding bør bare være utsatt for RT i en kort tidsperiode for å hindre blandingen fra å størkne før bruk. Trypsinoppløsning bør også beholde kjølt inntil nødvendig; alternativt kan trypsin hentes fra -20 ° C lagring etter fullførelse av trinn 1.5.
3. Forbered en 1:25 fortynning av proteinblanding: DMEM (ingen ekstra serum, kjølt). Overfør passende volum av proteinblanding / DMEM for hver plate å være forberedt. For 35 mm glass-bunn plater, legge ca 200 mL å fullt ut dekke indre glass sirkel på bunnen av tallerkenen.
4. La platene til å sitte i minst 30 minutter innenfor sikkerhetsskap og ved RT. Varm DMEM med 10% NCS til 37 ° C i vannbad i løpet av denne tidsperioden.
5. Varm trypsin i vannbad til 37 ° C umiddelbart før neste trinnene.
6. Fjern DMEM som er i kultur kolbe ved hjelp av et glass pipette og sug. Vask etasje av kolben med varm steril PBS for å fjerne gjenværende rester DMEM.
7. Løsne tidligere dyrkede glatte muskelceller fra kolbe bunnen:
   MERK: Flask ble etablert dager til dette skrittet for å tillate celler for å nå ønsket konfluens (ca. 80%) før plate forberedelse. Celler ble opprinnelig opphengt i kolben i 20 ml DMEM med 10% NCS og inkubert ved 37 ° C med _5% CO2 tilførsel i 24 timer, hvoretter DMEM tilførsel holdt seg i ro, og cellene ble returnert til inkubatoren. DMEM ble fornyet every 48 timer etter disse innledende trinnene til cellene nådde konfluens.
   1. Vask kolbe raskt med 1 ml trypsin og ta deretter en ml trypsin bruker sugekraft.
   2. Legg inn en annen 1 ml trypsin og la stå i lengre tid (ca. 30-60 sekunder), swishing kolbe for å sikre at enzymet er i kontakt med hele bunnen av kolben.
   3. Observere hvor mye cellene har frittliggende under et mikroskop inntil fornøyd med separasjon fra kolbe. Alternativ swishing trypsin løsning og sjekker cellen avløsning før fornøyd med andelen av celler skilt fra kolbe.
      MERK: Kolben kan returneres til inkubatoren i ca 30-60 sek for å fremskynde denne prosessen ved 37 ° C.
   4. Når cellene er blitt løsnet ved hjelp av trypsin, tilsett friskt DMEM med 10% NCS til kolben for å stoppe trypsin reaksjonen (tilstrekkelig volum slik at trypsin danner 1/8 ^th av det totale volum i kolben).
      MERK: For eksempel, når du bruker en 250 ml kultur kolbe, ville dettevære 7 ml DMEM tilsatt til 1 ml av trypsin til å resultere i 8 ml celleløsning.
8. Overføring resulterende celle oppløsning fra kolben til en ren (merket) 50 ml konisk rør.
9. Tilsett 1 ml friskt DMEM pluss 10% på norsk sokkel til hver plate under utarbeidelse (tilstrekkelig medium til å vare 24 timer).
10. Vend forsiktig røret som inneholder celleløsning flere ganger for å bryte opp noen pellet som kan ha dannet.
11. Pipetter ønskede volum på forsiktig blandet celleløsning inn i hver plate.
    MERK: anbefalt SMC antall belagt for denne protokollen er 0,5-0,8 x 10 ⁶ per 35 mm kultur retter. Disse tallene kan variere avhengig av hvilken celletype og skal testes, og modifisert ved hver laboratorium.
12. Swirl hver plate grundig med / mot klokka for å sikre lik fordeling av celler over glassbunn.

2. Transient transfeksjon med Adenoviral Vector Bære D1SR Ca ²⁺ Indicator

1. Etter tilsetning av megdium og celleløsning til hver plate, la platene inkuberes ved 37 ° C med 5% CO ₂ spenningen i minst 1 time for å tillate cellene å feste skikkelig til glass på undersiden av tallerkner. Sjekk plater under et mikroskop ved 15 minutters intervaller inntil cellene er klart festet.
2. Hent adenovirus-D1SR delmengde fra -80 ° C lagring og holde mobil isbad å transportere til biologisk sikkerhetskabinett.
3. Pipette ønskede dose (multiplisitet av infeksjon på 100) kjølt D1SR til hver plate.
   MERK: Beregningen for volumet av adenoviral løsning nødvendig per plate avhenger av virustiter i den opprinnelige stamløsningen, som er presentert som en plakett dannende enhet (PFU). Basert på vår erfaring, anbefaler vi et mangfold av infeksjon (MOI) på 100, som blir tolket som tall eller viruspartikler for å infisere en glatt muskelcelle (SMC) i kultur plate.
4. Inkuber de infiserte cellene ved 37 ° C med _5% CO2 tilførsel O / N.
5. Neste dag, fylle celler med 1 ml friskt DMEM pluss 10% norsk sokkel.
6. Inkuber platene i en fuktet inkubator ved 37 ° C i 5% CO ₂ O / N.

3. Måling av SR Luminal Ca ²⁺ Bruke FRET basert Confocal Imaging

1. Følgende O / N inkubering, fjernes kulturmediet fra platen.
2. Vask kulturplaten med 1 ml varm fysiologiske HEPES-PSS-buffer inneholdende (i mmol·L ^{- 1)} NaCl 140, glukose 10, KCI 5, HEPES 5, _CaCl2 1,5 og 1 _MgCl2 (pH 7,4) tre ganger.
3. Tilsett 1 ml ferskt varmt HEPES-PSS buffer umiddelbart før oppstart av opptaket.
4. Utføre innledende avbildning ved hjelp gnage SE (Følsomme Emission) applikasjon (eller lignende funksjon) på konfokalmikroskop sin tilhørende programvare.
   1. Når søknaden er åpen, klikker du på "Setup" -kategorien for å justere innstillingene for å oppnå ønskede eksperimentelle forhold.
   <li> endre manuelt kanalinnstillingene slik at cellene er glade i sekvens på 440 nm (for giver og FRET kanaler) og 513 nm (for akseptantmediumet kanal). Samle emisjonsbølgelengder på 488 nm (for donor) og 535 nm (for gnage og akseptor).
   2. Sett lysintensiteten på 15% overføring, med 150 ms eksitasjon eksponeringstid av celler (opptakstid for tre sekvensiell CFP donor, slite, og YFP akseptor kanaler) og 10 sek intervaller mellom eksponeringer.
5. Stabil plate på mikroskopet scenen.
6. Bruk "live" -knappen for å sjekke bildeoppløsning. Tweak innstillingene ytterligere inntil ønsket oppløsning er nådd.
7. Fortsatt under "Oppsett" -kategorien, ta et bilde av prøven ved hjelp av "Ta bilde" -knappen.
8. Flytte til "Evaluering" -kategorien, velger den riktige metoden for å beregne gnage effektivitet for forsøkene som blir gjort. Metode 3, ved hjelp av Proporsjonal Beregning [E _A (i) = B / A], Anbefales for forsøk med cameleons som D1SR indikator.
9. Bytt over til "Graph" -kategorien for å kunne observere intensitetsverdiene som registreres i grafisk form under forsøket.
10. Tegn en ROI i bildevisningen for å observere den tilsvarende gjennomsnittlig intensitet i dette området av interesse på grafen som eksperiment inntektene.
    MERK: Investigator kan også velge å tegne flere Rois og har tilsvarende intensiteter registreres og vises samtidig på grafen. Alternativt kan etterforskere skissere en enkelt ROI for første innspillingen, og fortsett å skissere flere ROIs på et senere tidspunkt ved å åpne eksperimentet filen på en dataanalyse orientert versjon av programvaren.
    Merk: Ytterligere detaljer på trinnene som kreves for å sette opp FRET baserte eksperimenter kan bli funnet i FRET søknad veiviseren manualer. Hvis mikroskop er ikke utstyrt med veiviseren slite, kan følgende protokoll brukes til å sette opp parametrene foropptak manuelt.
11. Starte opptak og tillate datainnsamling i minst 3 minutter for å sikre en stabil basal opptak av signalet før innføring av midlet er av interesse.
12. Introduser Ca ²⁺ -moving middel (f.eks 2 mikrometer thapsigargin; 100 nm endotelin-1) som et verktøy for å tappe SR Ca ^2+, ved å manuelt pipettere den forhåndsbestemte dose direkte inn platen på et sted så nær regionen av interesse velvære registreres som mulig. Fortsett å ta opp for en ønsket tid etter behandling.
13. Capture proporsjonal FRET seriebilder (512 x 512 piksler) med en 63X olje nedsenking målet med konfokal invertert mikroskop bruker FRET SE programmet.
14. Samle inn data som følge av avbildning fra en klynge av 5-10 SMC i hver region av interesse (ROI) og deretter formatere og analysere ved hjelp av statistikk-basert programvare.
    1. For å lagre data for senere bruk, høyreklikker over innspilte spor, og velg "Export" for å save regnearket med innspilte gjennomsnittssignalintensitet på etterforsker valgt stasjon.
    2. Normalisere data fra hver enkelt eksperiment ved å dividere hvert datapunkt ved utgangsintensitetsverdien holdes ved tidspunkt 0 sekunder.
    3. Import normaliserte data fra regneark i et statistikkprogram prosjekt fil manuelt ved å kopiere og lime inn relevante data rader fra sin opprinnelige regnearket / sek.
    4. Automatisk generere grafer som tilsvarer datasettene limes inn i programmet.
       MERK: programmets standardinnstillinger generere linje grafer fra importerte data. Type graf vises kan endres ved å klikke på "Velg en annen type graf" knappen under "Endre" overskriften innenfor hovedverktøylinjen.
    5. Pool data som representerer flere uavhengige studier innenfor en større gruppe av identiske eksperimenter i en enkelt datablad for å produsere en gjennomsnittlig spor for den spesifikke testen utføres.
4. Fremstilling av Cytoplasmatisk Ca ²⁺ Indikator
1. Oppløs 0,0125 g Pluronic syre (PA) i 1 ml dimetylsulfoksyd (DMSO) i en svart mikrosentrifugerør (kan ha til å varme opp røret i mobil vannbad for å oppløse PA).
2. Hente et rør (50 ug) av det cytoplasmatiske Ca ²⁺ indikatorfarge (Fluo-4 AM) fra -20 ° C lagring.
3. Pakk tube av fargestoff i folie for å beskytte det så mye som mulig fra kontakt med lys.
4. Pipetter 45 ul av DMSO + PA oppløsning inn i røret som inneholder fargestoffet. Pakk DMSO + PA løsning i folie og oppbevares ved romtemperatur.
5. Bland Innholdet i røret grundig ved pipettering løsningen opp og ned flere ganger. Alternativt sonikere fargestoff røret i 10 min.
   MERK: Begge metodene for grundig distribusjon av fargestoff hele DMSO + PA løsning vil være tilstrekkelig; det er bare et spørsmål om etterforskeren preferanser. Hvis etterforsker velger å sonicate løsning, detbør gjøres i et isolert område / rom der andre vil være upåvirket av støy. Etterforsker bør også bruke tunge lyddempere for å beskytte ørene.
   1. Hvis sonicating løsning, setter folie-innpakket rør som inneholder fargestoffet i et skum rørholder og sted inne i 2/3 full (med dH ₂ O) ultralydbadet.
   2. Plasser ultralyd bad i isolert område / rom og makt maskinen (sikre beskyttende hodeplagg er på plass før oppstart sonikasjonsprosessen). Forlate rommet og la maskinen gå i 10 minutter før du slår den av og hente røret (holde innpakket i folie for å beskytte mot lys så lenge som mulig).
6. Alikvot den nå grundig blandet oppløsning inn i mørke mikrosentrifugerør (5 ul per rør, bør være i stand til å gjøre 10 rør totalt).
7. Pakk hver delmengde rør i folie. Merk rør og lagrer i tørkemiddel ved -20 ° C forhold inntil bruk.

5. Måling av Cytoplasmatiske Ca ²⁺

1. Følg trinnene i 01.01 til 01.12 for å forberede kulturplater av rotte aorta SMC.
2. Fjerne kulturmediet fra platen ved 48 timer etter kulturen.
3. Fjern det tidligere fremstilte delmengde av cytoplasmisk Ca2 ⁺ indikator (5 ul) fra -20 ° C lagring og opprettholde i mobil isbad inntil bruk.
4. Vask kulturplaten med 1 ml varm fysiologiske HEPES-PSS-buffer inneholdende (i mmol·L ^{- 1)} NaCl 140, glukose 10, KCI 5, HEPES 5, _CaCl2 1,5 og 1 _MgCl2 (pH 7,4) tre ganger.
5. Bland indikator med 1 ml varmt HEPES-PSS og legger det på kulturplaten.
6. Inkuber SMC med indikatoren i 1 time ved romtemperatur (24 ° C).
7. Fjern indikatoren fra kultur plate og vask med 1 ml varme fysiologiske HEPES-PSS buffer tre ganger.
8. Tilsett 1 ml ferskt varmt HEPES-PSS buffer umiddelbart før oppstart av opptaket.
9. Capture seriebilder (512 x 512 piksler) med en 63X oil-neddykking Formålet med konfokalt invertert mikroskop.
   1. endre manuelt innstillingene slik at cellene er spent på 488 nm, og emisjonsbølgelengder er samlet på 555 nm med en skannehastighet på 700 Hz.
   2. Angi intensiteten av lys ved 15% overføring, med 150 msek eksitasjon eksponeringstid av celler (hvor mye tid som cellene blir utsatt for lys i det angitte tidsintervaller under innspilling) og 5 sek intervaller mellom eksponeringer.
10. Stabil plate på mikroskopet scenen og starte innspillingen.
11. Ta opp i minst 3 minutter for å sikre en stabil basal opptak av signalet før innføring av midlet er av interesse.
12. Introduser Ca ²⁺ -moving middel (f.eks 2gm thapsigargin) som et verktøy for å tappe SR Ca ²⁺ (som beskrevet i trinn 3.16) og fortsett opptak for ønsket tid etter behandling.
13. Record signalintensitet bruker mikroskop-spesifikk programvare ved gjennomsnitt fluorescens signals (F / F ₀₎ fra en klynge av 5-10 SMC i hver region av interesse (ROI). Samle, format og analysere data som følge av avbildning ved hjelp dataanalyse programvare. Se trinn 3.18.1-3.18.5 for beskrivelse av datainnsamling og analyse ved hjelp av denne programvaren.

Representative Results

Denne delen inneholder eksempler på resultater som kan oppnås ved bruk av den beskrevne metode for å fange SR luminal Ca ²⁺ konsentrasjonsdata, sammenlignet med vanlig ansatt slags indirekte måling av endringer i organ Ca ²⁺ store konsentrasjoner ved å observere endringer i cytoplasma Ca ²⁺ .

Figur 1A viser et øyeblikksbilde av en region av interesse (ROI) av SMC kultur transfektert med D1SR adenovirus i YFP kanal (514 nm eksitasjon / 535 nm emisjon). Som vist, men alle SMC er positive for D1SR uttrykk, er det åpenbart at uttrykket nivåer for D1SR indikator varierer mellom forskjellige celler i den samme ROI. Figur 1B viser en 2-D projeksjon av et fluorescens bilde av en SMC transfektert med D1SR adenovirus (YFP kanal), som presenterer et klart bilde av Ca ²⁺ distribusjoninnenfor den brede SR luminale nettverk. Figur 1C viser D1SR indikator fordeling i SMC ved hjelp av CFP (440/488 nm), FRET (440/535 nm), og YFP (514/535 nm) båndpassfiltre.

Vi viser også eksempler på Ca ²⁺ signaltraser oppnådd fra overvåke bevegelsene til denne målrettede ion i SR, ved hjelp av den klare test for akutt eksponering av celler til en SR tømme middel thapsigargin (2 uM) (figur 2). Som vist i figur 2A og 2B, induserer thapsigargin et fall i SR Ca ^{2 +} innhold ([Ca2 ^+] _SR).

I figur 3A, har vi vist representative bilder av dyrkede SMC lastet med det cytoplasmatiske Ca ²⁺ indikator behandlet med SR tømmemidlet thapsigargin (2 uM). Den observerte forbigående topp i innspilte Ca ²⁺ signal ( 2+ slipper inn i cytoplasma av SMC, selv om kilden til Ca ^{2 +} transienter ikke kan være eksplisitt identifisert.

Figur 4A viser representative bilder av dyrkede SMC uttrykker SR kalsium indikator D1SR og behandlet med 100 nm av endotelin-1. Som vist i både figurene 4A og 4B, induserer endotelin-1 en sakte, men jevn nedgang i SR kalsiuminnhold som målt ved en reduksjon i D1SR FRET signal. Som det fremgår, er proporsjonal FRET protokollen tillater viktigere studie av Ca ²⁺ bevegelser direkte knyttet til virknings av midlet som brukes. Direkte måle denne ion bevegelser i / fra de største Ca ²⁺ butikken i cellen på denne måten er nyttig å gi resultater representant for Ca ²⁺ dynamikk direkte knyttet til SR handlinger eller på grunn av endring s i SR lumen miljø.

Figur 1. Fordeling av SR Ca ²⁺ indikator D1SR i rotte aorta SMC. (A) Representant bilde som viser SMC kultur transfektert med D1SR andenoviral vektor i 48 timer etter infeksjon. (B) 2-D-projeksjon av et bilde av fluorescens D1SR fordeling i en kultivert SMC ved hjelp av YFP kanal (514 nm eksitasjon / 535 nm emisjon). (C) Representant øyeblikksbilde av en SMC transfektert med D1SR indikator å bruke CFP (440/488 nm), gnage (440/535 nm), og YFP (514/535 nm) band-pass filter. Skala barer = 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

/files/ftp_upload/53912/53912fig2.jpg "/>
Figur 2. Thapsigargin fører til en betydelig nedgang i [Ca ^2+] _SR. (A) Real-time pseudocolor snapshots (FRET kanal) av kultivert rotte aorta SMC transfektert med D1SR og behandlet med 2 mikrometer av thapsigargin viser en nedgang i signalintensitet som indikerer en betydelig nedgang i SR Ca ²⁺ innhold grunn thapsigargin-indusert Ca ²⁺ utgivelse. (B) Representant spor for F / F ₀ verdi i dyrkede SMC behandlet med 2 mikrometer thapsigargin bekrefter et betydelig fall i [Ca ^2+] _SR. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Thapsigargin fører til en betydelig økning i cytoplasmisk Ca2 ⁺ ([Ca2 ^+] _i). (A) Representative bilder av dyrkede rotte aorta SMC lastet med cytoplasmatiske Ca ²⁺ indikator, og behandlet med 2 mikrometer av thapsigargin. Som vist, thapsigargin fører til en betydelig økning i signalintensitet i cytoplasma på grunn av frigjøring av Ca2 ⁺ fra den SR. (B) Representant spor for F / F ₀ verdi i dyrkede SMC behandlet med 2 mikrometer av thapsigargin. Den avbildet økning i Ca ²⁺ signal anses å være proporsjonal med mengden av Ca ²⁺ frigjøres fra SR. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Endotelin-1 fører til en betydelig nedgang i [Ca ^2+] _SR. (A) Real-time pseudocolor snapshots (FRET kanal) av kultivert rotte aorta SMC transfektert med D1SR og behandlet med 100 nm endotelin-1 viser en langsom, men jevn nedgang i signalintensitet som indikerer en betydelig nedgang i SR Ca ²⁺ innhold på grunn av endotelin-indusert Ca ²⁺ utgivelse for SR. (B) Representant spor for F / F ₀ verdi i dyrkede SMC behandlet med 100 nm av endotelin-1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Denne protokollen beskriver transfeksjon av VSMCs med D1SR adenovirus for å studere Ca2 ⁺ konsentrasjoner i lumen av SR. Denne metoden gjør det mulig for den direkte måling av Ca ²⁺ innenfor dette organeller, så vel som dens bevegelse inn i / ut av SR som et resultat av anvendelsen av forskjellige kalsium bevegelige midler. Denne metoden har mange fordeler for etterforskere jobber mot en helhetlig forståelse av hvordan endringer i SR og cytoplasmatiske Ca ²⁺ nivåer påvirke den generelle mobil helse og hvordan disse endringene er inter-relatert. Tradisjonell observasjon av intracellulær Ca ²⁺ bevegelse innebærer sporing av endringer i bare cytoplasmatiske Ca ^{2 +} nivåer. En viktig fordel utledet fra å bruke D1SR eller lignende konstruksjoner, og derfor er evnen til å overvåke dette ion bevegelser som involverer en spesifikk organelle, for eksempel SR, snarere enn å måtte trekke konklusjoner vage på effekten av agonister på SR etterindirekte observere endringer i cytoplasma Ca ²⁺ nivåer indusert av en slik manipulasjon. Langs samme ånd, agenter som tjener til å påvirke SR Ca ²⁺ spesifikt kan mer effektivt brukes til å vurdere deres effekter på både organeller og celle-wide cellulære Ca ²⁺ konsentrasjon og generell helse. Det er på grunn av disse fordelene som transfeksjon av dyrkede celler med D1SR gir en mer direkte, så vel som gratis, fremgangsmåte for måling av endringer i intraluminale SR Ca ^{2 +} nivåer. Også av viktighet er det faktum at denne modellen gir et verktøy for måling av endringer i Ca ²⁺ konsentrasjon innenfor SR nettverk som reaksjon på farmakologiske eller fysiologiske midler som er kjent for å indusere cellulært stress eller spesifikke funksjonelle responser. Dette vil være mulig ved å generere en kalibreringskurve for D1SR indikator i en hvilken som helst celle av interesse. Kalsiumkonsentrasjon i ER / SR kan da beregnes ved å kalibrere normalisert D1SR forholdet (F / F ₀) Mot standard kalibreringskurve som tidligere beskrevet ^{10, 11.}

En begrensning av den protokoll som er beskrevet her er den manglende informasjonen som er tilgjengelig for bruk av D1SR konstruere i andre celletyper. Denne metoden har så langt vist seg vellykket for rotte SMC i våre studier flere ganger ^13-15, selv om dens bruk med andre celletyper har hittil vært begrenset. For å lykkes med denne metoden, er det viktig at alle forholdsregler er tatt for å sikre en sunn progresjonen av celledyrkingsfremgangsmåten. Det er derfor viktig å benytte et egnet materiale som tillater cellevekst på plater, som for eksempel de mange proteinbaserte gelatinøse substanser som kan kjøpes som har vist seg å fremme tilstrekkelig vekst av rotte aorta SMC på glass-bunn mikroskopi platene. Variasjon i suksessen til transfeksjon med D1SR og påfølgende bilde kan observeres hvis cellene ikke er forberedt på sin optimale passasjer og ved høy konfluens. Endringer i phenotype iboende til langvarig bruk av den samme cellelinje kan resultere i suboptimal transfeksjon og svakt signal ble oppnådd i løpet av avbildningstrinnet. Begrensningene involvert i bruken av denne fremgangsmåten er derfor i hovedsak de som er fremstilt uunngåelig ved den ønskede cellekultur arbeid, som forsøk under anvendelse av den D1SR konstruksjonen må være forberedt på minst 36-48 timer forut for deres utførelse for å sikre sammenflytning av celler for avbildning og tilstrekkelig tid for inkubasjon av voksende celler med adenovirus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate)	Life technologies	11995-065	Warm in 37 °C water bath before use
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml	Corning	356230	Keep at -20 °C until right before use
Newborn Calf Serum	Sigma-Aldrich		Keep at -20 °C until right before use
35 mm glass-bottomed plates	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 ml 0.2 μM vented blue plug seal cap flask	BD Falcon	353136
Trypsin/EDTA Solution	Life technologies	25200056	Keep at -20 °C until right before use
50 ml Polypropylene Conical Tube	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Gift
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Keep at -20 °C until right before use
1.5 ml Black Microcentrifuge Tubes	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.