Måling af calcium Udsving Inden for reticulum af dyrkede glatte muskelceller Brug FRET-baserede Konfokal Imaging

Introduction

Ca2 ⁺ er en meget vigtig ion findes i overflod i hver eneste celle i kroppen. Det har betydelige roller i mange forskellige cellulære funktioner, herunder vækst, formering, migrering, og apoptose ^1-4. Det er velkendt, at Ca2 ⁺ kan påvirke disse processer gennem både direkte og indirekte aktioner, og derfor kan ændringer i normale intracellulære koncentrationer af denne ion let føre til negative resultater for de berørte celler. SR betragtes som den største intracellulære Ca2 ⁺ butik i cellen ^5. Steady-state niveauer af Ca2 ⁺ i både SR og cytoplasma normalt vedligeholdt gennem konstant flux ind i og ud af de Ca ^{2 +} -transporting kanaler denne organel. De stressende forhold pålagt celler på grund af enhver form for skade eller sygdom er ofte forbundet med betydelige ændringer i SR Ca ^{2 +,} der går på at have langvarige effekter på hanalth af cellen. I de mest alvorlige tilfælde, at den manglende evne af en stresset celle genoprette og opretholde steady state SR Ca2 ⁺ niveauer kan endda kulminere i død ved apoptose ^6-8.

Aktuel forskning i cellulære Ca ^{2 +} dynamikker er begrænset af det faktum, at kun få studier test organel Ca ²⁺ butik indhold direkte ^9-11. Den mest almindelige praksis i stedet omfatter måling af cytoplasmatiske Ca2 ⁺ niveauer som indirekte målinger af ændringer i SR Ca2 ⁺ indhold ^12-14. I disse eksperimenter er Ca2 ⁺ almindeligvis induceres til at blive frigivet fra SR ved hjælp af farmakologiske midler forårsager organel s depletion (f.eks thapsigargin). Konklusioner derefter tegnet med hensyn til ændringer i SR Ca2 ⁺ baseret på udsving i de cytoplasmatiske Ca ^{2 +} koncentrationer. Trods muligheden resterende for efterforskerne at drage sådanne konklusioner i en rundkørsel manner, denne metode til SR Ca2 ⁺ måling er klart en indirekte måde at indsamle sådanne oplysninger, med mange begrænsninger vedrørende fortolkningen af indsamlede data. For at omgå denne klar begrænsning, er det nødvendigt at måle mængden af Ca2 ⁺ fundet direkte i SR luminale netværk.

Vital til det endelige resultat af at være i stand til direkte at registrere intraluminale SR Ca ^{2 +} niveauer er de cellekultur værktøjer og den Ca2 ⁺ indikator anvendes. For dataene henvises til i den nuværende manuskript, er det vigtigt at bemærke, at VSMC anvendte kom fra en frossen cellelinie. Celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) + 10% serum fra nyfødt kalv (NCS) i løbet af passager 22-26 for de skitserede forsøg inkuberes ved en konstant 37 ° C med _5% CO2 forsyning. Hjælp af den aktuelle fremgangsmåde, for eksempel celler er blevet meget held dyrkes på en proteinblanding, der simulerer den ekstracellulæremiljø af mange forskellige typer af væv ^15. Vigtigt for succes langs venen af SR Ca2 ⁺ forskning er den type proteinblanding anvendes; i dette tilfælde en lav vækstfaktor sort var nødvendigt for at undgå bestanddele af dette værktøj i at påvirke den regelmæssige Ca2 ⁺ signalering og bevægelser forekommer konstant inden de testede celler. Efter en vellykket vækst i testceller, Ca ²⁺ indikatoren skal også effektivt introduceret til disse dyrkede celler. Dette er blevet muligt ved at anvende en adenoviral vektor, som bærer SR-bosiddende Ca2 ⁺ indikator D1SR. For at opnå en høj transfektionseffektivitet, celler inkuberes med virale vektorer i mindst 36-48 timer før billeddannelse. Dette præparat er et pålideligt værktøj til at måle Ca ^{2 +} transienter inden for SR lumen med høj nøjagtighed og reproducerbarhed.

D1SR indikator anvendes i denne protokol er en modificeret variant af D1ER Ca ²⁺ indicator, der oprindeligt blev skabt af Dr. Roger Tsien laboratorium ved University of California, San Diego, USA ^9,16. Den oprindelige D1ER tilhører en anden generation af genetisk indkodede Ca2 ⁺ indikatorer kaldet cameleons der viser Ca2 ⁺ følsomhed over et meget bredere område (0,5-160 uM) i forhold til tidligere Ca2 ⁺ indikatorer ^9,16. Den nye variant D1SR, en venlig gave fra Dr. Wayne Chen (University of Alberta, Canada), dog bærer en mutant calsequestrin sekvens (i stedet for en calreticulin sekvens som i den oprindelige D1ER). Mutanten calsequestrin har en reduceret binding til Ca2 ^+, der eliminerer problemet med at konkurrere med endogent calsequestrin i binding til Ca2 ⁺ i SR lumen ^11. Den D1SR indikator bærer en trunkeret forstærket cyan fluorescerende protein (CFP) og gult fluorescerende protein (YFP), der binder med en linker protein indeholdende modificeret calmodulin (CaM) og M13 (than 26-rest peptid med myosin letkæde-kinase, der binder til CAM) sekvenser. CAM-M13 sekvens er blevet modificeret for at forhindre M13 i at binde til endogen calmodulin. Også for at sikre SR fastholdelse, en calsequestrin sekvens er blevet tilføjet på 5'ende af FFP ^11. Når de bindes til Ca ^2+, CaM-M13 domæne gennemgår konformationelle ændringer, som resulterer i en forøgelse af energioverførsel mellem den flankerende FFP og YFP, som registreres som en stigning i FRET signal intensitet. På den anden side, når koncentrationen af SR luminal Ca2 ⁺ dråber, CaM-M13 domæne går gennem omvendte konformationsændringer, hvilket resulterer i et fald i energioverførsel mellem den flankerende FFP og YFP, og et betydeligt fald i FRET signal intensitet .

Protocol

Etik erklæring: Alle eksperimenter og procedurer blev udført i overensstemmelse med de Laboratory Biosafety retningslinjer fra University of British Columbia, Vancouver, Canada.

1. Forberedelse af 35 mm Glas-bund kultur retter til FRET-baserede konfokalmikroskopi

1. Forbered plader under anvendelse af følgende procedure 36-48 timer før forsøg.
2. Hent valgt gelatinøse protein blandingen og 0,25% trypsin-EDTA fra -20 ° C opbevaring og holde dem i mobil isbad indtil brug.
   BEMÆRK: Belægningen proteinblanding bør kun udsættes for stuetemperatur i en kort periode for at forhindre blandingen at størkne før brug. Trypsinopløsning bør også holde kølet indtil det skal bruges; alternativt kan trypsin hentes fra -20 ° C opbevaring efter afslutning af trin 1.5.
3. Forbered en 1:25 fortynding af protein-blanding: DMEM (ingen ekstra serum, kølet). Overfør passende volumen proteinblanding / DMEM til hver plade forberedes. For 35 mm glas-bund plader, tilføje omkring 200 pi til fuldt ud at dække inderste glas cirkel på bunden af ​​pladen.
4. Pladerne henstår til at sidde i mindst 30 minutter inde i sikkerhedsskab og ved stuetemperatur. Varm DMEM med 10% NCS til 37 ° C i vandbad i denne tidsperiode.
5. Varm trypsin i vandbad til 37 ° C umiddelbart før næste skridt.
6. Fjern DMEM, der er i dyrkningskolbe ved anvendelse af en glaspipette og sugning. Vask gulvet i kolben med varmt sterilt PBS for at fjerne resterende DMEM rest.
7. Fjerne tidligere dyrket glatte muskelceller fra kolbe bottom:
   BEMÆRK: Kolbe blev etableret dage til dette trin for at tillade cellerne at nå ønskede konfluens (ca. 80%), før pladen præparat. Celler blev oprindeligt suspenderet i kolben i 20 ml DMEM med 10% NCS og inkuberet ved 37 ° C med _5% CO2 forsyning til 24 timer, hvorefter DMEM forsyning var opdateres og cellerne blev returneret til inkubatoren. DMEM blev opdateret Evary 48 timer efter disse indledende trin, indtil cellerne nåede sammenflydning.
   1. Vask kolbe hurtigt med 1 ml trypsin og derefter fjerne 1 ml trypsin under anvendelse sugning.
   2. Tilføj i yderligere 1 ml trypsin og henstår i længere tid (ca. 30-60 sek), piskende kolbe at sikre enzymet kommer i kontakt med hele bunden af ​​kolben.
   3. Overhold hvor meget celler har løsrevet under et mikroskop, indtil tilfredse med adskillelse fra kolbe. Alternativ swishing trypsinopløsning og kontrol Cellefrigørelse indtil tilfreds med andelen af ​​celler adskilt fra kolben.
      BEMÆRK: Kolben kan returneres til inkubatoren i ca. 30-60 sekunder at fremskynde denne proces ved 37 ° C.
   4. Når cellerne er blevet løsnet under anvendelse af trypsin, tilføje frisk DMEM med 10% NCS til kolben for at standse trypsin reaktion (tilstrækkeligt volumen, så trypsin danner ^1/8 af den samlede mængde i kolbe).
      BEMÆRK: For eksempel når der anvendes en 250 ml dyrkningskolbe, vil dettevære 7 ml DMEM tilsat til 1 ml trypsin at resultere i 8 ml celle opløsning.
8. Overførsel resulterende celle løsning fra kolben til en ren (mærket) 50 ml konisk rør.
9. Tilsæt 1 ml frisk DMEM plus 10% NCS til hver plade under udarbejdelse (tilstrækkeligt medium til at vare 24 timer).
10. Vend forsigtigt rør indeholdende celleopløsning flere gange for at bryde op nogen pellet, der måtte være dannet.
11. Pipette ønskede mængde forsigtigt blandet celle opløsningen i hver plade.
    BEMÆRK: anbefalede SMC'er nummer forgyldt for denne protokol er 0,5-0,8 x 10 ⁶ pr 35 mm petriskåle. Disse tal kan variere afhængigt af celletypen og bør afprøves og ændres af hvert laboratorium.
12. Swirl hver plade grundigt med uret / mod uret for at sikre lige fordeling af celler tværs glasbund.

2. transient transfektion med adenovirusvektor Carrying D1SR Ca2 ⁺ Indikator

1. Efter tilsætning af migdium og celle opløsning til hver plade, pladerne henstår til at inkubere ved 37 ° C med _5% CO2 forsyning i mindst 1 time for at tillade celler at vedhæfte ordentligt på glas på bunden af skåle. Check plader under et mikroskop ved 15 min intervaller, indtil cellerne er klart knyttet.
2. Hent adenovirus-D1SR portion fra -80 ° C opbevaring og holde i mobil isbad til transport til biologisk sikkerhed kabinet.
3. Pipette ønskede dosis (infektionsmultiplicitet på 100) kølet D1SR til hver plade.
   BEMÆRK: Beregningen for den mængde adenovirale løsning nødvendig pr plade afhænger af virustiteren i den oprindelige stamopløsning, som er præsenteret som plaquedannende enhed (PFU). Baseret på vores erfaringer, anbefaler vi en mangfoldighed af infektion (MOI) på 100, hvilket tolkes som de numeriske eller viruspartikler er nødvendige for at inficere en glatte muskelceller (SMC) i kulturen plade.
4. Inkuber de inficerede celler ved 37 ° C med _5% CO2 forsyning O / N.
5. Næste dag, genopbygge celler med 1 ml frisk DMEM plus 10% NCS.
6. Pladerne inkuberes i en befugtet inkubator ved 37 ° C i 5% CO ₂ O / N.

3. Måling af SR Luminal Ca ²⁺ Brug FRET-baserede Konfokal Imaging

1. Efter O / N inkubation fjernes dyrkningsmediet fra pladen.
2. Vask dyrkningspladen med 1 ml varm fysiologiske HEPES-PSS puffer indeholdende (i mmol·L ^{- 1)} NaCl 140, glucose 10, KCI 5, HEPES 5, _CaCl2 1,5 og _MgCl2 1 (pH 7,4) tre gange.
3. Tilsæt 1 ml frisk varm HEPES-PSS buffer umiddelbart før initiering af optagelsen.
4. Udfør indledende billedbehandling ved hjælp af FRET SE (Sensitized Emission) ansøgning (eller lignende funktion) på konfokal mikroskopets tilhørende software.
   1. Når ansøgningen er åbent, skal du klikke ind på fanen "Setup" for at justere indstillingerne for at opnå de ønskede eksperimentelle betingelser.
   <li> manuelt ændre kanal, så cellerne er glade i rækkefølge ved 440 nm (for donoren og FRET kanaler) og 513 nm (for acceptor kanal). Saml emissionsbølgelængder ved 488 nm (for donor) og 535 nm (for FRET og acceptor).
   2. Sæt intensiteten af ​​lys ved 15% transmission, med 150 ms excitation eksponeringstid på celler (optagetid for tre sekventielle fælles fiskeripolitik donor, FRET, og YFP acceptor kanaler) og 10 sek intervaller mellem engagementer.
5. Stabiliser plade på objektbordet.
6. Brug "live" knappen for at kontrollere billedopløsning. Tweak indstillinger yderligere, indtil ønskede opløsning er nået.
7. Stadig under fanen "Setup", tage et billede af prøven ved hjælp af "Capture billede" knappen.
8. Flytning til den "Evaluering" fanen, vælge den rigtige metode til at beregne FRET virkningsgrader for forsøgene bliver gjort. Metode 3, ved hjælp af den Ratiometrisk Beregning [E _A (i) = B / A], Anbefales til forsøg med cameleons såsom D1SR indikator.
9. Skift til fanen "Graph" at være i stand til at overholde værdierne intensitet, der optages i grafisk form i løbet af eksperimentet.
10. Tegn en ROI i billedfremviseren for at observere den tilsvarende gennemsnitlige intensitet i dette område af interesse på grafen som eksperimentet skrider frem.
    BEMÆRK: Investigator kan også vælge at tegne flere ROI'er og har tilsvarende intensiteter registreres og vises samtidigt på grafen. Alternativt kan efterforskerne skitsere en enkelt ROI for første optagelse, og gå videre til skitsere flere ROI'er på et senere tidspunkt ved at åbne eksperimentet fil på en analyse af data-orienterede version af softwaren.
    BEMÆRK: Yderligere oplysninger om de nødvendige skridt til at oprette FRET-baserede eksperimenter kan findes i FRET ansøgning guiden manualer. Hvis mikroskopet ikke er udstyret med guiden FRET, kan følgende protokol bruges til at opsætte parametre foroptagelsen manuelt.
11. Start optagelse og tillade dataindsamlingen i mindst 3 min for at sikre en stabil basal optagelse af signalet før indføre agent for interesse.
12. Indføre Ca2 ⁺ -I middel (f.eks 2 uM thapsigargin; 100 nm endothelin-1) som et redskab til fjernelse af SR Ca2 ^+, ved manuelt at pipettere den forudbestemte dosis direkte i pladen på et sted så nær interesseområdet væsen registreres som muligt. Fortsæt optagelsen for en ønsket tid efterbehandling.
13. Capture ratiometrisk FRET serielle billeder (512 x 512 pixels) med en 63X olieimmersionsobjektiv af konfokal omvendt mikroskop ved anvendelse af FRET SE ansøgning.
14. Indsaml data fra billeddannelse fra en klynge af 5-10 SMC'er i hver region af interesse (ROI) og efterfølgende formatere og analysere ved hjælp af statistik-baserede software.
    1. For at gemme data til senere brug, skal du højreklikke over indspillede spor og vælg "Eksporter" for at save regnearket med indspillede gennemsnitlige signalintensiteter på forskerens valgte drev.
    2. Normalisere data fra hver enkelt eksperiment ved at dividere hvert datapunkt med udgangs intensitetsværdi observeret på tidspunkt 0 sek.
    3. Importer normaliserede data fra regneark i et statistisk program projektfil ved manuelt at kopiere og indsætte relevante datarækker fra deres oprindelige regneark / sek.
    4. Automatisk generere grafer svarende til de datasæt indsættes i programmet.
       BEMÆRK: Programmets standardindstillinger genererer line grafer fra importerede data. Type af grafen vises kan ændres ved at klikke på knappen "Vælg en anden type graf" under "Change" overskrift findes inden hovedværktøjslinjen.
    5. Pool data, som repræsenterer flere uafhængige forsøg inden for en større gruppe af identiske eksperimenter i et enkelt ark data til at producere en gennemsnitlig spor for den specifikke test.
4. Fremstilling af de cytoplasmatiske Ca2 ⁺ Indikator
1. Opløs 0,0125 g Pluronic Acid (PA) i 1 ml dimethylsulfoxid (DMSO) i en sort mikrocentrifugerør (kan der være at opvarme røret i mobile vandbad, for at opløse PA).
2. Hent et rør (50 ug) af den cytoplasmiske Ca2 ⁺ indikatorfarvestof (Fluo-4 AM) fra -20 ° C opbevaring.
3. Wrap røret af farvestof i folie for at beskytte det så meget som muligt fra kontakt med lys.
4. Pipetter 45 pi af DMSO + PA opløsningen i rør indeholdende farvestoffet. Wrap DMSO + PA løsning i folie og opbevares ved stuetemperatur.
5. Bland indholdet af reagensglasset grundigt ved pipettering opløsning op og ned flere gange. Alternativt sonikeres farverøret i 10 min.
   BEMÆRK: Enten fremgangsmåde til grundigt at fordele farvestof i hele DMSO + PA løsning vil være tilstrækkeligt; det er simpelthen et spørgsmål om investigator præference. Hvis investigator vælger at sonikeres løsning, detbør ske i et isoleret område / rum, hvor andre vil blive påvirket af støjen. Investigator skal også bruge tunge lyddæmpere til at beskytte ørerne.
   1. Hvis sonikering løsning, indsætte folie-indpakkede rør indeholdende farvestoffet inde i et skum rør holder og sted inde i 2/3 fuld (med dH ₂ O) sonikator bad.
   2. Placer sonikator bad i isoleret område / rum og magt maskine på (sikre beskyttende hovedbeklædning er på plads, inden der påbegyndes sonikering proces). Give plads og lad maskine, der kører i 10 min, før du lukker det ud og hente røret (holde pakket ind i folie for at beskytte mod lys så længe som muligt).
6. Alikvot den nu grundigt blandede opløsning ind i mørke mikrocentrifugerør (5 pi pr rør, bør være i stand til at gøre 10 rør i alt).
7. Pak hver alikvot rør i folie. Label rør og butik i tørremiddel ved -20 ° C betingelser indtil brug.

5. Måling af cytoplasmatiske Ca2 ⁺

1. Følg trinene i 1,1-1,12 at forberede kultur plader af rotte aorta SMC'er.
2. Fjern kulturmediet fra pladen ved 48 timer efter dyrkning.
3. Fjern den tidligere fremstillede portion af cytoplasmatisk Ca2 ⁺ indikator (5 pi) fra -20 ° C opbevaring og vedligeholde i mobile isbad indtil brug.
4. Vask dyrkningspladen med 1 ml varm fysiologiske HEPES-PSS puffer indeholdende (i mmol·L ^{- 1)} NaCl 140, glucose 10, KCI 5, HEPES 5, _CaCl2 1,5 og _MgCl2 1 (pH 7,4) tre gange.
5. Bland indikatoren med 1 ml varmt HEPES-PSS og indlæse det på kulturen pladen.
6. Inkuber SMC'er med indikatoren i 1 time ved stuetemperatur (24 ° C).
7. Fjern indikator fra kultur plade og vask med 1 ml varm fysiologiske HEPES-PSS buffer tre gange.
8. Tilsæt 1 ml frisk varm HEPES-PSS buffer umiddelbart før initiering af optagelsen.
9. Capture serielle billeder (512 x 512 pixels) med en 63X oil-nedsænkning mål med konfokal omvendt mikroskop.
   1. Skift manuelt indstillingerne, så cellerne er glade ved 488 nm og emission bølgelængder indsamles ved 555 nm med en hastighed på 700 Hz.
   2. Indstille intensiteten af ​​lys ved 15% transmission, med 150 msek excitation eksponeringstid på celler (den tid, at celler udsættes for lys ved udpegede tidsintervaller under optagelse) og 5 sek intervaller mellem engagementer.
10. Stabiliser plade på mikroskopet scenen og begynder at optage.
11. Optag i mindst 3 min for at sikre en stabil basal optagelse af signalet før indføre agent for interesse.
12. Indføre Ca2 ⁺ -I stof (f.eks 2 pM thapsigargin) som et værktøj til fjernelse af SR Ca2 ⁺ (som beskrevet i trin 3.16) og fortsætte optagelsen for ønskede mængde tid efter behandlingen.
13. Optag signalintensitet hjælp mikroskop-specifikke software ved at midle fluorescens signals (F / F ₀₎ fra en klynge af 5-10 SMC'er i hver region af interesse (ROI). Saml, format, og analysere data fra billeddannelse ved hjælp af data analyse software. Se trin 3.18.1-3.18.5 til beskrivelse af dataindsamling og analyse ved hjælp af denne software.

Representative Results

Dette punkt eksempler på de resultater, der kan opnås ved hjælp af den beskrevne fremgangsmåde til at fange SR luminale Ca2 ⁺ -koncentration data, sammenlignet med den almindeligt anvendte måde til indirekte at måle ændringer til organel Ca ²⁺ butik koncentrationer ved at observere udsving i cytoplasmatisk Ca ²⁺ .

Figur 1A viser et øjebliksbillede af et område af interesse (ROI) af SMC kultur transficeret med D1SR adenovirus i YFP kanal (514 nm excitation / 535 nm emission). Som vist, selv om alle SMC'er er positive for D1SR ekspression, er det klart, at ekspressionsniveauerne for D1SR indikator varierer mellem forskellige celler i den samme ROI. Figur 1B viser en 2-D projektion af en fluorescens billede af en SMC transficeret med D1SR adenovirus (YFP kanal), der præsenterer et klart billede af Ca ²⁺ fordelinginden den ekspansive SR luminale netværk. Figur 1C viser D1SR indikator distribution i SMC hjælp CFP (440/488 nm), FRET (440/535 nm), og YFP (514/535 nm) båndpasfiltre.

Vi viser også eksempler på Ca2 ⁺ signal spor opnået fra overvågning af bevægelsen af denne målrettede ion i SR, ved hjælp af den klare test af akut eksponering af celler for en SR tømning middel thapsigargin (2 pM) (figur 2). Som vist i figur 2A og 2B, thapsigargin inducerer et fald i SR Ca2 ⁺ indhold ([Ca2 ^+] _SR).

I figur 3A, har vi vist repræsentative billeder af dyrkede SMC'er lastet med det cytoplasmatiske Ca2 ⁺ indikator behandlet med SR tømning middel thapsigargin (2 uM). Den observerede forbigående top i indspillet Ca2 ⁺ signal ( 2+ frigivelse til cytoplasma SMC, selvom kilden til Ca ^{2 +} transienter ikke udtrykkeligt kan identificeres.

Figur 4A viser repræsentative snapshots af dyrkede SMC'er udtrykker SR calciumindikator D1SR og behandlet med 100 nm af endothelin-1. Som vist i både figur 4A og 4B, endotelin-1 inducerer en langsom, men støt fald i SR calciumindhold som målt ved et fald i D1SR FRET signal. Som det ses, det ratiometrisk FRET protokollen vigtigere tillader undersøgelse af Ca ²⁺ bevægelser direkte relateret til virkningsmekanisme agenten anvendes. Direkte måling af denne ion bevægelse i / fra den største Ca2 ⁺ butik i cellen på denne måde er nyttigt at give resultater er repræsentative for Ca ^{2 +} dynamikker direkte vedrørende den SR handlinger eller på grund af forandringer s i SR lumen miljø.

Figur 1. Fordeling af SR Ca2 ⁺ indikator D1SR i rotte aorta SMC'er. (A) Repræsentant, som viser SMC kultur transficeret med D1SR andenoviral vektor på 48 timer efter infektion. (B) 2-D projektion af en fluorescens billede af D1SR distribution i en dyrket SMC hjælp YFP kanal (514 nm excitation / 535 nm emission). (C) repræsentant øjebliksbillede af en SMC transficeret med D1SR indikator hjælp CFP (440/488 nm), FRET (440/535 nm), og YFP (514/535 nm) båndpasfiltre. Scale barer = 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

/files/ftp_upload/53912/53912fig2.jpg "/>
Figur 2. thapsigargin forårsager et betydeligt fald i [Ca ^2+] _SR. (A) Real-time pseudofarve snapshots (FRET kanal) af dyrkede rotte aorta SMC'er transficeret med D1SR og behandlet med 2 uM thapsigargin viser et fald i signal intensitet angiver et betydeligt fald i SR Ca2 ⁺ indhold på grund af thapsigargin-induceret Ca ²⁺ frigivelse. (B) Repræsentant spor til F / F ₀ værdi i dyrkede SMC'er behandlet med 2 uM thapsigargin bekræfter en betydelig nedgang i [Ca ^2+] _SR. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. thapsigargin forårsager en betydelig stigning i cytoplasmatisk Ca2 ⁺ ([Ca2 ^+] _i). (A) Repræsentative snapshots af dyrkede rotte aorta SMC'er lastet med cytoplasmatisk Ca2 ⁺ indikator, og behandlet med 2 uM thapsigargin. Som vist thapsigargin forårsager en betydelig stigning i signalintensitet i cytoplasmaet på grund af frigivelsen af Ca2 ⁺ fra SR. (B) Repræsentant spor til F / F ₀ værdi i dyrkede SMC'er behandlet med 2 uM thapsigargin. Den afbildede stigning i Ca2 ⁺ signal anses for at være proportional med mængden af Ca ²⁺ frigivet fra SR. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Endothelin-1 forårsager et betydeligt fald i [Ca ^2+] _SR. (A) Real-time pseudofarve snapshots (FRET kanal) af dyrkede rotte aorta SMC'er transficeret med D1SR og behandlet med 100 nm endothelin-1, der viser en langsom, men støt fald i signal intensitet indikerer et betydeligt fald i SR Ca2 ⁺ indhold på grund af endothelin-induceret Ca2 ⁺ overgang til SR. (B) Repræsentant spor til F / F ₀ værdi i dyrkede SMC'er behandlet med 100 nm af endothelin-1. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Denne protokol beskriver transfektionen af VSMC med D1SR adenovirus at studere Ca2 ⁺ koncentrationer inden i hulrummet af SR. Denne fremgangsmåde giver mulighed for direkte måling af Ca2 ⁺ i denne organel samt dets bevægelse ind / ud af SR som følge af anvendelsen af forskellige calcium-bevægelige midler. Denne metode har mange fordele for efterforskere arbejder hen imod en samlet forståelse af, hvordan ændringer i SR og cytoplasmatiske Ca ²⁺ niveauer påvirke den samlede cellulære sundhed og hvordan disse ændringer er indbyrdes forbundne. Traditionel observation af intracellulær Ca2 ⁺ bevægelse involverer sporing af ændringer kun cytoplasmatiske Ca ²⁺ niveauer. En vigtig fordel ved anvendelse af de D1SR eller lignende konstruktioner, derfor er evnen til at overvåge denne ion bevægelse involverer et specifikt organel, såsom SR, snarere end at skulle trække vage konklusioner om virkningerne af agonister på SR vedindirekte observere ændringer i cytoplasmatiske Ca2 ⁺ niveauer induceret ved en sådan manipulation. Langs samme vene, agenter, der tjener til at påvirke SR Ca2 ⁺ specifikt kan anvendes mere effektivt til at vurdere deres virkninger på både organel og celle-dækkende cellulære Ca ^{2 +} koncentrationer og generelle sundhed. Det er på grund af disse fordele, at transfektion af dyrkede celler med D1SR giver en mere direkte, såvel som gratis, fremgangsmåde til måling ændringer intraluminale SR Ca2 ⁺ niveauer. Også af betydning er, at denne model giver et værktøj til at måle ændringer i Ca ^{2 +} koncentration i SR-netværket som reaktion på farmakologiske eller fysiologiske stoffer, der vides at inducere cellulær stress eller specifikke funktionelle reaktioner. Dette vil være muligt ved at generere en kalibreringskurve for D1SR indikator i enhver celle af interesse. Calcium fusion i ER / SR kan derefter beregnes ved at kalibrere normaliseret D1SR ratio (F / F ₀) Mod standard kalibreringskurve som beskrevet tidligere ^{10, 11.}

En begrænsning af protokollen beskrevet her er manglen på tilgængelige oplysninger om brug af D1SR konstruktionen i andre celletyper. Denne metode har hidtil været en succes for rotte SMC'er i vores undersøgelser flere gange ^13-15, selvom dens brug med andre celletyper har hidtil været begrænset. For succes i denne metode, er det afgørende, at der træffes alle forholdsregler for at sikre en sund udvikling af cellekultur trin. Det er derfor vigtigt at bruge en passende materiale, som tillader cellevækst på plader, såsom de mange protein-baserede gelatinøse stoffer kan købes som har vist sig at fremme tilstrækkelig vækst af rotte aorta SMC'er på glas-bund mikroskopi plader. kan observeres Variation i succes transfektion med D1SR og efterfølgende billedbehandling, hvis cellerne ikke er forberedt i løbet af deres optimale passager og ved høj sammenflydning. Ændringer phenotype uløseligt forbundet med langvarig brug af den samme cellelinie kan medføre suboptimal transfektion og svagt signal blive opnået under billeddannelse fase. Begrænsningerne impliceret i anvendelsen af ​​denne fremgangsmåde, er derfor hovedsagelig dem fremstillet uundgåelige af den krævede cellekultur arbejde, som forsøg under anvendelse af D1SR konstruktionen skal være forberedt på mindst 36-48 timer før deres udførelse at sikre konfluens på celler til billeddannelse og tilstrækkelig tid til inkubation af voksende celler med adenovirus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate)	Life technologies	11995-065	Warm in 37 °C water bath before use
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml	Corning	356230	Keep at -20 °C until right before use
Newborn Calf Serum	Sigma-Aldrich		Keep at -20 °C until right before use
35 mm glass-bottomed plates	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 ml 0.2 μM vented blue plug seal cap flask	BD Falcon	353136
Trypsin/EDTA Solution	Life technologies	25200056	Keep at -20 °C until right before use
50 ml Polypropylene Conical Tube	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Gift
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Keep at -20 °C until right before use
1.5 ml Black Microcentrifuge Tubes	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.