Artículo de método
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La calcificación vascular es un importante predictor y contribuyente a la enfermedad cardiovascular humana. Este protocolo describe los métodos para inducir la calcificación de células de músculo liso vascular primario cultivadas y para cuantificar la calcificación y la carga de macrófagos en aortas animales mediante imágenes de fluorescencia en el infrarrojo cercano.
Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de morbilidad y mortalidad en el mundo. Las placas ateroscleróticas, que consisten en macrófagos cargados de lípidos y calcificación, se desarrollan en las arterias coronarias, la válvula aórtica, la aorta y las arterias periféricas de los conductos y son el sello distintivo de la enfermedad cardiovascular. En humanos, las imágenes con tomografía computarizada permiten cuantificar la calcificación vascular; La presencia de calcificación vascular es un fuerte predictor de futuros eventos cardiovasculares. El desarrollo de nuevas terapias para las enfermedades cardiovasculares depende fundamentalmente de la mejora de nuestra comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes de la aterosclerosis. El avance de nuestro conocimiento de los mecanismos ateroscleróticos se basa en modelos murinos y celulares. Aquí, se detalla un método para obtener imágenes de la calcificación aórtica y la infiltración de macrófagos utilizando dos sondas fluorescentes de infrarrojo cercano espectralmente distintas. Las imágenes fluorescentes de infrarrojo cercano permiten la cuantificación ex vivo de la calcificación y la acumulación de macrófagos en toda la aorta y se pueden utilizar para mejorar nuestra comprensión de la relación mecanicista entre la inflamación y la calcificación en la aterosclerosis. Además, se describe un método para aislar y cultivar células de músculo liso vascular aórtico animal y un protocolo para inducir calcificación en células de músculo liso cultivadas de aortas murinas o de arterias coronarias humanas. Este método in vitro de modelado de la calcificación vascular se puede utilizar para identificar y caracterizar las vías de señalización probablemente importantes para el desarrollo de la enfermedad vascular, con la esperanza de descubrir nuevos objetivos para la terapia.
La enfermedad cardiovascular es la principal causa de morbilidad y mortalidad en el mundo, incluyendo los Estados Unidos, donde es responsable de más de 780.000 muertes al año. 1 calcificación de las arterias coronarias y la calcificación aórtica son características de la enfermedad aterosclerótica y sirven como fuertes predictores de eventos cardiovasculares. 2- 4 Dos tipos principales de la calcificación vascular han sido reportados en adultos: la calcificación de la íntima, asociada con la aterosclerosis, y medial (también conocido como Mönckeberg) calcificación, asociada con la enfermedad renal crónica y diabetes 5 calcificación i....
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Se realizaron todos los estudios con ratones en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. Vivienda y todos los procedimientos de los ratones descritos en este estudio fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comités del Hospital General de Massachusetts (Subcomité de Investigación Animal Care). Todos los procedimientos se llevaron a cabo con cuidado para minimizar el sufrimiento.
1. Preparación de los reactivos
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Calcificación aórtica en MGP - / - y de tipo salvaje ratones se midió utilizando imágenes de fluorescencia NIR calcio. No se detectó señal NIR calcio en las aortas de ratones de tipo salvaje, que indica la ausencia de calcificación (Figura 2). Se ha detectado una señal de calcio NIR fuerte en las aortas de los ratones con deficiencia de MGP, lo cual es consistente con la calcificación vascular avanzada. Las secciones de tejido de aortas de tipo salvaje y MGP <.......
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La calcificación arterial es un importante factor de riesgo para la enfermedad cardiovascular en los seres humanos y puede contribuir directamente a la patogénesis de los eventos cardiovasculares. Se ha propuesto 1,5,52 depósito de calcio en la íntima de las delgadas cubierta fibrosa de la enfermedad aterosclerótica para aumentar el estrés biomecánico local y contribuir a ruptura de la placa. 53,54 calcificación medial impactos resultados clínicos mediante el aumento de la rigidez arterial, lo que .......
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El Hospital General de Massachusetts ha solicitado patentes relacionadas con inhibidores de moléculas pequeñas de los receptores BMP tipo I y la aplicación de ALK3-Fc para tratar la aterosclerosis y la calcificación vascular, y MD, PBY, KDB y RM pueden tener derecho a regalías.
Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Investigación Cardiovascular Sarnoff (MFB y TET), el Instituto Médico Howard Hughes (TM), el Premio Ladue Memorial Fellowship de la Escuela de Medicina de Harvard (DKR), el Programa START de la Facultad de Medicina de RWTH Aachen (MD), la Fundación Alemana de Investigación (DE 1685/1-1, MD), el Instituto Nacional del Ojo (R01EY022746, ESB), la Fundación Leducq (Programa Multidisciplinario para Elucidar el Papel de la Señalización de Proteínas Morfogenéticas Óseas en la Patogénesis de las Enfermedades Vasculares Pulmonares y Sistémicas, PBY, KDB y DBB), el Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y d....
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo cónico de 15 ml | Falcon | 352096 | |
| aguja de 30 G | BD | 305106 | |
| Alpha músculo liso anticuerpo de actina | Sigma | SAB2500963 | |
| Portaobjetos | Nunc Lab-Tek | 154461 | |
| Colagenasa, Tipo 2 | Worthington | LS004176 | |
| Dexametasona | Sigma | D4902 | |
| Águila modificada de Dulbecco | Medium Life Technologies | 11965-084 | |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, sin calcio | Gibco | 14190-144 | |
| Elastasa | Sigma | E1250 | |
| Suero fetal bovino | Gibco | 16000-044 | |
| Pinzas de punta fina | Roboz | RS-4972 | |
| Pinzas dentadas de curva completa | Roboz | RS-5138 | |
| Formalina (10%) | Microscopía electrónica Ciencias | 15740 | |
| Solución salina equilibrada de Hank | Gibco | 14025-092 | |
| Células musculares lisas de las arterias coronarias humanas | PromoCell | C-12511 | |
| Jeringa de insulina con aguja | Terumo | SS30M2913 | |
| Ácido L-ascórbico | Sigma | A-7506 | |
| Tijeras de resorte de microdisección (13 mm) | Roboz | RS-5676 | |
| Tijeras de resorte de microdisección (3 mm) | Roboz | RS-5610 | |
| NIR, catepsina (ProSense-750EX) | Perkin Elmer | NEV10001EX | |
| NIR, osteogénico (OsteoSense-680EX) | Perkin Elmer | NEV10020EX | |
| solución salina normal | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Nuclear rojo rápido | Sigma-Aldrich | N3020 | |
| Odyssey Sistema de imagen | Li-Cor | Odyssey 3.0 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Corning | 30-001-CI | |
| Nitrato de plata (5%) | Ricca Empresa química | 6828-16 | |
| Fosfato de sodio dibásico heptahidratado | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| Tiosulfato de sodio | Sigma | S-1648 | |
| ß-glicerofosfato sódico sal hidratado | Sigma | G9422 | |
| Matraz de cultivo de tejidos, 25 cm2 | Falcon | 353108 | |
| Cultivo de tejidos placa (35 mm x 10 mm) | Falcon | 353001 | |
| Placa de cultivo de tejidos, seis pocillos | Falcon | 353046 | |
| Tripsina | Corning | 25-053-CI | |
| Soporte para roedores de tubo | Kent Scientific | ||
| Sistema de filtración al vacío | Millipore | SCGP00525 |
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