Un método estandarizado para medir el área de la superficie pulmonar interna mediante neumonectomía y prótesis de ratón

El objetivo general de este procedimiento es medir con precisión el área de la superficie interna de un pulmón de ratón después de la neumonectomía y la implantación de prótesis. Este método ayuda a analizar las funciones morfológicas y fisiológicas del pulmón en la regeneración pulmonar adulta inducida por fuerza mecánica. La principal ventaja de esta técnica es cuantificar con precisión el área de superficie pulmonar interna, lo que promete aumentar la fiabilidad y la reproducibilidad del estado de la función pulmonar.

Prepare el ratón para la cirugía en una plataforma de intubación con su lado ventral accesible. A continuación, saque la lengua e inspeccione las cuerdas vocales con un laringoscopio para animales pequeños que sea compatible con catéteres guía. Luego, inserte suavemente una cánula de intubación intravenosa de calibre 20 en la tráquea en un ángulo interior.

A continuación, coloque el ratón en posición reclinada lateral derecha y conecte la cánula a un ventilador mecánico. Observar el tórax para juzgar la inserción de la cánula en la tráquea. Ajuste la presión inspiratoria a 12 centímetros de agua y ajuste la frecuencia respiratoria a 120 respiraciones por minuto.

Ahora, limpie la piel expuesta con al menos tres exfoliantes alternos de Betadine y etanol al 70%. Luego comience la cirugía con una incisión de toracotomía posterolateral de dos a tres centímetros en el quinto espacio intercostal. Penetra en la musculatura con las tijeras de muelle Noyes.

A continuación, haga una incisión de 1,5 centímetros para exponer el pulmón izquierdo. Según sea necesario durante la cirugía, use un cauterizador de alta temperatura para detener el sangrado. Luego, levante 1/3 del lóbulo pulmonar izquierdo del tórax con pinzas de punta roma y use un hisopo de algodón para extraer todo el pulmón izquierdo.

Ahora, identifique la arteria pulmonar y los bronquios del lóbulo pulmonar izquierdo, y ate firmemente los bronquios y los vasos en el hilio con una sutura quirúrgica empapada. A continuación, corte el lóbulo pulmonar izquierdo a tres o cuatro milímetros de la ligadura, teniendo cuidado de no cortar la sutura, lo que podría provocar un neumotórax. A continuación, cierre la pared torácica con una sutura.

A continuación, sutura la capa muscular y la capa de piel de forma secuencial, utilizando cinco o seis suturas interrumpidas con espacios de tres a cuatro milímetros. Asegúrese de mantener la aguja de sutura quirúrgica alejada del corazón. La punción cardíaca es letal.

Por último, desinfectar la zona quirúrgica con povidona yodada. Luego, coloque el mouse en una almohadilla térmica de 38 grados centígrados. Siga usando el ventilador hasta que regrese la respiración espontánea.

Realice la operación descrita anteriormente, pero justo después de extraer el pulmón, prepárese para insertar la prótesis. Con pinzas desafiladas, agarre el centro de la prótesis de silicona elipsoidal. A continuación, mientras sujeta la costilla con pinzas para exponer la cavidad torácica, inserte muy suavemente la prótesis.

Ingrese en un ángulo de 45 grados entre el plano frontal de la prótesis y la superficie torácica. Con pinzas romas, asegúrese de que la prótesis esté completamente dentro de la cavidad torácica vacía izquierda. Ahora, cierre el cofre y controle el mouse como se describió anteriormente.

Para este procedimiento, ensamble un tubo de inflado personalizado que consta de un émbolo extraído de una pipeta serológica de 10 mililitros, un tubo flexible de 40 centímetros de largo con un adaptador de aguja, una válvula de control de caudal y una aguja de calibre 18. Una vez montada, fije la pipeta a un aparador con cinta adhesiva. La distancia entre la parte superior de la pipeta y el banco debe ser de al menos 30 centímetros.

Después de sacrificar al ratón mediante una inyección anestésica, asegúrelo a una tabla esterilizada y abra cuidadosamente el tórax para cortar el esternón y exponer los lóbulos pulmonares. Luego, exponga la tráquea. A continuación, llene el tubo de inflado con 4%PFA recién hecho y retire todas las burbujas del tubo.

Luego, inserte la aguja en la tráquea. Para evitar fugas, corte la tráquea con clips para vasos. Ahora, infle el pulmón con fijador a una presión transpulmonar constante de 25 centímetros de agua.

Incubar los pulmones a temperatura ambiente durante dos horas para una expansión completa. Después del inflado, tome nota del desplazamiento de volumen del fijador. Ahora, liga la tráquea y disecciona suavemente los pulmones intactos de los tejidos conectivos circundantes.

Usa unas tijeras y sé muy suave. A continuación, incube los pulmones en un tubo cónico de 50 mililitros lleno de PFA al 4% durante 12 horas a cuatro grados centígrados agitando suavemente en un agitador. A continuación, proceda con el procesamiento y la tinción como se describe en el protocolo de texto.

Para cuantificar el MLI, utilice imágenes del agente utilizado en secciones recopiladas en campo claro con un aumento de 20x. De tres secciones pulmonares diferentes, seleccione al azar un total de 15 vistas que no se superpongan, cada una de aproximadamente un milímetro cuadrado, y luego ventile. Solo use áreas sin arterias y venas, vías respiratorias principales o conductos alveolares.

Para el análisis, dibuje una cuadrícula de 10 por 10 sobre cada área seleccionada con una herramienta de regla. Por lo tanto, las líneas de la cuadrícula están separadas por unas 100 micras. Luego, para encontrar una intersección a lo largo de la línea como la longitud entre dos epitelios alveolares adyacentes.

Por ejemplo, las flechas de dos puntas ilustran las longitudes. Cuente todas estas longitudes a lo largo de cada línea de la cuadrícula, y el MLI es el valor promedio de las longitudes de intersección. Utilizando los protocolos descritos, se compararon ratones tratados con PNX con ratones implantados con prótesis.

Los ratones utilizados fueron machos CD-1 de ocho semanas de edad, y se les resecaron los lóbulos del pulmón izquierdo. La prótesis imita el tamaño y la forma del lóbulo pulmonar izquierdo y se insertó en el tórax después de que se extirpó el lóbulo pulmonar izquierdo. 14 días después de la cirugía, se utilizó un tubo de inflado hecho a medida para determinar el volumen interno del pulmón derecho restante.

El volumen promedio del pulmón derecho en los cinco ratones tratados con PNX fue de aproximadamente 1,4 mililitros, que fue significativamente mayor, 1,05 mililitros para los cinco ratones con prótesis implantadas. Los valores de MLI en el resto de los pulmones derechos también fueron significativamente mayores. Utilizando estos parámetros, se calculó el área de superficie pulmonar interna y se encontró que era significativamente menor en los ratones implantados a la prótesis.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo calcular el área de la superficie pulmonar interna para el modelo de ratón de regeneración alveolar inducida por fuerza mecánica.