Name: Un método estandarizado para medir el área de la superficie pulmonar interna mediante neumonectomía y prótesis de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Aprende a medir el área de superficie pulmonar interna en ratones tras neumonectomía e implante de prótesis. Este método estandarizado mejora la fiabilidad de las evaluaciones morfológicas y fisiológicas en estudios de regeneración pulmonar.

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Los autores desean agradecer el apoyo del Instituto Nacional de Ciencias Biológicas de Beijing. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Municipal de Ciencias Naturales de Beijing (No. Z17110200040000).

Todos los procedimientos utilizados en este protocolo se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones de las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Instituto Nacional de Ciencias Biológicas de Beijing. Se alojaron ratones machos CD-1 de 8 semanas de edad en una instalación libre de patógenos específicos (SPF) hasta que se llevaron a cabo los experimentos. Las cirugías se realizaron utilizando ratones completamente anestesiados ( es decir , sin ninguna respuesta pellizcadora del dedo). Después de la cirugía, los ratones se mantuvieron en una habitación cálida y húmeda con suficiente comida y agua dulce. Los ratones se sacrificaron usando una sobredosis de anestésico administrado por inyección intraperitoneal. 1. Cirugía de ratón PNX <ol><li> Anestesiar completamente a los ratones con fenobarbital sódico (120 mg / kg de peso corporal) y buprenorfina (0,1 mg / kg de peso corporal) mediante inyección intraperitoneal (IP). Realizar la cirugía cuando los ratones ya no reaccionan a pellizcar el dedo. </li><li> Quitar el pelo en el tórax izquierdo de los ratones con dep(3 x 3 cm 2 de área). </li><li> Asegure cada ratón en una plataforma de intubación con su lado ventral hacia el operador ( Figura 1A ). </li><li> Saque la lengua del ratón e ilumine las cuerdas vocales con un pequeño laringoscopio animal que contiene una muesca para guiar los catéteres 18 ( Figura 1A ). </li><li> Distinguir las cuerdas vocales observando los movimientos de las cuerdas vocales durante la respiración. Inserte suavemente una cánula de intubación intravenosa de 20 G en la tráquea con un ángulo anterior 19 . </li><li> Coloque los ratones en una posición recostada lateral derecha y conecte la cánula a un ventilador mecánico ( por ejemplo, controlado por presión, consulte la Tabla de materiales ). Compruebe la inserción de la cánula en la tráquea observando los movimientos respiratorios del tórax del ratón ( Figura 1B ). </li><li> Ajuste la presión inspiratoria of el ventilador a 12 cm H 2 O y establecer la frecuencia respiratoria de 120 respiraciones por minuto (Figura 1B). </li><li> Descontaminar la piel en el área quirúrgica con betadina y etanol al 70%. </li><li> Hacer una incisión posterolateral de 2 - 3 cm en el espacio en el 5 º espacio intercostal, cortado a través de la piel y los músculos con tijeras de primavera Noyes (borde de corte: 14 mm, diámetro de la punta: 0,275 mm) ( Figura 2B , C ). Los instrumentos quirúrgicos utilizados para el procedimiento de toracotomía se esterilizan antes del uso. </li><li> Hacer una incisión de 1,5 cm en el espacio intercostal 5º para exponer el pulmón izquierdo (Figura 2D, E). Durante la operación, use un cauterizador de alta temperatura para detener el sangrado. </li><li> Levante un tercio del lóbulo pulmonar izquierdo del tórax con una pinza de punta roma ( Figura 2F ) y luego use un hisopo de algodón para extraer la totalidad de la izquierdaPulmón ( Figura 2G ). </li><li> Identificar la arteria pulmonar y los bronquios del lóbulo pulmonar izquierdo ( Figura 2G ). </li><li> Se liga ligeramente los bronquios y vasos en el hilio con una sutura quirúrgica de seda y se corta el lóbulo pulmonar izquierdo a 3-4 mm de la ligadura ( Figura 2H , I ). NOTA: Tenga cuidado de no cortar los nudos de sutura en el hilio izquierdo, lo que puede causar neumotórax ( es decir , aire o gas en la cavidad del tórax) . </li><li> Cierre la pared torácica con 1 sutura y luego sutura la capa muscular y la capa de la piel secuencialmente, usando 5 a 6 suturas interrumpidas. Deje una separación de 3 a 4 mm entre cada sutura ( Figura 2M , 2N ). NOTA: Mantenga la aguja de sutura quirúrgica lejos del corazón; La punción cardiaca inadvertida causará la muerte inmediata. </li><li> Desinfectar el área quirúrgica con povidona yodada. </li><li> AfteR la operación quirúrgica, coloque el ratón sobre una almohadilla térmica de 38 ° C y conecte el ratón al ventilador hasta que comiencen los movimientos respiratorios espontáneos ( Figura 2O ). </li></ol> 2. Implantación de prótesis <ol><li> Realice los pasos 1.1 - 1.13 del procedimiento PNX (es decir, hasta el punto en que se elimina el lóbulo pulmonar izquierdo del ratón). </li><li> Abrazadera del centro de la prótesis de silicona (cliente hecho, 12 mm de largo, 3 mm de espesor, 7 mm de ancho, 0,2 g, de forma elipsoide) con fórceps rombo ( Figura 2J ). Esterilizar la prótesis de silicona antes de la inserción. </li><li> Sostenga la costilla con fórceps con una mano para exponer la cavidad torácica, e inserte la prótesis en la cavidad torácica vacía izquierda con otra mano. NOTA: El ángulo de inserción es de aproximadamente 45 grados entre el plano frontal de la prótesis y la superficie torácica ( Figura 2K ,L). Sea muy suave al insertar la prótesis. La fuerza excesiva resultará en rotura pleural. </li><li> Ajuste la orientación de la prótesis con fórceps romos para asegurar que la prótesis ocupe la cavidad torácica vacía izquierda. </li><li> Realice los pasos 1.14 - 1.16 del procedimiento PNX del ratón. </li></ol> 3. Medición de ILV <ol><li> Prepare un dispositivo personalizado (&quot;tubo de inflado&quot;) que consiste en un émbolo extraído de una pipeta serológica desechable (10 ml), un tubo flexible de 40 cm de largo con un adaptador de aguja, una válvula de control de caudal y una aguja de 18 G. Después del montaje, asegure la pipeta en una tabla con cinta adhesiva ( Figura 3A ). La distancia entre la parte superior de la pipeta y el banco experimental debe ser de al menos 30 cm. </li><li> Preparar una solución de fijación de paraformaldehído (PFA) al 4% fresco disolviendo 20 g de PFA en 500 ml de solución salina tamponada con fosfato 1x 1x (PBS) precalentada en un baño de agua a 55ºC, agitando manualmenteCe cada 10 min hasta que la solución sea clara. Después de enfriar a temperatura ambiente, se filtra la solución con un filtro de 0,45 μm. PRECAUCIÓN: Use equipo protector personal (EPP) apropiado cuando maneje PFA. </li><li> Sacrifique a los ratones con una inyección de sobredosis de anestésico (0,8% de fenobarbital sódico, 1.000 U / ml de heparina). </li><li> Asegure cada ratón en una placa de disección de poliestireno y rocíe con alcohol al 70%. </li><li> Cuidadosamente abra el pecho del ratón y corte el esternón con tijeras para exponer a fondo los lóbulos del pulmón. </li><li> Retire el tejido excesivo con una tijera para exponer la tráquea. Asegúrese de separar la tráquea del esófago. </li><li> Corte la aorta abdominal e inserte una aguja de calibre 25 en el ventrículo derecho del corazón; Conecte la aguja a una jeringa de 20 ml antes de esta inserción. Lentamente empuje 1x PBS en el corazón para eliminar las células sanguíneas hasta que los pulmones se vuelvan blancos. Típicamente, se requiere 5 - 10 ml de PBS para limpiar los vasos sanguíneos pulmonares. </li><li> LlenarE tubo de inflado construido a la medida con 4% de PFA fresco y eliminar todas las burbujas del tubo de inflado. </li><li> Inserte la aguja calibre 18 del tubo de inflado en la tráquea y clip de la tráquea con clips de vaso para evitar fugas de líquido. </li><li> Inflar los pulmones con PFA al 4% a una presión transpulmonar constante de 25 cm / H 2 O 2 , 20 . Incubar los pulmones a temperatura ambiente durante 2 h para lograr pulmones completamente expandidos. Este paso de &quot;pre-fijación&quot; es crítico para preservar la morfología pulmonar. <ol><li> Mediante la monitorización del tubo de inflado, registre el valor del volumen inicial de 4% de PFA y registre el volumen final. El volumen pulmonar interno es igual al volumen inicial de 4% de PFA menos el volumen final de 4% de PFA. </li></ol></li><li> Ligate la tráquea y con tijeras, disecar suavemente los pulmones (manteniendo los pulmones intactos) de los tejidos conectivos circundantes. Sea muy suave para evitar dañar los pulmones. </li><li> IncuBate los pulmones en un tubo cónico de 50 ml lleno de PFA al 4% durante 12 h a 4 ° C con agitación suave en un agitador (50 rpm). Proceder al procesamiento y tinción de los tejidos (ver sección 4). </li></ol> 4. Incorporación de tejidos, secciones y tinción con hematoxilina y eosina (H &amp; E) <ol><li> Después de la fijación, utilice las tijeras del resorte de Noyes para recortar el corazón y los tejidos conectivos excesivos de los pulmones. Separar suavemente los lóbulos pulmonares individuales cortando el bronquio que conecta los lóbulos pulmonares con la tráquea. </li><li> Lavar extensamente los lóbulos pulmonares 3 - 4 veces en 50 mL 1x PBS (30 min / lavado) en un agitador orbital (50 rpm). </li><li> Después del lavado final, crioprotect los lóbulos pulmonares sumergiéndolos en una solución de sacarosa al 30% (en 1x PBS) a 4 ° C hasta que el tejido se hunde hasta el fondo de los tubos cónicos de 50 mL (aproximadamente 12 h). </li><li> Antes de incrustar y cryosectioning los tejidos, quitar las muestras de lóbulo pulmonar de los tubos con fórceps, conservar el accesoPara el análisis histológico, se seca la solución de sacarosa restante de la superficie de las muestras de lóbulo accesorio y luego se sumerge bien la muestra en una placa de Petri que contiene el compuesto de temperatura de corte óptimo (OCT) durante aproximadamente 30 min. </li><li> Congelar las muestras de lóbulo accesorio OCT-embedded en nitrógeno líquido usando cryomolds. Coloque la mayor superficie del lóbulo paralela a la parte inferior del molde. </li><li> Prepare un total de tres secciones de 10 μm de espesor para cada muestra durante la criosección para análisis histológico. Deseche los primeros 1 mm de tejido, recoja una sección de 10 μm de espesor, deseche 0,5 mm de tejido, recoja otra sección, deseche 0,5 mm de tejido y recoja la tercera sección (final). </li><li> Secar al aire las secciones durante 1 h antes de realizar la tinción con H &amp; E. </li><li> Realizar la tinción de H &amp; E <ol><li> Lavar las secciones en 3-4 cambios de agua del grifo y luego teñir las secciones en hematoxilina fresca durante 2 min; Enjuague la sección debajo del agua corriente del grifo; Sumerja la sección dos veces en una disolución de etanol al 1% al 70% para eliminar el exceso de hematoxilina. </li><li> Mancha la sección en eosina fresca durante 3 min; Deshidratar las secciones con dos lavados sucesivos de 30 s en etanol al 95% y dos lavados de 30 segundos con etanol al 100%; Limpiar las secciones en xileno durante 30 s, repetir el paso de limpieza una vez en xileno fresco; Monte las diapositivas con el medio de montaje utilizando cubreobjetos de vidrio. </li></ol></li></ol> 5. Cuantificación del MLI <ol><li> Adquirir imágenes digitales de las secciones del lóbulo accesorio manchado de H &amp; E (ampliación 20X) usando un microscopio de campo brillante. </li><li> Para cuantificar el MLI, seleccione un total de 15 vistas no superpuestas (1,000 μm x 1.000 μm) aleatoriamente de las áreas adecuadas (sin arterias y venas, vías aéreas principales y conductos alveolares) de 3 secciones. </li><li> Coloque una cuadrícula con 10 líneas verticales uniformemente distribuidas y 10 líneas horizontales igualmente distribuidas de len definidoGth (1.000 μm) en las áreas de visión elegidas usando una herramienta de regla; Cada línea está así separada 100 μm entre sí ( Figura 4B ). </li><li> Defina el valor de un intercepto como la longitud lineal entre dos epitelios alveolares adyacentes. Mida los valores de todas las interceptaciones a lo largo de cada línea de 1.000 μm de longitud. </li><li> Para cada cuadrícula, cuantifique los valores de todas las interceptaciones entre las 10 líneas horizontales de 1.000 μm de longitud y las 10 líneas verticales de 1.000 μm de longitud. NOTA: MLI es el valor promedio de las longitudes de interceptación de un total de 15 redes analizadas entre las 3 secciones preparadas para cada uno de los lóbulos accesorios. </li></ol> 6. Cálculo de ISA <ol><li> Calcular el ISA utilizando la ecuación 1 (véase la introducción ). Consulte la sección 3 para la medición de ILV y consulte la sección 5 para la cuantificación de MLI. </li></ol>

<ol><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK-Mediated+YAP+Activation+Controls+Mechanical-Tension-Induced+Pulmonary+Alveolar+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">MAPK-Mediated YAP Activation Controls Mechanical-Tension-Induced Pulmonary Alveolar Regeneration.</a> Cell Rep. 16 (7), 1810-1819 (2016).</li>
<li>Thurlbeck, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+surface+area+and+other+measurements+in+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Internal surface area and other measurements in emphysema.</a> Thorax. 22 (6), 483-496 (1967).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este protocolo, proporcionamos descripciones detalladas sobre la medición de los parámetros pulmonares después de la PNX del pulmón izquierdo del ratón y la implantación de la prótesis. La ISA se considera ahora una métrica clave para la evaluación de la función respiratoria en muchas enfermedades pulmonares y en la regeneración alveolar inducida por lesiones. Sin embargo, aunque la comunidad de investigación pulmonar está de acuerdo sobre la utilidad de la ISA como una métrica útil, hasta la fecha, ha habido poca co...

La función fundamental del pulmón es el intercambio de oxígeno y dióxido de carbono entre los vasos sanguíneos y la atmósfera. Las enfermedades pulmonares como la displasia broncopulmonar (BPD), la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y las infecciones respiratorias agudas, resultan en una disminución de la ISA 2 . Los investigadores que estudian la enfermedad pulmonar han desarrollado varios métodos cuantitativos para evaluar los cambios morfológicos en los pulmones, incluyendo MLI, ILV, el número de unidades de intercambio de gases, ISA, y el tejido pulmonar cumplimiento [ 2 , 3] . Los estudios pioneros de Weibel et al. 4 y Duguid et al. 5 juntos establecieron que la ISA puede usarse como una medida directa de la capacidad de intercambio de gas pulmonar en los pulmones humanos y puede usarse como criterio para determinar la gravedad del enfisema. Varios estudios publicados en los últimos cinco años han utilizado parámetros morfológicos pulmonares ( por ejemplo, </eM&gt; ISA y MLI) para evaluar los cambios morfológicos y funcionales en los pulmones de los ratones durante el desarrollo 6 y durante la recuperación de la lesión PNX 1 , 7 . ISA se calcula utilizando la ecuación 1 8 , 9 : <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/56114/56114eq1.jpg" /> , Donde ILV es el volumen pulmonar interno y MLI es un parámetro intermedio que representa el espacio periférico pulmonar tamaño 10 . La PNX, la extirpación quirúrgica de uno o más lóbulos pulmonares, ha sido ampliamente reportada para inducir la regeneración alveolar en muchas especies, incluyendo humanos 11 , ratones 1 , perros 12 , ratas 13 y conejos 14 , 15 . Un sementalY de los pulmones de ratones a los catorce días post-PNX mostró que tanto la expansión de los alvéolos pre-existentes y la formación de novo de los alvéolos contribuir a la restauración de ISA, ILV, y el número de alveolos en los tejidos pulmonares restantes [ 1] . Nosotros y otros hemos demostrado que la inserción de materiales como esponja, cera o una prótesis personalizada en la cavidad torácica vacía después de PNX ( es decir , la implantación de la prótesis) impide la regeneración alveolar. Ahora está firmemente establecido que la fuerza mecánica funciona como uno de los factores más importantes para iniciar la regeneración alveolar 1 , 16 , 17 . Tales estudios han puesto de relieve la eficacia del uso de los valores ISA de los pulmones tratados con PNX y prótesis implantada como criterio para evaluar cuantitativamente la regeneración alveolar. Se sabe que el sesgo del observador influye significativamente en la vaPara los parámetros morfológicos pulmonares ( por ejemplo , MIL e ILV). Se pueden utilizar protocolos estandarizados para obviar este sesgo en la determinación de ILV y MLI, que son los dos parámetros utilizados en el cálculo de ISA. Aquí, proporcionamos protocolos altamente detallados y estandarizados para medir estos parámetros pulmonares. Es importante destacar que la capacidad de cuantificar con precisión ISA promete mejorar la fiabilidad y la reproducibilidad de los estudios de la función pulmonar en modelos de regeneración alveolar inducidos por lesiones y facilitar los descubrimientos mecanísticos en múltiples enfermedades pulmonares.

<table><tbody><tr><td>Kit de cauterización de bajo costo</td><td>Fine Science Tools</td><td>18010-00</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Noyes</td><td>Fine Science Tools</td><td>15012-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de patrón estándar</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Micro Portaagujas</td><td>Fine Science Tools</td><td>12060-01</td><td></td></tr><tr><td>Clips para recipientes</td><td>Fine Science Tools</td><td>18374-44</td><td></td></tr><tr><td>I. V. Cánula-calibre 20</td><td>Jinhuan Medical Product Co., LTD.</td><td>29P0601</td><td></td></tr><tr><td>Sutura quirúrgica</td><td>Jinhuan Medical Product Co., LTD.</td><td>F602</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma de intubación para ratones</td><td>Penn-Century, Inc</td><td>Modelo MIP</td><td></td></tr><tr><td>Laringoscopio para animales pequeños</td><td>Penn-Century, Inc</td><td>Modelo LS-2-M</td><td></td></tr><tr><td>TOPO Ventilador para animales pequeños</td><td>Kent Scientific RSP1006-05L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>Equipo Stuart</td><td>SBH130D</td><td></td></tr><tr><td>Sal sódica de pentobarbital</td><td>Sigma</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>Sal sódica de heparina</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Solución de hematoxilina</td><td>Sigma</td><td>GHS132</td><td></td></tr><tr><td>Solución de eosina Y, alcohólica</td><td>Sigma</td><td>HT110116</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipeta</td><td>Thermo Scientific</td><td>170356</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T</td><td>Compuesto Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>máquina de criosección</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>Moldes de base desechables</td><td>Fisher HealthCare</td><td>22-363-553</td><td></td></tr><tr><td>aguja de calibre 18</td><td>Becton Dickinson</td><td>305199</td><td></td></tr><tr><td>Povidona yodada</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027132</td><td></td></tr><tr><td>etanol al 70%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP82011</td><td></td></tr><tr><td>Equipos de infusión para una sola uso</td><td>Weigao</td><td>SFDA 2012 3661704</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Tapes</td><td>3M Scotch</td><td>8915</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla de algodón</td><td>Vinda</td><td>Dr.P</td><td></td></tr><tr><td>Prótesis de silicona</td><td>Microscopio de</td> campo claro hecho <td></td><td></td>a medida</tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>VS120</td><td></td></tr><tr><td>Herramienta de regla</td><td>Adobe Photoshop (en inglés)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un método estandarizado para medir el área de la superficie pulmonar interna mediante neumonectomía y prótesis de ratón

A Standardized Method for Measuring Internal Lung Surface Area via Mouse Pneumonectomy and Prosthesis Implantation

La morfología pulmonar, la fisiología y las funciones respiratorias cambian tanto en condiciones fisiológicas como patológicas. El área de superficie pulmonar interna (ISA), que representa la capacidad de intercambio gaseoso del pulmón, es un criterio crítico para evaluar la función respiratoria. Sin embargo, el sesgo del observador puede influir significativamente en los valores medidos para los parámetros morfológicos pulmonares. El protocolo que aquí describimos minimiza las variaciones durante las mediciones de dos parámetros morfológicos utilizados para el cálculo del ISA: el volumen pulmonar interno (VIL) y el intercepto lineal medio (MLI). Utilizando ISA como parámetro morfométrico y funcional para determinar el resultado de la regeneración alveolar tanto en modelos de ratón de neumonectomía (PNX) como de implante de prótesis, encontramos que el aumento de ISA después del tratamiento con PNX se bloqueó significativamente mediante la implantación de una prótesis en la cavidad torácica1. No solo se espera que la capacidad de cuantificar con precisión el ISA mejore la fiabilidad y la reproducibilidad de los estudios de función pulmonar en modelos de regeneración alveolar inducida por lesiones, sino que también promueva los descubrimientos mecanicistas de múltiples enfermedades pulmonares.

<html> Realizamos aquí un experimento con un grupo tratado con PNX y un grupo de implantación de prótesis (implante de prótesis). Estas agrupaciones son las mismas que las agrupaciones utilizadas en un estudio previamente publicado por nuestro grupo de investigación 14 . Los procedimientos de implante de PNX de ratón y prótesis se muestran en la Figura 2 . Ratones machos CD-...

El área de superficie pulmonar interna (ISA) es un criterio crítico para evaluar la morfología pulmonar y la fisiología en las enfermedades pulmonares y la regeneración alveolar inducida por lesiones. Describimos aquí un método estandarizado que puede minimizar el sesgo de medición para ISA tanto en neumonectomía pulmonar como en modelos de ratón de implantación de prótesis.

Un método estandarizado para medir el área de la superficie pulmonar interna mediante neumonectomía y prótesis de ratón

Pulmonary morphology, physiology, and respiratory functions change in both physiological and pathological conditions. Internal lung surface area (ISA), ...

El objetivo general de este procedimiento es medir con precisión el área de la superficie interna del pulmón de un ratón tras una neumonectomía y la implantación de una prótesis. Este método ayuda a analizar las funciones morfológicas y fisiológicas del pulmón en la regeneración pulmonar inducida por fuerzas mecánicas en adultos. La principal ventaja de esta técnica es la cuantificación precisa del área de la superficie interna del pulmón, lo que promete aumentar la fiabilidad y la reproducibilidad del estado de la función pulmonar.Prepare el ratón para la cirugía sobre una plataforma de intubación con su lado ventral accesible. A continuación, saque la lengua e inspeccione las cuerdas vocales con un laringoscopio para animales pequeños compatible con guías de catéter. Luego, inserte suavemente una cánula de intubación intravenosa de calibre 20 en la tráquea con un ángulo interno.A continuación, coloque al ratón en posición decúbito lateral derecho y conecte la cánula a un ventilador mecánico. Observe el tórax para evaluar la inserción de la cánula en la tráquea. Ajuste la presión inspiratoria a 12 centímetros de agua y establezca la frecuencia respiratoria en 120 respiraciones por minuto.Ahora, limpie la piel expuesta con al menos tres frotaciones alternadas de Betadine y etanol al 70%. A continuación, comience la cirugía con una incisión toracotómica posterolateral de dos a tres centímetros en el quinto espacio intercostal. Penetre la musculatura utilizando tijeras de resorte Noyes.A continuación, realice una incisión de 1,5 centímetros para exponer el pulmón izquierdo. Según sea necesario durante la cirugía, utilice un electrocauterio de alta temperatura para detener el sangrado. Luego, levante un tercio del lóbulo pulmonar izquierdo del tórax con pinzas de punta roma y use un hisopo de algodón para extraer completamente el pulmón izquierdo.Ahora, identifique la arteria pulmonar y los bronquios del lóbulo pulmonar izquierdo, y ligue firmemente los bronquios y los vasos en el hilio con un hilo quirúrgico empapado. A continuación, extirpe el lóbulo pulmonar izquierdo a tres o cuatro milímetros de la ligadura, teniendo cuidado de no cortar el hilo, lo que podría provocar un neumotórax. Luego, cierre la pared torácica con un punto de sutura.Luego, suturar la capa muscular y la capa de piel secuencialmente, utilizando cinco a seis suturas interrumpidas con intervalos de tres a cuatro milímetros. Asegúrese de mantener la aguja de sutura quirúrgica alejada del corazón. La punción cardíaca es letal.Por último, desinfecte el área quirúrgica con povidona-yodo. Luego, coloque al ratón sobre una almohadilla térmica de 38 grados Celsius. Continúe utilizando el ventilador hasta que regrese la respiración espontánea.Realice la operación descrita previamente, pero justo después de extraer el pulmón, prepárese para insertar la prótesis. Con pinzas romas, sujete el centro de la prótesis de silicona elipsoidal. A continuación, mientras sostiene la costilla con pinzas para exponer la cavidad torácica, inserte muy suavemente la prótesis.Introduzca en un ángulo de 45 grados entre el plano frontal de la prótesis y la superficie torácica. Utilizando fórceps romos, asegúrese de que la prótesis esté completamente dentro de la cavidad torácica izquierda vacía. A continuación, cierre el tórax y supervise al ratón como se describió previamente.Para este procedimiento, ensamble un tubo de inflado personalizado que conste de un émbolo retirado de una pipeta serológica de 10 mililitros, un tubo flexible de 40 centímetros de largo con adaptador para aguja, una válvula de control de caudal y una aguja de calibre 18. Una vez ensamblado, sujete la pipeta a un soporte lateral con cinta adhesiva. La distancia entre la parte superior de la pipeta y la superficie de trabajo debe ser de al menos 30 centímetros.Después de sacrificar al ratón mediante inyección de anestésico, sujételo a una tabla esterilizada y abra cuidadosamente el tórax para extirpar el esternón y exponer los lóbulos pulmonares. A continuación, exponga la tráquea. Luego, llene el tubo de inflado con PFA al 4% recién preparado y elimine todas las burbujas del tubo.A continuación, inserte la aguja en la tráquea. Para evitar fugas, sujete la tráquea con pinzas vasculares. Ahora, infle el pulmón con fijador a una presión transpulmonar constante de 25 centímetros de agua.Incubar los pulmones a temperatura ambiente durante dos horas para lograr su expansión completa. Después de la inflación, anotar el desplazamiento de volumen del fijador. Ahora, ligar la tráquea y diseccionar suavemente los pulmones completos del tejido conectivo circundante.Utilice tijeras y sea muy cuidadoso. A continuación, incube los pulmones en un tubo cónico de 50 mililitros lleno con PFA al 4 % durante 12 horas a cuatro grados Celsius con agitación suave en un agitador. Luego, continúe con el procesamiento y la tinción según se describe en el protocolo del texto.Para cuantificar el ICM, utilice imágenes del agente utilizado en secciones obtenidas en campo claro a 20x de aumento. A partir de tres secciones pulmonares diferentes, seleccione aleatoriamente un total de 15 campos no superpuestos, cada uno de aproximadamente un milímetro cuadrado, y luego ventílelos. Utilice únicamente áreas sin arterias y venas, vías aéreas principales o conductos alveolares.Para el análisis, dibuje una cuadrícula de 10 por 10 sobre cada área seleccionada utilizando una herramienta de regla. Así, las líneas de la cuadrícula estarán separadas aproximadamente 100 micrones. Luego, para hallar una intersección a lo largo de la línea como la longitud entre dos epitelios alveolares adyacentes.Por ejemplo, las flechas de doble cabeza ilustran las longitudes. Cuente todas estas longitudes a lo largo de cada línea de la cuadrícula, y la MLI es el valor promedio de las longitudes de intersección. Utilizando los protocolos descritos, se compararon ratones tratados con PNX con ratones con implante protésico.Los ratones utilizados fueron machos CD-1 de ocho semanas de edad, y sus lóbulos pulmonares izquierdos fueron resecados. La prótesis imita el tamaño y la forma del lóbulo pulmonar izquierdo y se insertó en el tórax tras la extirpación del lóbulo pulmonar izquierdo. Catorce días después de la cirugía, se utilizó un tubo de inflado personalizado para determinar el volumen interno del lóbulo pulmonar derecho remanente.El volumen promedio del pulmón derecho en los cinco ratones tratados con PNX fue aproximadamente de 1,4 mililitros, lo cual fue significativamente mayor que los 1,05 mililitros observados en los cinco ratones con prótesis implantada. Los valores de MLI en los pulmones derechos restantes también fueron significativamente mayores. Utilizando estos parámetros, se calculó el área de superficie interna del pulmón y se encontró que era significativamente menor en los ratones con prótesis implantada.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo calcular el área superficial interna del pulmón para el modelo de ratón de regeneración alveolar inducida por fuerzas mecánicas.

a-standardized-method-for-measuring-internal-lung-surface-area-via

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

El endotelio glicocalix / endotelial capa superficial está muy bien estudiada mediante microscopía intravital. Microscopía intravital es técnicamente difícil en un órgano en movimiento, como el pulmón. Se demuestra cómo simultánea campo claro y microscopía de fluorescencia se puede usar para estimar el espesor de capa de la superficie endotelial en un libremente...

Medición in vivo de la capa de ratón pulmonar superficie endotelial

El objetivo de este protocolo es proporcionar métodos automatizados para cuantificar las patologías pulmonares crónicas en un modelo murino de EPOC. El protocolo incluye la exposición de ratones al humo del cigarrillo (CS), la medición de la función pulmonar, el inflado de los pulmones y el uso de métodos de morfometría para medir el enfisema y la remodelación de las vías respiratorias pequeñas en ratones.

Medición automática de enfisema pulmonar y la pequeña vía aérea Remodelación de cigarrillos sin humo Ratones expuestos

La neumonectomía en ratón es un modelo comúnmente empleado de crecimiento pulmonar compensatorio. Este procedimiento se puede utilizar junto con el rastreo de linaje o modelos de ratones transgénicos para dilucidar los mecanismos subyacentes.

Ratón neumonectomía Modelo de Compensatoria crecimiento pulmonar

Aquí presentamos un protocolo para medir de forma sencilla y fiable la curva presión-volumen pulmonar en ratones, demostrando que es lo suficientemente sensible como para detectar cambios fenotípicos en el parénquima en dos patologías pulmonares comunes, la fibrosis pulmonar y el enfisema. Esta métrica proporciona un medio para cuantificar los cambios estructurales del pulmón con la patología en desarrollo.

Medición de la curva de presión-volumen en mouse Pulmones

El objetivo de este trabajo es describir métodos sencillos que ayudarán en gran medida en la configuración y el análisis de los pulmones de ratones con cáncer de pulmón u otras patologías. Presentamos 3 protocolos para llevar a cabo simple y fiable instilaciones de pulmón, fijación, y mediciones de volumen pulmonar.

Instilación y Fijación Métodos Útiles en pulmón de ratón Cancer Research

Se describe un método para mejorar considerablemente orthotopic engraftment de células de cáncer de pulmón en los pulmones murinos por acondicionamiento previo de las vías respiratorias con lesiones. Este enfoque también puede aplicarse para estudiar las interacciones estromales dentro del microambiente de la pulmonar, diseminación metastásica, comorbilidades de cáncer de pulmón, y generar más eficientemente paciente derivados de xenoinjertos.

Acondicionamiento previo de las vías respiratorias de los ratones con bleomicina aumenta la eficacia del pulmón Orthotopic Engraftment de la célula de cáncer

Aquí, presentamos un protocolo para la implantación quirúrgica de una ventana óptica permanentemente permanente para el tórax murino, que permite obtener imágenes intravitales de alta resolución del pulmón. La permanencia de la ventana la hace muy adecuada para el estudio de los procesos celulares dinámicos en el pulmón, especialmente aquellos que evolucionan lentamente, como la progresión metastásica de las células tumorales diseminadas.

Una ventana permanente para investigar la metástasis del cáncer en el pulmón

El manuscrito describe una metodología para el establecimiento y seguimiento longitudinal del crecimiento de las metástasis pulmonares espontáneas de tumores de mama inyectados ortotópicamente, susceptibles de intervención en todas las etapas de la cascada metastásica.

In vivo Diagnóstico por imágenes para medir la metástasis pulmonar espontánea de células tumorales de mama inyectadas ortotópicamente

Aquí, presentamos un protocolo para utilizar la micro-tomografía computarizada (micro-CT) para cuantificar las regiones ventiladas en un modelo de fibrosis pulmonar inducida por bleomicina unilateral a través de la instilación intratraqueal en el lado lesional.

Análisis unilateral del volumen pulmonar mediante micro-TC para mejorar la evaluación de la fibrosis pulmonar en modelos preclínicos

Un desafío importante del desarrollo de nuevas terapias para el cáncer de pulmón incluye el modelado del microambiente tumoral a medida que la enfermedad regional progresa a la enfermedad metastásica. Aquí, describimos un método simple para establecer un modelo singénico ortotópico de cáncer de pulmón que permite el seguimiento in vivo de la enfermedad a lo largo del tiempo.

Un método mínimamente invasivo para generar un modelo de ratón ortotópico singénico de cáncer de pulmón

Aprende a medir el área de superficie pulmonar interna en ratones tras neumonectomía e implante de prótesis. Este método estandarizado mejora la fiabilidad de las evaluaciones morfológicas y fisiológicas en estudios de regeneración pulmonar.

Un método estandarizado para medir el área de la superficie pulmonar interna mediante neumonectomía y prótesis de ratón

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