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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Genomweiten RNAi-Screening, Host Faktoren zu identifizieren, die onkolytische Viren Therapie zu modulieren

Published: April 3, 2018 doi: 10.3791/56913
Automatic Translation
1,2, 1,4, 1, 1, 1,2,3
1Children's Hospital of Eastern Ontario (CHEO) Research Institute, 2Department of Biology, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 3Department of Pediatrics, University of Ottawa, 4Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary

Summary

Hier beschreiben wir ein Protokoll für den Einsatz von Hochdurchsatz-Screening der RNAi Host Ziele aufzudecken, die manipuliert werden können, um die onkolytische Viren Therapie zu verbessern, speziell Rhabodvirus und Vaccinia-Virus-Therapie, aber es kann leicht an andere onkolytische angepasst werden Virus-Plattformen oder für die Entdeckung von Host-Gene, die Replikation des Virus in der Regel zu modulieren.

Abstract

Hochdurchsatz-Screening-Technologie genomweiten RNAi (RNA-Interferenz) hat am meisten benutzt, für die Entdeckung von Host-Faktoren, die Replikation des Virus auswirken. Hier präsentieren wir die Anwendung dieser Technologie zur Aufdeckung Host-Ziele, die die Vermehrung des Virus Maraba, onkolytische Rhabdovirus und Vaccinia-Virus mit dem Ziel der Verbesserung der Therapie gezielt modulieren. Während das Protokoll für die Verwendung mit onkolytische Maraba und onkolytische Vaccinia-Virus getestet wurde, dieser Ansatz gilt für andere onkolytische Viren und kann auch zur Identifizierung von Host-Ziele, die Virusreplikation in Säugetierzellen in modulieren genutzt werden Allgemeine. Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung und Validierung eines Assays für Hochdurchsatz-Screening der RNAi in Säugerzellen, wichtige Überlegungen und vorbereitende Schritte für die Durchführung von einem primären Hochdurchsatz-RNAi-Bildschirm und eine schrittweise Anleitung für wichtig Durchführung von einem primären Hochdurchsatz-RNAi-Bildschirm; Darüber hinaus beschreibt es im großen und ganzen die Methoden für die Durchführung von Nebenbild Validierung und tertiären Validierungsstudien. Der Vorteil von Hochdurchsatz-RNAi-Screening ist, dass es erlaubt, in einer umfangreichen und unvoreingenommene Weise, Host Faktoren zu katalogisieren, die jeden Aspekt der Virusreplikation zu modulieren, wofür man einen in-vitro- Test wie Infektiosität, entwickeln kann, platzen Größe, und Zytotoxizität. Es hat die macht, unvorhergesehene biotherapeutischen Ziele basierend auf aktuellen Erkenntnissen zu entdecken.

Introduction

Hochdurchsatz-genomweiten RNAi Screening erweist sich als ein wertvolles Instrument zur Aufdeckung biologischer Erkenntnisse in den verschiedensten Bereichen des Studiums einschließlich der Virus Biologie. In den vergangenen zehn Jahren haben sich zahlreiche Gruppen verpflichtet zellbasierte groß angelegte RNAi screening ausführlich Host Gene zu identifizieren, die Virusreplikation (bewertet in1,2,3,4 modulieren , 5 , 6 , 7). Interessanterweise wurden eine große Anzahl dieser Bildschirme in Krebszellen und mehrere mit Viren, die aktuellen onkolytische Viren einschließlich Vaccinia Virus8,9,10 kommen durchgeführt , Myxome Virus11, Herpes-Simplex-Virus12, vesikuläre Stomatitis Virus13,14und Maraba Virus15. Während die meisten dieser Studien auf Host Faktoren, die Einfluss auf einige Aspekte der Virusreplikation, zu bestimmen, und nicht auf die Identifizierung von biotherapeutischen Zielen für die Verbesserung der onkolytische Viren Therapie konzentrierte, konnte wertvolle Daten aus diesen Datensätzen in abgebaut werden diesem Zusammenhang. Es ist klar, dass das mächtige Potential Host Ziele zu identifizieren, die manipuliert werden können, um die onkolytische Viren Therapie zu verbessern nicht voll ausgeschöpft worden.

Eine Fülle von onkolytische Viren Plattformen sind derzeit in präklinischen und klinischen Studien einschließlich Herpes simplex Virus, wirtseigenen und Vaccinia-Virus, die nachweisbaren Erfolge in klinischen Studien hatten getestet. Für die meisten dieser Plattformen haben Anstrengungen gerichtet in Richtung verändern das Virus-Genom, Therapie zu verbessern. Zum Beispiel um Tumor-Spezifität zu erhöhen, wurden bestimmte Viren Gene gelöscht oder mutiert zur Virusreplikation in normalen Zellen, aber nicht in Tumorzellen erheblich einschränken. In einigen Fällen transgene hinzugekommen wie GM-CSF (Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierende Faktor), die Immunantwort zu potenzieren oder NIS (Natrium-Iodid-Symporter) in Vivo Bildgebung und zelluläre Radioiodide Aufnahme aktivieren für therapeutische Zwecke verwendet werden. Allerdings gab es sehr wenig Arbeit konzentrierte sich auf Host/Tumor-Gene zu manipulieren und Untersuchung der Auswirkungen von Host/Tumor-Gene auf die onkolytische Viren Replikation. Mit dem Aufkommen von Hochdurchsatz-Screening-Technologie, es ist nun möglich, Host-Virus Interaktionen im Maßstab des Genoms zu erforschen und zu entschlüsseln, Möglichkeiten zu manipulieren das Wirtsgenom um onkolytische Viren Therapie zu verbessern (überprüft in16, 17,18).

Wir berichteten das erste Studie zeigt Proof-of-Concept für die Verwendung von Hochdurchsatz-genetisches screening um Host Ziele zu identifizieren, die manipuliert werden könnte, um die onkolytische Viren Therapie zu verbessern. Um Host Gene zu entdecken, die modulieren, Maraba Virus Oncolysis, ein onkolytische Rhabdovirus derzeit getestet in Phase I und II-Studien, haben wir durchgeführt genomweiten RNAi-Screens über drei verschiedene Tumorzelllinien in zweifacher Ausfertigung mit einem SiRNA (kurze RNA stören) Bibliothek für 18.120 Gene15. Pathway Analyse der Zugriffe auf den Bildschirmen identifiziert offenbart Bereicherung der Mitglieder des ER (endoplasmatische Retikulum) Stress Reaktion Wege. Wir haben 10 Treffer innerhalb dieser Wege für die sekundäre Validierung mithilfe SiRNA mit verschiedenen targeting Sequenzen von denen auf dem primären Bildschirm. Im Rahmen der tertiären Validierung, führten wir eine Rettungs-Experiment mit IRE1α (Inositol-erfordern Enzym 1 Alpha) zu bestätigen, dass der Hit war. In Vitro und in Vivo Tests mit einem niedermolekularer Inhibitor des IRE1α führte zu dramatisch verbesserte onkolytische Wirksamkeit.

Workenhe Et al. 12 auch durchgeführt einen genomweiten RNAi-Bildschirm mit einer gepoolten Lentivirale ShRNA (kurze Hairpin RNA) Bibliothek targeting 16.056 Gene Ermittlung Host Faktoren beschränken die menschliche Herpes-Simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) mutierte KM100-vermittelten Oncolysis Brust Krebszellen. In den Primärbildschirm identifiziert sie 343 Gene den Zuschlag führen zu verstärkten Zytotoxizität KM100-infizierten Zellen über Mock-infizierten Zellen; 24 dieser Gene für die sekundäre Validierung ausgewählt. Aus den 24 Gene wurden 8 Gene auf dem sekundären Bildschirm mit einem von ihnen bestätigt wird SRSF2 (Serin/Arginin-Rich Spleißen Faktor 2) anschließend mit einer genetischen Rettungs-Experiment während der tertiären Validierung bestätigt wurde. Die Gruppe fuhr fort, um einen DNA-Topoisomerase-Hemmer chemotherapeutischen zu identifizieren, der die Phosphorylierung des SRSF2 reduziert und zeigte, dass die Kombinationsbehandlung von HSV-1 KM100 mit dieser Hemmstoff führen zu längeren Überleben der TUBO Tumor-tragenden Mäusen.

In den genannten Studien folgte ein ähnlicher Workflow. Jeder begann mit einer genomweiten RNAi Primärbildschirm gefolgt von einem sekundären Bildschirm auf eine ausgewählte Anzahl von Treffern in den Primärbildschirm identifiziert. Dies wurde gefolgt von tertiären Validierungsstudien, die bestätigt, dass der Treffer auf Ziel war durch die Durchführung genetischer Experimente in Vitro mit ultimativen Validierung durchgeführt durch die Manipulation der Ziel-gen Produkt in Vivozu retten. In diesem Artikel bieten wir zunächst ein allgemeines Protokoll für die Entwicklung und Validierung eines Hochdurchsatz-SiRNA-Screening-Assays, die umfasst die Bestimmung der optimalen Transfektion Bedingungen, Höhe des Virus und die Länge der Infektion. Wir bieten auch einem detaillierten Protokoll für die Durchführung von einem primären, einem Hochdurchsatz-SiRNA-Bildschirm sowie eine allgemeine Beschreibung des Verfahrens zur Durchführung von Nebenbild Validierung und tertiären Validierung.

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Protocol

(1) Entwicklung und Validierung einer Hochdurchsatz-SiRNA screening assay

Hinweis: Verwenden Sie für alle Experimente Hepes gepufferten Wachstumsmedium für jede Zelllinie geeignet. Siehe Abbildung 1 für einen Überblick über den Workflow von der Assay-Optimierung tertiären Validierung.

  1. Festlegung der optimalen Transfektion Bedingungen
    1. Wählen Sie eine Tumor-Zell-Linie oder im Idealfall mehrere Tumorzellen Linien zur Transfektion Bedingungen (z.B. 786-O, NCI-H226, SF268, U373, OVCAR-8, U20S; siehe Diskussion nähere Informationen über die Auswahl der Zelllinien) zu optimieren.
    2. Wählen Sie eine Transfektion Reagenz oder mehrere zu testen. Es möglicherweise notwendig, mehrere Transfektion Reagenzien zu testen einige giftige oder effizienter als andere in einer bestimmten Zelle Linie möglicherweise. Auch, denken Sie daran, dass einige möglicherweise auf Virenbefall Auswirkungen oder hohe Hintergrundsignal auf Bildgebung generieren kann.
    3. Entscheiden Sie sich für Positive [e. g. SiRNA targeting PLK-1(Polo Like Kinase 1) mRNA, die induziert Zelltod] und negative Transfektion Steuerelemente (z.B. nicht-targeting SiRNA).
    4. Folgen Sie das umgekehrte Transfektion Protokoll für das besondere Transfection Reagens, aber variieren Sie die Menge von Transfection Reagens (z. B. 0,05, 0,1, 0,15 bis 0,2 μl/Well) und Zelle Aussaat dichten (z.B. 625, 1250, 2500 Zellen/gut). Wiederholungen der folgenden Bedingungen sind: unbehandelt Zellen, mock transfizierten Zellen (d. h. Zellen plus Transfection Reagens), und mit positiven und negativen Transfektion Kontrolle SiRNA transfiziert (siehe Abb. 2A für eine Probenteller (Layout).
      1. 80 nM Verdünnungen von jedem SiRNA vorbereiten in der Regel eine Endkonzentration im Brunnen von 10 nM (je nach Bibliothek, kann eine höhere Konzentration von SiRNA erforderlich sein). Sofern nicht anders angegeben, verdünnen Sie die SiRNA mit Transfection Reagens Verdünnungsmittel. Verdünnungen von Transfection Reagens vorzubereiten.
      2. Pipettieren 5 μL von SiRNA pro Bohrloch gefolgt von 5 μL verdünnt Transfection Reagens. Um diesen Schritt zu erleichtern, entlang einer Spalte mit einer U-Boden-96-Well-Platte, die SiRNA-Mixe und die SiRNA Verdünnungsmittel allein (für unbehandelte und mock-transfizierten Zellen) zu verteilen. Verteilen Sie entlang einer zweiten Spalte, die verdünnten Transfection Reagens und Transfection Reagens Verdünnungsmittel allein (für unbehandelten Zellen).
        1. Mit einem elektronischen pipettieren, Pipettieren 5 μl/Well von den Inhalt der ersten Spalte mit SiRNA oder SiRNA Verdünnungsmittel in die entsprechenden Vertiefungen von 384-Well-Platte gefolgt von 5 μl/Well des verdünnten Transfection Reagens oder Transfection Reagens Verdünnungsmittel aus der zweiten Spalte.
      3. Zentrifugieren Sie die Platten bei 1026 X g für 1 min bei Raumtemperatur, und die Zeit für die Transfektion Reagenz vorgeschriebenen inkubieren (z.B. 5-20 min).
      4. Während die Platten Inkubation sind, bereiten Sie Zellsuspensionen unterschiedlicher Dichte. Pipettieren 30 μl Zellsuspension pro Bohrloch. Lassen Sie bevor die Platten im Inkubator platziert die Platten sitzen für 45-60 min bei Raumtemperatur für die einheitliche Abrechnung von Zellen19zu ermöglichen.
        Hinweis: Wenn die Inkubationszeit für die Transfektion Reagenz mit SiRNA vorgeschriebenen kurz ist, bereiten Sie die Zellsuspensionen vor der Inkubation.
      5. Inkubieren Sie für 48 bis 72 h abhängig von der gewünschten Länge der Zuschlag für den Bildschirm gewählt.
    5. Bereiten Sie eine Befestigung und Färbelösung bestehend aus Formaldehyd, Hoechst 33342 und PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) für eine Endkonzentration von 4 % Formaldehyd und 5 Ug/mL Hoechst 33342 in jede Vertiefung. Bei Bedarf versuchen Sie eine höhere (z.B. 7,5 Ug/mL) oder niedriger Konzentration (z.B. 2 Ug/mL) von Hoechst ist das Signal zu schwach oder zu stark, beziehungsweise.
    6. 30 μl der Fixierung und Färbung Lösung direkt in alle Vertiefungen zu verzichten. Inkubieren Sie die Platten für 30 min bei 37 ° c Speichern Sie die Platten bei 4 ° C. Wenn ein nicht-confocal Mikroskop verwenden, waschen Sie die Platten mit PBS mit einer Platte Scheibe; in den meisten Fällen erübrigt sich waschen, wenn ein confocal Mikroskop verwenden.
    7. Entwickeln Sie ein Skript, um die Anzahl der Zellen pro Bohrloch zu quantifizieren.
      Hinweis: Es stehen mehrere Software-Suites für diesen Zweck und während jeder verschiedene Möglichkeiten der Generierung von Skripts haben, sie haben alles im Allgemeinen Mittel zur Identifizierung von Kernen, Zellen und Regionen von Interesse, sowie die Berechnung der Intensitäten und morphologische Eigenschaften. Wenn ein Screening-Skript entwickeln, ist es wichtig zu überlegen, den Zeitaufwand zum Ausführen des Skripts pro Platte und vielleicht einzige wesentliche Messungen um Verarbeitungszeit zu minimieren. Beispielsweise könnte eine Quantifizierung der Zellzahl Bereich Hoechst pro Bohrloch oberhalb einer bestimmten Intensität berechnen; und um die Ausbreitung des Virus zu quantifizieren, könnte man berechnen Sie die GFP (grün fluoreszierendes Protein) Fläche pro Bohrloch oberhalb einer bestimmten Intensität. Die "abgespeckte" Skript müssen verglichen werden, um die aufwändigere Skript um sicherzustellen, dass keine wichtige Information verloren geht.
    8. Analysieren Sie die Ergebnisse, um die optimale Transfektion Bedingungen, das ist Transfection Reagens Betrag und die Zelle Aussaat Dichte, das führt zu erheblichen Zelltod (0-30 % Überleben der Zellen) und minimal toxisch auf die Zellen (z.B. 90-100 % Überleben der Zellen). Hinweis: Es dauert länger, die Zelle Tod Phänotyp in Zelllinien mit lange Verdoppelung Mal zu beobachten. Abbildung 2 b und 2 C für repräsentative Ergebnisse zu sehen. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Zellen mit SiRNA-targeting transfiziert ca. 90-100 % Zusammenfluss zum Zeitpunkt der Fixierung, da später eine Zellen infizieren, die von diesem Konfluenz sind wollen.
  2. Bestimmung der optimalen Menge an Viren und Länge der Infektion
    1. Führen Sie dieselben Schritte rückwärts Transfektion, wie beschrieben (siehe 1.1.4.1, 1.1.4.4); jedoch nur die optimalen Transfektion Bedingungen (siehe 1.1.8) verwenden (z.B. für 786-O Zellen: 1500 Zellen/gut und 0,05 μL/gut von RNAiMAX) und darüber hinaus sind zusätzliche Brunnen mit [z.B. Brunnen mit unbehandelten Zellen, mock-Virus infiziert ist transfizierten Zellen transfected Zellen mit nicht-targeting SiRNA und Zellen mit positiven Virus Steuerelemente transfiziert, wenn diejenigen bekannt sind (d. h. SiRNA Ausrichtung auf Host-Gene, die hemmen oder Replikation verbessern)].
      1. Siehe Abbildung 3A für eine Beispielanlage Platte. 48-72 h inkubieren.
    2. Infizieren Sie weitere Virus-Brunnen mit ein onkolytische Viren mit dem Ausdruck eines fluoreszierenden Reporter-Proteins (z. B. GFP) mit einer Reihe von Mannigfaltigkeiten der Infektion (MOIs) (z.B. 0,001 bis 10; Die Palette gewählt werden hängt das Niveau des Widerstands oder Anfälligkeit der Zelllinie.). Gehören Sie nicht infizierte Brunnen sowie. Pipettieren 40 μL jeder Virus Verdünnungsgrad pro Bohrloch für ein Endvolumen von 80 μl. Zentrifugieren Sie jede Platte 400 X g für 30 min bei Raumtemperatur.
    3. Folgende Infektion, Bild, die Zellen mit einem hohen Gehalt Leben, automatisierte Mikroskop in regelmäßigen Abständen (z.B. alle 4-8 h). Siehe Abb. 3 b und 3 C.
    4. Entwickeln Sie ein Skript zur Quantifizierung der Virus verbreitet (z. B. GFP Bereich pro Well) (s. 1.1.7). Analysieren Sie die Bilder und wählen Sie einen Zeitpunkt und einer MOI, die für den Nachweis von zu- und Abnahmen in Ausbreitung zu ermöglichen. Gewährleisten Sie die Zeit-Punkt und MOI fallen in einem linearen Bereich, Erkennung von kleinen Veränderungen in der Verbreitung zu erleichtern. Schätzen Sie den Z-Faktor (oder Z') für den gegebenen Zeitpunkt und MOI.
      Hinweis: Geschätzte Z-Faktor = 1-3 (σp + σn) / | μp- μn|, wo σp die Standardabweichung der Stichprobe der positiven Virus Steuerelemente ist und σn die Standardabweichung der Stichprobe des negativen Virus ist Kontrollen; und μp wird der Stichprobe-Mittelwert der positiven Virus Steuerelemente und μn der Stichprobe-Mittelwert von den Negativkontrollen. Eine geschätzte Z-Faktor von 0,5 - ist 1.0 als eine ausgezeichnete Assay und geeignet für das screening von20,21.
    5. Bestätigen Sie, dass die negativen Virus Control SiRNA keinen Einfluss auf die Virusreplikation durch den Vergleich mit der mock transfizierten und unbehandelten Brunnen. Es ist oft notwendig, mehrere Negativkontrollen als einige negative SiRNA zu testen, die Kontrollen auf die Virusreplikation auswirken können.
  3. Zur Validierung von Hochdurchsatz-Screening-Test
    1. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.1 und 1.2.2 oben, aber nur diese Zeit infizieren Zellen mit der optimalen MOI. Statt live Imaging, beheben und Flecken auf die Platte (wie unter 1.1.5 und 1.1.6) bei der optimalen Zeitpunkt (siehe 1.2.4).
    2. Bild der Platte. Analysieren Sie die Ergebnisse mit dem gleichen Skript, die für den Bildschirm verwendet werden (siehe 1.1.7 und 1.2.4). Bestätigen Sie die Transfektion Bedingungen (d.h. gute Zuschlag in Brunnen mit positiven Transfektion Kontroll- und minimale Toxizität in Brunnen mit negativen Transfektion Kontrolle transfiziert transfiziert). Schätzen Sie den Z-Faktor um die Robustheit des Assays zu bestimmen (vgl. 1.2.4).
  4. Weitere Tests und Überlegungen für die Durchführung von Hochdurchsatz-screening
    1. Testen Sie die Haltbarkeit der Mikrotiter-Platten, wie einige Platten bei der Zentrifugation, knacken können, vor allem, wenn der Deckel gehalten werden und mehrere Platten auf einmal zentrifugiert werden. Rissbildung reduzieren, ohne den Deckel Zentrifugieren (zur Verfügung gestellt die Platten haben Dichtungen), oder verringern Sie die Anzahl der Platten pro Eimer zentrifugiert.
    2. Testen Sie die Stabilität des Transfection Reagens Mix im Laufe der Zeit. Sobald die Platten die Transfektion Reagenz hinzugefügt wird, möglicherweise eine erhebliche Verzögerung vor der Zugabe von Zellen; Daher ist es wichtig, den Zeitraum für die Transfektion Reagenz Mischung wirksam bleibt. Für den Bildschirm ist die Zellen im Vorfeld die Platten die Transfection Reagens Mischung hinzufügen vorbereiten erforderlich.
    3. Hinweise zur Verwendung des liquiden Dispensers. Bestimmen Sie die Volumes, die erforderlich, um Transfection Reagens, Zellen, Viren zu verzichten, und beheben Sie unter Berücksichtigung der Band, dass hält die Schläuche das Volumen verloren, vor Abgabe (wenn das Gerät diese Funktion hat) und das Restvolumen in den Flaschen für erforderlich der Verzicht auf.
      1. Stellen Sie ein und testen Sie die Programme, die für die Abgabe von Transfection Reagens, Zellen und Viren verwendet werden. Um den Verlust von Transfection Reagens zu minimieren, vorab verzichtet zu begrenzen, wenn möglich, die Anzahl der. Ein Protokoll für die Kalibrierung des liquiden Dispensers und testen die Genauigkeit und Präzision zu etablieren.
    4. Bereiten Sie für die Bulk-Abgabe von Transfection Reagens, Zellen und Viren
      1. Zuerst bestimmen Sie die Anzahl der Platten in einem Batch in Anbetracht der Anzahl der Platten der Zellen, die praktisch auf einmal trypsinized können verarbeitet werden, die Anzahl der Mikrotiter-Platten kann zentrifugiert auf einmal die Länge der Zeit benötigt, um einen Stapel von verarbeiten Platten mit liquid Dispenser und auch der Zeitaufwand für die Bildgebung. Hinweis: In der Regel ca. 30 Platten gleichzeitig die Verarbeitung ist durchaus machbar und Verarbeitung 3 Chargen der Platten ist überschaubar an einem Tag.
      2. Empirisch überprüfen Sie die Lautstärke des Transfection Reagens benötigt, um einen Stapel von Platten zu verarbeiten. Testen Sie die dieses Volumen durch Abgabe 5 μl destilliertes Wasser mehrmals über eine Platte die entsprechende Anzahl von Zeiten, die benötigt werden ausreicht, um einen Stapel zu verarbeiten.
      3. Um die gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten, schätzen Sie die notwendige Zeit, um Zellen in einem Stapel von Platten zu verzichten. Bereiten Sie eine Flasche mit dem Volumen der Zellen erforderlich für eine Charge und die Zellen in mehrere Spalten aus einer Platte zu einem Zeitpunkt zu verzichten, in regelmäßigen Abständen über die gleiche Zeit dauert um über einen Stapel von Platten zu verzichten. Testen Sie, wie oft es notwendig, mischen Sie die Zellen, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen aufrechterhalten werden.
      4. Um die gleichmäßige Verteilung der Virus sicherzustellen, wiederholen Sie das gleiche Verfahren wie oben (siehe 1.4.4.3), aber dieses Mal Verzicht auf Virus auf konfluierende Brunnen. Wenn der Virus nicht gleichmäßig verteilt ist, betrachten Sie bereitet dem Virus in konischen Rohren und vortexen jedes Röhrchen vor der Abgabe.
    5. Verfolgen Sie das Wachstum von Zellen zu bestimmen, die Zeitleiste für den Anbau von genügend Zellen für den Bildschirm. Darüber hinaus bestimmen Sie die durchschnittliche Anzahl von Zellen, die pro Platte von Zellen wachsen in Log-Phase um die Nummer für den Bildschirm abschätzen zu können geerntet werden kann.
  5. Endgültige Vorbereitungsschritte für Hochdurchsatz-screening
    1. Bis zu einem Monat vor Beginn der Vorführung, bestimmen Sie alle notwendigen Materialien für den Bildschirm. Bestellen Sie alle erforderlichen Reagenzien (siehe Material). Sicherzustellen, dass die erforderliche Menge des Virus auf Seite (vorzugsweise verwenden den gleichen bestand, die während der Optimierung verwendet wurde.).
    2. Bis zu zwei Wochen vor Beginn der Vorführung, tauen Sie auf und wachsen Sie die Zellen für den Bildschirm benötigt. Sicherstellung der Verfügbarkeit der Zentrifuge und quadratischen Zentrifuge Eimer.
    3. Während der Woche vor Beginn der Vorführung, bereiten Medien Flaschen auf die umgekehrte Transfektion und Infektion, einen Bestand von 70 % Ethanol, 2 X Transfection Reagens Verdünnungsmittel (z.B. 2 X Opti-MEM), wenn nötig (z. B. wenn die SiRNA-Bibliothek in verdünnt wird RNase-free Wasser, eine 2 X verwenden, um Zellen zu transfizieren wollen), und Aliquote des Virus (einer pro Stapel von Platten). Überprüfen Sie den Zustand der Zellen.
      1. Bereiten Sie eine Stammlösung von Hoechst 33342-Fleck (z.B. 5 mg/mL). Bereiten Sie eine Ausgleichsplatte, wenn man für Zentrifugieren benötigt werden.
      2. Stellen Sie sicher, dass die Platte Scheibe in einwandfreiem Zustand ist, wenn es verwendet wird. Sicherstellen Sie, dass der flüssige Spender richtig kalibriert und Dosierung genau und präzise ist. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Programme auf dem flüssigen Spender korrekt eingestellt sind.

2. Durchführung der primären Hochdurchsatz-Bildschirm

Hinweis: Vor Beginn der RNAi-Bildschirm, Mikrotiter-Platten (z. B. 384-Well-Platten) müssen mit den SiRNA-Bibliothek und Screening Kontrollen angeordnet werden. Die folgenden Schritte werden am besten von zwei Personen mit einer Person (d. h. Person A) wird in erster Linie verantwortlich für die Abgabe der Transfektion Reagenz und Zellen über die Platten und die zweite Person (z. B. Person B) ist verantwortlich für durchgeführt. Zentrifugieren die Platten unmittelbar vor Transfektion und zur Vorbereitung auf der Zellen. In Klammern enthalten sind einige Besonderheiten für die Verarbeitung einer Charge von 33 Platten (d. h. die Hälfte der Bibliothek) mit 786-O-Zelllinie.

  1. Vorbereitung zur umgekehrten Transfektion
    1. Person A: Legen Sie genügend Medien, Trypsin und PBS notwendig, ein Stapel von Platten in einem 37 ° C Wasserbad zu verarbeiten. Optional: Trypsinize eine Platte von Zellen, und die Anzahl der Zellen pro Platte um eine Echtzeit-Schätzung der Anzahl der Platten pro Batch zu bieten.
    2. Erhalten Sie einen Stapel von Platten (z.B. 33 Platten) aus der Tiefkühltruhe und warten Sie 20-30 min um die Platten zum Auftauen lassen. Während die Platten Auftauen sind, mit den folgenden Schritten fortfahren.
      1. Person A: Pipettieren in 50 mL konische Röhrchen die Menge an Transfection Reagens Verdünnungsmittel für die Bearbeitung einer Charge der Platten notwendig (z.B. 2 x 37.125 mL) und legen Sie sie in ein Wasserbad von 37 ° C. Füllen Sie zwei Flaschen mit 70 % igem Ethanol (z.B. 250-500 mL-Flaschen). Füllen Sie zwei 50 mL konische Röhrchen mit PBS und eine mit destilliertem Wasser.
      2. Person A: Tauchen Sie die liquiden Dispenser Schlauch in eine Flasche von 70 % Ethanol. Wenn alle Tipps nicht verwendet werden für die Abgabe der Transfektion Reagenz (z. B. wenn die äußere Vertiefungen der Platte nicht verwendet werden), lösen Sie zuerst die unnötigen Schläuche. Legen Sie ein Stück Klebeband um den Schläuche anlässlich den Punkt, unterhalb, den die Schläuche steril angesehen werden kann. Grundieren Sie mit ca. 25 mL. Gießen Sie zusätzliche Ethanol in der Flasche, die verlorene Volumen zu ersetzen. Lassen Sie den Schlauch in Ethanol für mindestens 5 Minuten sitzen.
      3. Person B: Prepare to Zellen trypsinize. Sprühen Sie die Gewebekultur (TC) Kapuze mit 70 % Ethanol. Sprühen und die notwendigen Mehrkanalpipette, Tipps, Flaschen und Microfuge Rohre für die Zubereitung von Zellen in der Haube (siehe 2.2.1.1 und 2.2.1.2). Zentrifugieren Sie die versiegelten Platten in Sätzen 1026 X g für 2 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Deckel von den Platten in einer TC-Haube, wenn zuvor festgestellt, dass die Platten bei der Zentrifugation knacken können, wenn die Deckel (siehe 1.4.1) gehalten werden.
    3. Person A: Entfernen Sie die Dichtungen von den Platten. Vor, während oder nach der Dichtungen wurden entfernt (abhängig von der Länge der Ausbrütung erforderlich), die erforderliche Menge an Transfection Reagens (z.B. 375 μL/Rohr für eine Endkonzentration von 0,05 μl RNAiMAX/Brunnen) in die konische Röhrchen pipettieren Das vorgewärmte Transfection Reagens Verdünnungsmittel (z.B. 37.125 mL/Tube) enthält.
    4. Mischen Sie, indem Sie nach oben und unten 10 Mal pipettieren. Die Zeit für die Transfektion Reagenz verwendet wird (z.B. 0-10 min.) bei Raumtemperatur inkubieren.
  2. Umgekehrte Transfektion
    1. Haben Sie Person B die folgenden Aufgaben durchgeführt.
      1. Begin trypsinizing Zellen (z. B. 3 Platten von 786-O Zellen). Aspirieren Sie die Medien aus jeder Platte. Spülen mit 9 mL PBS. Pipettieren 3 mL Trypsin pro Platte. Inkubation bei 37 ° C für ca. 5 min. Aufschwemmen der Zellen mit 22 mL Medien. Pipettieren nach oben und unten 10 Mal.
      2. Kombinieren Sie die Zellsuspension aus jeder Gewebekultur-Platte in eine sterile Flasche. Mischen Sie die Zellsuspension durch invertieren. Pipettieren 1 mL Aliquote die Zellsuspension in zwei separaten Microfuge Röhren. Jedes Microfuge Rohr eine Probe entnehmen und die Zellen zu zählen. Berechnen Sie das Volumen der Zellsuspension erforderlich für die Dichte erforderlich (z.B. 1500 Zellen/gut), und bereiten Sie genügend verdünnter Zellsuspension (z.B. 500 mL) in einem Stapel von Platten zu verzichten.
    2. Haben Sie Person eine der folgenden Aufgaben parallel zur Person B.
      1. Leeren Sie den liquiden Dispenser von Ethanol Schläuche. Den Schlauch mit ca. 25 mL PBS Prime, und leeren Sie den Schlauch. Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit des Schlauch um sicherzustellen, dass im Abschnitt der Schlauch unter dem Klebeband, das in Transfection Reagens eingetaucht werden und später in der Zellsuspension steril gehalten. Zeichnen Sie aus Platten, die mit einem konischen Rohr der Transfektion Reagenzlösung sicher durchgeführt werden können.
      2. Pipettieren der Transfektion Reagenzlösungen nach oben und unten 10 Mal. Grundieren Sie den Schlauch mit der Transfektion Reagenzlösung. Um den Verlust von Transfection Reagens zu minimieren, prime mit gerade genug Lösung um die Spitzen kaum zu löschen. Wählen Sie das richtige Programm auf dem flüssigen Spender und verzichten Sie 5 μl Transfection Reagens pro Bohrloch zu.
        Achtung: Verfolgen Sie das Niveau des Transfection Reagens aufmerksam, so dass sie wieder aufgefüllt wird, bevor es abläuft. Die Fertigstellung der Platten, die sind Satz auseinander soll ein Stichwort um mehr Transfection Reagenzlösung hinzuzufügen.
      3. Zentrifugieren Sie die Platten bei 1026 X g für 1 min bei Raumtemperatur. Diesmal werden die Deckel auf, so dass es möglicherweise erforderlich, weniger Platten gleichzeitig, um zu verhindern, dass Risse (z.B. 2 Platten pro Eimer) zentrifugieren. Die vorgeschriebenen für Transfection Reagens verwendet werden die Platten bei Raumtemperatur inkubieren (z.B. 10-20 min).
      4. Während der Inkubation leeren Sie den Schlauch von der Transfektion Reagenzlösung, und legen Sie es in eine volle 50 mL konische Röhrchen mit PBS. Spülen Sie den Schlauch mit ca. 25 mL PBS durch Priming und entleeren.
        1. Wenn mehr Tipps zur Abgabe von Zellen als dienten zur Abgabe Transfection Reagens verwendet werden wollen, befestigen Sie die nicht verwendete Schläuche und resterilisieren alle Schläuche mit 70 % Ethanol vor dem Spülen des Schlauch mit PBS (vgl. 2.1.2.2).
      5. Mischen Sie die Flasche mit der Zellsuspension, sobald es erstellt wurde. Legen Sie den Schlauch in die Zellsuspension und prime genug zu sehen, dass jeder Tipp richtig dosieren ist. 30 μL pro Well die Zellsuspension über alle Platten zu verzichten. Falls erforderlich, mischen Sie die Zellsuspension in regelmäßigen Abständen zur Beilegung zu vermeiden.
        Achtung: Manchmal können Tröpfchen der Suspension mit Medien zu den Seiten der Tipps haften. Wenn dies beachtet wird, so bald wie möglich abzusaugen Sie oder wischen Sie mit einem fusselfreien Tuch in 70 % igem Ethanol übergossen.
      6. Leeren Sie den Schlauch von der Zellsuspension. Spülen Sie den Schlauch mit ca. 25 mL PBS, gefolgt von ca. 50 mL destilliertem Wasser.
    3. Lassen Sie die Platten, für 45-60 Minuten ab dem Zeitpunkt der Zelle Aussaat bei Raumtemperatur vor der Rückkehr der Platten in den Inkubator zu sitzen. Die Platten in einem ungestörten Inkubator für die gewünschte Länge der Gen-Silencing-(z. B. 48 h) inkubieren (siehe 1.1.4.5).
  3. Infektion
    1. Zeitersparnis, am Tag vor der Zellen zu infizieren Pipettieren in sterile Flaschen die genaue Höhe der Medien erforderlich, jede Charge der Platten einschließlich Medien für nicht infizierte Brunnen zu infizieren (z.B. 2 x 350 mL und 2 x 50 mL für 33 Platten). Darüber hinaus liquiden Dispenser für Präzision und Genauigkeit zu testen, und bei Bedarf neu zu kalibrieren.
    2. Die Medien bei 37 ° c warm Füllen Sie zwei Flaschen mit 70 % Ethanol, zwei 50 mL konische Röhrchen mit PBS und eine mit destilliertem Wasser. Überprüfen Sie die Zentrifuge bei Raumtemperatur.
    3. Sterilisieren Sie die Schläuche mit 70 % Ethanol, und Spülen mit PBS wie zuvor beschrieben (siehe 2.1.2.2 und 2.2.2.1). Während das Rohr in das Ethanol sitzt, Pipettieren das genaue Volumen des Virus in die Flasche mit den Medien zuvor erforderlich vorbereitet für Infektion (siehe 2.3.1). Spülen Sie den Schlauch mit PBS durch Grundieren mit 25 mL und dann entleeren.
    4. Entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und legen Sie sie in die TC-Haube. Grundieren Sie die Schläuche mit den Medien. 40 μl der Medien in die nicht infizierten Kontroll-Vertiefungen zu verzichten. Das Rohr der Medien zu entleeren und Spülen mit 25 mL PBS. (siehe 2.2.2.5 Vorsicht)
    5. Nach dem Mischen der Virus, legen Sie den Schlauch in die Flasche mit dem Virus. 40 µl des Virus über die Platten zu verzichten. Zentrifugieren Sie die Platten für 30 min bei 400 X g bei Raumtemperatur. Die Platten in den Inkubator zurück. Die Platten für die vorher festgelegte Zeitspanne (z.B. 24 h) inkubieren (siehe 1.2.4).
  4. Fixierung und Färbung der Zellen
    1. Zeitersparnis, am Tag vor der Befestigung, bereiten Sie eine Flasche von Fixierung und Färbung Lösung mit Formaldehyd und PBS (z. B. 179 mL 37 % Formaldehyd und 270 mL PBS für eine Endkonzentration von 4 % Formaldehyd) für jede Partie der Platten, aber auslassen der Hoechst-Fleck. In der brennbaren Kabinett lichtgeschützt aufbewahren.
    2. Spülen Sie den Schlauch mit 70 % Ethanol und PBS wie zuvor beschrieben (siehe 2.1.2.2 und 2.2.2.1). Fügen Sie die gewünschte Lautstärke von Hoechst (zB. 2,5 mL von 5 mg/mL Hoechst für eine Endkonzentration im Brunnen von 7,5 μg/mL), die Fixierung und Färbung der Lösung und Mix.
    3. 30 μl von Fixierung und Färbung Lösung über die Platten zu verzichten. Legen Sie die Platten in den Inkubator für 30 min. Gelten Sie nach Inkubation die Dichtungen an den Platten und aufbewahren Sie die Platten bei 4° C, vor Licht geschützt. Die Platten zu waschen, wenn nötig (siehe 1.1.6).
  5. Bildverarbeitung und Bildanalyse
    1. Die Platten mit einem automatisierten, hoch-Inhalt Mikroskop Bild. Verwenden Sie die zuvor festgelegten Einstellungen, aber testen Sie zuerst die Einstellungen, um sicherzustellen, dass keine Anpassungen vorgenommen werden müssen.
    2. Quantifizieren der GFP (oder andere fluoreszierende Reporter) und Hoechst Bereich pro auch mit dem bisher entwickelten Skript (siehe 1.3.2). Testen Sie das Skript mit einer Handvoll Platten zuerst zu bestimmen, ob geringfügigen Änderungen vor Batch Analyse aller Platten vorgenommen werden müssen.
    3. Treffer zu identifizieren. Hinweis: Die robuste Z-Score/MAD (mittlere absolute Abweichung) Methode ist eine Methode, die häufig zu diesem Zweck verwendet wird. In der Regel Resultate von > 2 oder <-2 als Trenngrenzen festgelegt werden. Diese Methode ist am besten verwendet, wenn die SiRNA-Proben sind nach dem Zufallsprinzip auf die Platten verteilt und nicht, z. B. nach Funktion gruppiert, da die Proben als de-facto Negativkontrollen eingesetzt werden. Zytotoxischen SiRNAS ausfiltern Sie her, wie diese zu erwarten wäre, unspezifisch Virus verbreitet (siehe Diskussion weitere Einzelheiten zur zytotoxischen Treffer herausfiltern) zu verringern.

(3) Nebenbild Validierung von Treffern mit der TRC (RNAi-Konsortium) ShRNA-Bibliothek

Hinweis: Weitere Informationen zum Auswählen von Treffer zu sekundären Validierung und screening-Technologien möglich Diskussion. Wenn SiRNA-Technologie für sekundäre Validierung ausgewählt wird, kann das gleiche Assay-Entwicklung und Validierung-Protokoll verwendet werden, wie für den Primärbildschirm verwendet wurde (siehe 1).

  1. Erhalten Sie eine benutzerdefinierte TRC ShRNA Bibliothek Ausrichtung der Kandidatengene von Interesse wie Glycerin Aktien.
  2. Bereiten Sie Transfektion Qualität Plasmid-DNA aus den Beständen von Glycerin. Hinweis: Ein detailliertes Protokoll (d. h. "ShRNA/SgRNA/ORF Glycerin und Plasmid DNA-Vorbereitung") finden Sie hier: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
  3. Produzieren Sie mit dem Ausdruck ShRNA gezielt Gene von Interesse mit der DNA Plasmide Lentiviren. Hinweis: Ein detailliertes Protokoll für Lentivirus Produktion in 96-Well Platten [d.h. "ShRNA/SgRNA/ORF Hochdurchsatz virale Produktion (96 gut)"] finden Sie hier: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
  4. Infizieren Sie Zellen mit den Lentiviren. Hinweis: Ein detailliertes Protokoll für Lentivirale Infektion in 96-Well-Platten (d. h. "Lentivirale Infection") ist online verfügbar unter http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/dir/download?dirpath=protocols/production&filename=TRC%20viral % 20infection%20200909.pdf.
  5. Zellen mit onkolytische Viren infizieren entweder folgende Puromycin-Auswahl (siehe 3.4 für das Auswahl-Protokoll) erfolgreich ausgestrahlt Zellen oder unmittelbar folgenden Transduktion (ohne Puromycin Auswahl). Um die optimale Höhe des Virus und die Dauer der Inkubation mit Virus zu bestimmen, verwenden Sie dieselbe Methode für den primären Bildschirm verwendet.

(4) tertiäre Validierung

Hinweis: Die tertiäre Validierung dient in erster Linie bestätigen, dass der Hit am Ziel, spezifische, Tumor ist und verbessert die Wirksamkeit in-vivo. Man kann auch testen, ob es Ausbreitung in einem Spektrum von Tumorzelllinien moduliert

  1. Bestätigung, dass Niederschlag des Gens Kandidat soll
    1. Zuerst bestätigen Sie, dass es eine Korrelation zwischen Phänotyp und Gen-silencing. Verwenden Sie den gleichen Test, der entwickelt wurde für den Bildschirm oder ändern Sie es für ein 6-Well-Format für die Beurteilung der Verbesserung oder Hemmung der Verbreitung in einem größeren Format zu. Führen Sie einen zeitlichen Verlauf mit Zellen mit SiRNA targeting ursächlich an plus und minus Virus transfiziert.
    2. Bild der Brunnen mit Virus-infizierten Zellen, und sammeln die Zelle Lysates aus den nicht infizierten Brunnen in regelmäßigen Zeitabständen. Festzustellen Sie, ob eine Korrelation zwischen Gen-silencing und Förderung oder Hemmung der Verbreitung. Gen-silencing durch Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) und/oder Western blotting zu beurteilen.
    3. Führen Sie eine genetische Rettung Experiment, um zu bestätigen, dass der Hit am Ziel ist. Hinweis: In einem typischen Rettungs-Experiment, das Kandidaten-gen ist geworfen mit RNAi während zur gleichen Zeit Zellen mit resistenten RNAi cDNA (z.B. Ortholog des Gens) vorübergehend transfiziert sind mit dem Ausdruck des Kandidaten-Gens zu bestimmen, ob die Phänotyp des Gens ist wiederhergestellt oder "gerettet". Stabilen Zelllinien überexprimiert RNAi beständig cDNA Kandidaten-gen von Interesse können auch eingesetzt werden.
    4. Alternativ anstelle einer genetischen Rettung Experiment verwenden mehrere orthogonale Assays um zu bestätigen, dass der Treffer auf Ziel ist [z.B. festzustellen, ob die gleiche Phänotyp nach Zuschlag des Zielgens mit mehreren SiRNAs auf Knockdown von gewonnen wird das Zielgen in mehreren stabilen Zelllinien, die mit dem Ausdruck ShRNA gegen das Zielgen und auf Knockout mit CRISPR (Clustered regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholung)-Cas9-Technologie in mehreren Zelllinien.].
  2. Bestätigung, dass der Hit tumorspezifischen und moduliert verteilt eine Reihe von Tumor-Zell-Linien
    1. Führen Sie einen ähnlichen Assay in 4.1.1, aber mit normalen Zellen sowie mit anderen Tumorzelllinien.
  3. Bestätigung, dass die Manipulation des Kandidaten-Gens erhöht die Wirksamkeit in vivo
    Hinweis: Nachfolgend beschriebenen sind drei mögliche Methoden zur Manipulation des Gens in Vivorichten.
    1. Finden Sie eine Medikament, das gen Ziel zu manipulieren. Wenn es ein Medikament wie ein niedermolekularer Inhibitor, der auf das gleichen gen abzielt gibt, verwalten Sie es mit onkolytische Viren in Vivo. Es ist wichtig, den optimalen Zeitpunkt für die Verabreichung des Medikaments zu bestimmen.
    2. Ingenieur, das Virus zu hemmen oder overexpress gen Ziel abhängig, ob man wünscht zu hemmen oder zu verbessern das gen Ziel. Um das Gen zu hemmen, Ingenieur onkolytische Viren eine dominante negative des Gens oder ausdrückliche ShRNA gezielt das Gen zum Ausdruck bringen. Um den Ausdruck des Gens Ziels zu erhöhen, Klonen Sie onkolytische Viren mit einem Transgen das Gen überexprimiert.
    3. Ingenieur-Zell-Linien mit dem Gen geworfen oder herausgetrennten mit ShRNA oder CRISPR-Cas9 Technologie, beziehungsweise. Implantat-veränderter Zell-Linie und die Wildtypzelle Linie in Vivo und anschließend mit dem onkolytische Viren infizieren. Hinweis: Diese Methode dient als ein Proof-of-Principle und kann helfen, festzustellen, ob zusätzliche Zeit und Ressourcen zur Entwicklung eines Medikaments zu manipulieren das Gen in Vivo, z. B. investieren lohnen würde.

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Representative Results

Ein Überblick über den Workflow zur Identifizierung von Host-Ziele zur Verbesserung der onkolytische Viren Therapie ist in Abbildung 1dargestellt.

Wie in Abbildung 1dargestellt, ist der entscheidende erste Schritt die Durchführung eines Hochdurchsatz-RNAi Bildschirms Assay-Entwicklung. Abbildung 2A bietet eine Beispielanlage Platte für die Transfektion Optimierung Assay. Abbildung 2 b besteht aus repräsentativen Bilder der erwarteten Ergebnisse und Abbildung 2 ist eine repräsentative Darstellung der erwarteten Ergebnisse. Nach SiRNA Knockdown von PLK-1, ein Gen, das induziert Zelltod und eignet sich als Positivkontrolle SiRNA Knockdown Effizienz überwachen würde man erwarten, das Überleben der Zellen zwischen 0-30 %, es sei denn, die Zell-Linie eine lange hat Verdopplungszeit in diesem Fall dauert es l Zeile, Zelle Tod Phänotyp zu beobachten. Außerdem sollte die SiRNA-targeting minimal giftig für Zellen mit einer ähnlichen relative Überlebensrate der unbehandelten Zellen.

Ein weiteres wichtiges Element der Assay-Entwicklung soll das Innenministerium an, um die Zellen und die Dauer der Infektion infizieren festgestellt. Abbildung 3A bietet eine Beispielanlage Platte zur Bestimmung der Virusmenge und die Dauer der Inkubation mit Virus. Abbildung 3 b zeigt die Ergebnisse der live-Zeit-Kurs von 786-O Zellen infiziert mit VvDD-eGFP (onkolytische Vaccinia Virus mit dem Ausdruck verbesserte GFP mit dem Thymidin-Kinase und "Vaccinia" Growth Factor gen gelöscht) in verschiedenen MOIs. Repräsentative Bilder von Zellen mit VvDD-eGFP bei einer MOI von 0,05 infiziert sind in Abbildung 3gezeigt. Basierend auf den Ergebnissen, die in Abbildung 3 bgezeichnet, könnte eine einer MOI von 0,05 und einer Länge von Infektion von 21 h auswählen wie dies für den Nachweis von zu- und Abnahmen in Ausbreitung ermöglichen würde, da dieser Zeitpunkt innerhalb einer linearen Bereich und der geschätzte Z-Faktor bei dieser Ti ist mir-Point ist 0,6 für Kohorten, die erhöhen und Kohorten, die Verbreitung zu verringern. Im Rahmen der Validierung dieser Assay wird man die Zellen in diesem MOI und Zeit-Punkt zu beheben, und den Z-Faktor zu berechnen wollen.

Nach dem beschriebenen Protokoll führten wir genomweiten RNAi-Screens über drei verschiedene Tumorzelllinien (z.B. OVCAR-8, U373, NCI-H226) in zweifacher Ausfertigung mit einer Ausrichtung auf 18.120 Gene15SiRNA-Bibliothek. Mit der MAD-Methode, identifizierten wir 1008 Hits üblich, mindestens 2 aus 3 Krebszelllinien (Abb. 4A). Pathway Analyse der Zugriffe auf den Bildschirmen identifiziert offenbart Anreicherung von Mitgliedern des UPR (unfolded Protein Response) und ERAD (endoplasmatische Retikulum assoziierten Proteinabbau) Wege (Abb. 4A). Wir haben 10 Treffer innerhalb dieser Wege für die sekundäre Validierung mithilfe SiRNA mit verschiedenen targeting Sequenzen von denen auf dem primären Bildschirm (Abbildung 4 b). Im Rahmen der tertiären Validierung, führten wir eine genetische Rettungs-Experiment mit IRE1α und ATF6α (aktivierende Transkription Faktor 6 Alpha) zu bestätigen, dass diese Treffer auf Ziel (Abbildung 4 waren).

Figure 1
Abbildung 1: Schematische des Workflows für die Identifizierung von Host Zielen um onkolytische Viren Therapie zu erhöhen. Der erste Schritt ist die Entwicklung und Validierung einen Assay für Hochdurchsatz-RNAi Screening, inklusive Optimierung Transfektion Bedingungen für die Einführung von SiRNA in Zellen, Bestimmung der optimalen Höhe der Virus (d. h. MOI) die Zellen infizieren mit und die Dauer der Inkubation mit Virus. Der zweite Schritt ist eine Hochdurchsatz-Genom-Breitbild durchzuführen. Eine gezielt Gene über das gesamte Genom SiRNA-Bibliothek ist auf Mikrotiterplatten angeordnet. Zellen sind dann umgekehrt mit der SiRNA-Bibliothek transfiziert. Im Anschluss an eine 48-72 h Inkubationszeit, um Gen-silencing zu ermöglichen sind Zellen mit der optimalen Menge an Virus infiziert. Zellen sind nach die optimale Länge der Inkubation mit Virus fixiert und gefärbt und anschließend mit einem High-Content-Mikroskop abgebildet. Bild und Daten Analyse wird dazu beitragen, die um Gene, die deutlich die Virusreplikation, modulieren zu identifizieren, die als "Treffer." bezeichnet werden Ein sekundäre Validierung-Bildschirm wird auf ausgewählte Hits aus den primären Bildschirm in der Regel mit SiRNA oder ShRNA mit verschiedenen Samen Regionen durchgeführt. Tertiäre Validierung Experimente werden durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Hits auf Ziel, Tumor-spezifische sind und Wirksamkeit in Vivoverbessern. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Optimierung der Transfektion Bedingungen für Hochdurchsatz-RNAi-Screening-Test. (A) eine Beispielanlage Platte zur Optimierung der Transfektion Bedingungen mit zwei verschiedenen Zelllinien. (B) repräsentative Bilder von 786-O Zellen (1500 Zellen/Na) gebeizt mit Hoechst 33342 nach 72 h Inkubation mit Transfection Reagens Verdünnungsmittel alleine (d.h. unbehandelt), Transfection Reagens und Verdünnungsmittel (d. h. mock transfiziert), mit SiRNA-targeting und SiRNA targeting PLK-1. (C) Vertreter ergibt sich aus Transfektion Optimierung Experiment zeigt 22 % Überleben von Zellen mit SiRNA PLK-1 transfiziert (n = 24) und 94 % Überleben von Zellen mit SiRNA-targeting transfiziert (n = 8). Fehlerbalken = ± SD, Standardabweichung; Skalieren von Balken = 200 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Bestimmung der Virusmenge und Dauer der Inkubation mit Virus für Hochdurchsatz-RNAi Screening Assay. (A) eine Platte Beispielanlage zur Optimierung der Virusmenge und Dauer der Inkubation mit Virus. Spalten 1 und 24 Transfektion enthalten Steuerelemente und Links sind nicht infiziert. Spalten 2 bis 23 enthalten unbehandelten Zellen, mock-transfizierten Zellen und Zellen mit positiven und negativen Virus steuert alle infiziert mit einer Palette MOIs, beginnend mit kein Virus in den Spalten 2 und 3 transfiziert. (B) 786-O Zellen waren rückwärts mit SiRNA-targeting transfiziert und für 48 h inkubiert. Sie wurden anschließend mit VvDD-GFP bei MOIs angegeben und abgebildet in 8 h Abständen ab 5 Stunden nach der Infektion (Hpi) infiziert. Bereich mittlere GLP pro Bohrloch (± SD) für jeden Zeitpunkt berechnet wurde (n = 12) und auf dem Diagramm geplottet. Der Z-Faktor berechnet zwischen den Punkten A und B ist 0,6 und der Z-Faktor berechnet zwischen den Punkten B und C ist 0,6. (C) Vertreter live-Bilder eines Brunnens mit einer MOI von 0,05 zu den Zeitpunkten infiziert angegeben. Vergrößerung, 10 X; 9 Felder/gut; Skalieren von Balken = 200 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Genome-Wide Screen identifiziert ER Stress-Reaktion-Blockade als eine potente sensibilisierend Rhabdovirus-vermittelten Oncolysis. (A) Venn-Diagramm skizziert die Anzahl der überlappenden Treffer von Hochdurchsatz-RNAi-Bildschirme in 3 Tumorzelllinien und einen Tisch (+ synthetische tödlich;-, keine Interaktion) und schematische Darstellung (trifft skizziert in rot) illustrieren wichtige Treffer innerhalb der UPR und ERAD Wege. (B) EG50 Schichten (schwarze Balken, y-Achse links) wurden für U373 Zellen behandelt mit Maraba Virus (48 h) nach der Behandlung mit SiRNA (72 h) für eine Reihe von UPR/ERAD Hits aus dem Bildschirm bestimmt. Relative mRNA Ausdruck für jedes gen nach SiRNA Zuschlag (72 h) ist in weiß (Rechte y-Achse) dargestellt. (C) Zelle Lebensfähigkeit Assays wurden 48 h nach Maraba-Virus-Infektion durchgeführt, in U373 Zellen, die mit dem Ausdruck ectopically Maus ATF6α (oder Steuerelement GFP) ± SiRNA Ausrichtung menschlichen ATF6α (oder targeting [NT] Kontrolle; links) oder menschliche XBP1(s) (oder Kontrolle ) ± SiRNA Ausrichtung menschlichen IRE1α (oder Steuern; rechts Panel). Westliche Flecken zeigen Gen-silencing und ektopische Genexpression werden angezeigt. EG50 verschiebt = die Verschiebung in der Dosis von Virus erforderlich, um das Töten von 50 % der Zellen; Fehlerbalken = ±SD; XBP1(s) = X-Box-bindendes Protein 1 (gespleißt); (B), One-Way-ANOVAs wurden durchgeführt, gefolgt von einer Bonferroni mehrere Vergleich post-hoc-Test um abzuleiten p Werte; (C) wurden Schülers t-Tests durchgeführt, um die p-Werte ableiten; * p < 0,05; #p < 0,05. (Diese Zahl verändert wurde, von Mahoney Et al.., 201115). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Hier präsentieren wir ein Protokoll für den Einsatz von Hochdurchsatz-Screening der RNAi Host Ziele zu identifizieren, die manipuliert werden können, um die onkolytische Viren Therapie zu verbessern. Dies wurde erfolgreich getestet mit onkolytische Maraba und onkolytische Vaccinia Virus, aber wie bereits erwähnt, es angepasst werden kann für die Verwendung mit anderen onkolytische Viren oder andere Viren in der Regel um Host Gene zu identifizieren, die Replikation des Virus zu modulieren. Das Screening Protokoll soll auch Gene zu identifizieren, die erhöhen oder verringern der Ausbreitung, aber es kann ohne weiteres für andere anzeigen geändert werden. Unsere Bildschirme mit Maraba-Virus beispielsweise wurden entwickelt, um Gene modulieren Oncolysis nutzt einen einfachen Resazurin-basierte vital Farbstoff-Assay Zellviabilität zu erzielen (siehe Abbildung 4)15. In diesen Bildern nach Inkubation mit Virus, statt Zellen mit Formaldehyd und Färbung mit Hoechst, wir verzichtet Resazurin Farbstoff in jede Vertiefung (Endkonzentration von 20 μg/mL) und nach einer 6 h Inkubation gemessen wir Extinktion (573 nm) mit einer Platte-Leser. Wir hätten auch Handynummer basierend auf Hoechst Färbung als einer Anzeige einsetzen können. Während Virusreplikation Überwachung mit einem Surrogat-Reporter in diesem Bildschirm nicht notwendig war, ein Virus mit einem Reporter-Protein, insbesondere ein fluoreszierendes Protein Bildschirm Optimierung erleichtert wie man z. B. Virusreplikation überwachen kann, Leben; Darüber hinaus ein Virus mit einem Reporter-Protein ist weniger umständlich und teuer als die Verwendung von Antikörper, um virale Antigene zu beflecken, aber es ist möglich, ohne einen Bildschirm. Darüber hinaus könnte man noch weitere Änderungen an der Assay, Host Faktoren zu untersuchen, die Auswirkungen auf die Infektiosität, Burst Größe und noch detailliertere Sub Phänotypen wie immunologische Zelltod machen. In jedem Fall würde man ein ähnliches Assay-Entwicklung-Protokoll, screening-Strategie und sekundäre und tertiäre Validierungsmethoden folgen.

Im Protokoll empfiehlt es sich, Optimierung der Transfektion Bedingungen am besten mit mehreren Tumorzelllinien. Es gibt mindestens zwei Gründe für die Optimierung mit mehreren Zelllinien. Ein Grund dafür ist, dass nicht jede Zelllinie offen für Hochdurchsatz-Screening, ist wie einige möglicherweise schwierig zu transfizieren oder kann nicht gut halten, aber ein wesentlicher Grund ist Screening mit mehreren Zelllinien zu aktivieren, um die Zelle intrinsische Verzerrungen zu vermeiden. Die Wahl von Zelllinien ist weitgehend abhängig von den Zielen. Man kann wählen, um konzentrieren sich auf eine bestimmte Krebsart oder wählen unterschiedlichen Krebsarten ein breiteres Spektrum abdecken. Alternativ kann eine auf Tumorzelllinien konzentrieren, sind resistent gegen Gastgeber Faktoren zu identifizieren, die manipuliert werden können, um die Tumor-Zell-Linien weniger resistent gegen onkolytische Viren machen, möchte.

Neben der Auswahl der Zelllinien ist die Auswahl der positiven und negativen Virus Kontrollen eine wichtige Überlegung für jeden Bildschirm. In einigen Fällen Viren-Gene, die für erforderlich sind oder Replikation zu beschränken nicht bekannt sein, oder wenn sie bekannt sind, möglicherweise sie zellspezifische. Infolgedessen kann man noch die ungefähre Robustheit und Dynamik des Assays bestimmen, Surrogat-Steuerelemente verwenden. Man könnte z. B. nicht infizierten Zellen oder Zellen infiziert mit einer niedrigen MOI als Positivkontrolle Surrogat für die Identifizierung von Genen, die die Ausbreitung nach Zuschlag zu verringern. Für die Identifizierung von Genen, die Ausbreitung nach Zuschlag zu verbessern, könnte eine Zellen mit einer Verdünnungsreihe von Virus infizieren und Brunnen mit dem maximalen Signal als Positivkontrolle Surrogat verwenden.

Auswahl der Treffer für Nebenbild Validierung und die Art der Technologie zu beschäftigen ist eine andere Sache, das erfordert sorgfältige Überlegung. Die Kandidaten werden im Allgemeinen für Nebenbild Validierung anhand des Ausmaßes der Hit, auf ob sie deutlich Ausbreitung in mehreren Krebszelllinien modulieren (wenn primäre anzeigen in mehreren Zelllinien durchgeführt wurden) ausgewählt und auf biologischen Interesse. Bioinformatik-Werkzeuge wie DAVID22,23, PANTHER24, STRING25 und PINdb26 können helfen, um Wege und Hits der biologischen Interesse zu isolieren. Mercer Et al. 8 beschreiben die Verwendung von OpenSource-Bildanalyse-Software und auch zur Verfügung gestellt haben einen Algorithmus, den sie zur Visualisierung und Analyse von Treffern entwickelt. Ein Faktor zu berücksichtigen, bei der Interpretation der Ergebnisse ist, dass Gen-silencing haben unterschiedliche Auswirkungen je nach Stadium des Lebenszyklus des Virus, die untersucht wird. Zum Beispiel ist es möglich, dass Zuschlag eines Gens früh im Lebenszyklus kann Virusreplikation, hemmen, während Zuschlag zu einem späteren Zeitpunkt Replikation erhöhen kann. Oft werden die sekundären Bildschirmen mit SiRNA eines anderen Herstellers mit verschiedenen Samen Regionen mit mehreren SiRNAs pro gen durchgeführt. Jedoch können ergänzende Technologien gezielt Kandidatengene wie CRISPR-Cas9 oder Lentivirus Vektoren ausdrücken ShRNA eingesetzt werden.

Die Methode der Analyse ist auch eine entscheidende Rolle. Wir empfehlen hier die robuste Z-Score oder MAD20,27 mit vorgeschlagen Trenngrenzen für den erfolgreichen Aufruf von > 2 oder <-2. Die Cut-Offs können erhöht oder verringert je nachdem, ob der Fokus auf Beseitigung mehr Fehlalarme oder mehr falsche negative erfassen. Beispielsweise wurde in einem jüngsten Hochdurchsatz-Bildschirm mit Vaccinia Virus9, die untere Abschaltung auf-1.5 festgelegt (keine oberen Trenngrenzen wurden beschrieben, wie die konzentrierte sich auf die Identifizierung von Genen, die Ausbreitung nach Zuschlag verringert). Es gibt auch andere Methoden, die eingesetzt werden können, einschließlich der Z-Score, SSMD (streng standardisierten mittlere Differenz) und die B Gäste20,28,29,30. Barrows Et Al.31 Hitlisten erzeugte Summe Rang, MAD, Z-Score und SSMD verglichen und festgestellt, dass jede Methode der Analyse verschiedener Hitlisten geführt. In toto, gibt es keine perfekte Methode oder Cut-off. Letztlich bestätigt Nebenbild Validierung und Tertiär Validierungsstudien wahre Hits.

Die Methode der cytotoxische Treffer herausfiltern muss berücksichtigt werden. Eine Möglichkeit besteht darin die primäre anzeigen in parallele Plus oder minus Virus führen. Dies ermöglicht die Erkennung von SiRNAs, die zytotoxischen auf eigene Faust. Das war unser Ansatz in unserer Maraba Virus Bildschirme15; Dies ist jedoch nicht oft praktisch. Vielleicht ist eine praktischere Methode, abgesehen davon, dass robust, um Treffer zu ermitteln, die zytotoxischen sind als Teil des sekundären Bildschirm Validierung, vor allem, wenn der Fokus Treffer zu identifizieren, dass Abnahme die Replikation auf Zuschlag. Zum Beispiel in ein ganzes Genom primären Bildschirm mit Myxome Virus Teferi Et Al. 11 identifiziert 1.588 SiRNAs, die Replikation des Virus nach Zuschlag verringert. Um zytotoxische SiRNAs auszufiltern, führte sie einen sekundären Zytotoxizität Bildschirm mit diese SiRNAs; Sie Maßen Zelle Lebensfähigkeit 72 h nach Transfektion mit einem Resazurin-basierte Zelle Lebensfähigkeit Assay. Zytotoxischen SiRNAs wurden basierend auf einen Z-Score von ≤-1.96 identifiziert. Ein weiterer Ansatz besteht darin, einfach herausfiltern zytotoxischen SiRNAs aus den Vorabsiebung Daten basierend auf eine Reduktion der Zellzahl um einen bestimmten Prozentsatz, z. B. durch eine Reduzierung der > 50 % wie in Sivan Et al. 9, oder anhand einer bestimmten Punktzahl wie Lee Et Al. 14; in ihrer Studie von Host Faktoren für vesikuläre Stomatitis Virus-Replikation erforderlich ausgenommen sie SiRNA-Hits, die Zellviabilität > 3.0 Standardabweichungen vom Mittelwert gesenkt. Die mittlere Anzahl an Zellen wurde anhand der Hoechst-Färbung von Zellkernen und obwohl nicht explizit angegeben ist, das Mittel war scheinbar berechnet auf einer Basis pro Platte da klar ist, dass der Mittelwert GFP Signal auf einer Basis pro Platte berechnet wurde.

Eine Einschränkung von jedem Hochdurchsatz-RNAi-Bildschirm ist die häufige hohe Zahl von false Positives und Negatives, die als Folge der Assay-Design, die verwendete Technologie oder durch systematische Fehler kommen kann. Z. B. ein Protein kann die Replikation des Virus erheblich beeinträchtigen, aber die Zeit für Gen-silencing gewählt möglicherweise zu kurz Halbwertszeit des Proteins, seine Wirkung führt zu einer falschen negativen aufgrund der Assay-Konstruktion zu erkennen gegeben. Es ist allgemein bekannt, dass unvollständige Zuschlag und die Ziel-Auswirkungen der SiRNA-Technologie auch false Positives und Negatives einführen können. Systematische Fehler, wie z. B. den Randeffekt32, können auch irreführende Ergebnisse generieren. Hier kann das Signal in den äußeren Vertiefungen der Platte systematisch höher oder niedriger als der Rest der Platte durch Verdunstung sein. Gibt es Strategien gegen einige dieser Fragen, z.B.: verringert die Konzentration von SiRNA, Ziel-Effekte33zu reduzieren, Neukonfiguration Platte Layouts, um die äußeren Brunnen mit Medien zur Milderung der Auswirkungen der Rand zu füllen oder mit Computergestützte Methoden, die entwickelt wurden, um zu erkennen und entgegenzuwirken systematische Fehler wie den Randeffekt32,34,35. Eine allgemeine Methode, mit Fehlalarmen ist auf einen sekundären Bildschirm nach dem primären Bildschirm durchführen. Als eine Art des Umgangs mit falsche negative kann man entspannen der Cut-off für den erfolgreichen Aufruf und beinhalten mögliche falsche negative für sekundäre Screening. Hierzu wird natürlich nicht falsche negative erfassen, die weit unter dem Cut-off sind. Primäre anzeigen sollte auch in doppelt oder dreifach, falsche Ergebnisse begrenzen durchgeführt werden. Letztlich egal, welche Strategien zum Einsatz kommen, keine Hochdurchsatz-Screen wird erschöpfend alle wahre Hits identifizieren, aber es bieten eine wahre Fundgrube an Daten aus denen dürfte man mir einige wertvolle Hits, die auf aktiviert werden kann.

In diesem Protokoll beschrieben wir die Verwendung von angeordneten SiRNA und ShRNA-Technologie, obwohl eine weitere Alternative die Verwendung von gepoolten ShRNA und CRISPR-Cas9 Bibliotheken ist. Eine gepoolte ShRNA Bibliothek arbeiteten in Workenhe Et al. 12 -Studie in der Einleitung beschrieben. Gepoolte CRISPR-Cas9-Technik wurde verwendet, um Bildschirme, Genom-Skala um Host Faktoren erforderlich für die Replikation von Viren wie dem Zika-Virus36, West-Nil-Virus37,38, Dengue-Virus39 und Hepatitis führen C Virus39. Der Vorteil der Verwendung von gepoolter Bibliotheken ist, dass sie weniger teuer um zu kaufen, benötigen Sie keine spezielle Infrastruktur (z. B. Flüssigkeit Umgang mit Geräten, High-Content Mikroskope und Roboter-Geräte), noch haben sie die hohen Kosten für den Betrieb und Wartung dieser Infrastruktur und sie benötigen weniger Verbrauchsmaterial. Der Nachteil ist, dass die Arten von Anzeigen mehr begrenzt sind. In die meisten wenn nicht alle zusammengefassten Bibliothek Host-Virus Interaktion Bildschirme bis heute ist das Auslesen Zellviabilität oder fehlen; man kann nicht ohne weiteres für komplexere Phänotypen Sonde. Die Wahl des Formats hängt davon ab, auf die biologische Frage.

Die Fortschritte in der genetischen Screening-Technologie in den letzten Jahrzehnten, dass erste aktivierte Bildschirme in Bakterien und Hefen auf jetzt heutigen Genom-Skala-Bildschirme in den menschlichen Zellen Tür und Tor für Entdeckung in den verschiedensten Bereichen der Studie geöffnet haben. Diese genetische Bildschirme konnten nicht nur wir grundlegende Biologie Fragen beantworten, aber uns Schlüssel zur Entriegelung Einblicke in die Entwicklung und Verbesserung von Biotherapeutika gegeben haben. Zwar nach wie vor gibt es Lektionen und Herausforderungen mit dieser Technologie überwunden werden, wurden die bisherigen Ergebnisse spannend. Die Entdeckungen werden wahrscheinlich noch mehr als neuartige Siebtechnik einschließlich CRISPR-Cas9-Bibliotheken, Mikrofluidik und in Vivo screening-Technologien weiter zu Reifen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Ontario Institut für Krebsforschung, der Kanada-Stiftung für Innovation, die Ottawa Regional Cancer Foundation und der Terry Fox Research Institute unterstützt. K.J.A. wurde durch ein Vanier Canada Graduate Stipendium, ein Canadian Institute for Health Research-Master Award unterstützt und ein Ontario-Graduate-Stipendium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumables
siRNA library GE Dharmacon G-005005-02
Corning 384-well plate Corning 3985
Falcon 384-well plate Becton Dickinson 353962
Water Sigma W4502
siGenome SMARTpool PLK1 GE Dharmacon M-003290-01
AllStars Negative Control siRNA Qiagen SI03650318
siGenome Non-targeting siRNA Pool #2 GE Dharmacon D-001206-14-20
DMEM/HIGH Glucose GE Healthcare Life Sciences SH30022.01
Fetal Bovine Serum Sigma F15051-500ML
HEPES solution (1M) Sigma H3535-100ML
Penicillin-Streptomycin 100X solution GE Healthcare Life Sciences SV30010
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific 2500056
DPBS/Modified GE Healthcare Life Sciences SH30028.02
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778100
Oligofectamine Thermo Fisher Scientific 1225011
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 22600-050
Resazurin sodium salt Sigma R7017-5G
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H21492
Formaldehyde (37% by weight) Fisher Scientific F79-4
500 ml bottles Corning 430282
Adhesive Sealing Film For Microplates Excel Scientific 361006007
Peelable Heat Sealing Foil Thermo Fisher Scientific AB-3720
BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette Fisher Scientific 11-120-625
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
MicroFlo Select (liquid dispenser) Fisher Scientific 11120621
BioTek Synergy HT plate reader Biotek N/A
Opera Imaging and Analysis Instrument PerkinElmer HH10000115
KiNEDx Robotic Arm Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) KX-300-660
Cytomat 24C Series Automated Incubator Thermo Fisher Scientific 50080227
JANUS Automated Workstation PerkinElmer AJI4M01
Plate Carousel Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) N/A
Alps 3000 plate sealer Thermo Fisher Scientific AB-3000

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References

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Cancer Research Ausgabe 134 onkolytische Viren RNAi Bildschirm hohem Durchsatz Krebs "Vaccinia" Rhabdovirus Zelle Host funktionelle Genomik
Genomweiten RNAi-Screening, Host Faktoren zu identifizieren, die onkolytische Viren Therapie zu modulieren
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Allan, K. J., Mahoney, D. J., Baird, S. D., Lefebvre, C. A., Stojdl, D. F. Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy. J. Vis. Exp. (134), e56913, doi:10.3791/56913 (2018).

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