Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Detección del genoma-ancha de RNAi para identificar los Host factores que modulan la terapia de Virus oncolíticos

Published: April 3, 2018 doi: 10.3791/56913
Automatic Translation
1,2, 1,4, 1, 1, 1,2,3
1Children's Hospital of Eastern Ontario (CHEO) Research Institute, 2Department of Biology, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 3Department of Pediatrics, University of Ottawa, 4Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary

Summary

Aquí se describe un protocolo para el empleo de proyección de ARNi de alto rendimiento para descubrir destinos host que se pueden manipular para mejorar la terapia de virus oncolíticos, específicamente rhabodvirus y vaccinia virus terapia, pero puede adaptarse fácilmente a otros oncolíticos plataformas de virus o para descubrir genes de host que modulan generalmente replicación del virus.

Abstract

Tecnología de proyección de alto rendimiento genoma ARNi (ARN de interferencia) ha sido ampliamente utilizada para descubrir factores de huésped que afectan la replicación del virus. Aquí presentamos la aplicación de esta tecnología para descubrir destinos host que modulan específicamente la replicación de Maraba virus un rhabdovirus oncolíticos y virus de la vacuna con el objetivo de mejorar la terapia. Mientras que el protocolo ha sido probado para su uso con oncolíticos Maraba virus y virus de la vaccinia oncolíticos, este enfoque es aplicable a otros virus oncolíticos y también puede ser utilizado para la identificación de objetivos de host que modulan la replicación del virus en células de mamíferos en general. Este protocolo describe el desarrollo y validación de un ensayo para la detección de alto rendimiento RNAi en células mamíferas, las consideraciones claves y pasos de preparación importantes para la realización de una pantalla principal de ARNi de alto rendimiento y una guía paso a paso para realización de una pantalla principal de ARNi de alto rendimiento; Además, describen ampliamente los métodos para llevar a cabo estudios de validación terciaria y secundaria pantalla validación. El beneficio de alto rendimiento RNAi es que permite catalogar, de una manera amplia e imparcial, factores de huésped que modulan cualquier aspecto de la replicación del virus para el cual uno puede desarrollar un ensayo en vitro como la infectividad, explosión de tamaño, y la citotoxicidad. Tiene el poder para descubrir imprevistos bioterapéuticos objetivos basados en el conocimiento actual.

Introduction

Proyección de alto rendimiento genoma ARNi ha demostrado para ser una valiosa herramienta para revelar conocimientos biológicos en diversas áreas de estudio como la biología del virus. Lo largo de la última década, han realizado numerosos grupos celulares a gran escala ARNi screening para identificar ampliamente genes host que modulan la replicación del virus (revisado en1,2,3,4 , 5 , 6 , 7). Curiosamente, un gran número de estas pantallas se han realizado en células de cáncer y varios virus que son candidatos de virus oncolíticos actuales incluyendo el vaccinia virus8,9,10 , Myxoma virus11, herpes simplex virus12, estomatitis vesicular virus13,14y Maraba virus15. Mientras que el foco de la mayoría de estos estudios fue en la identificación de factores de huésped que influyen en algún aspecto de la replicación del virus y no en la identificación de objetivos bioterapéuticos para mejorar la terapia de virus oncolíticos, datos valiosos pueden ser extraídos de estos conjuntos de datos en este sentido. Está claro que el potencial de gran alcance para identificar objetivos de host que se pueden manipular para mejorar la terapia de virus oncolíticos no ha sido plenamente explotado.

Una gran cantidad de plataformas de virus oncolíticos se están probando en estudios clínicos y preclínicos incluyendo herpes simplex virus, reovirus y vaccinia virus, que han tenido éxito demostrable en ensayos clínicos de última etapa. Para la mayoría de estas plataformas, los esfuerzos se han dirigido hacia alterar los genomas de virus para mejorar la terapia. Por ejemplo, para aumentar la especificidad del tumor, genes de virus específico han sido eliminados o transformado para restringir significativamente la replicación viral en las células normales, pero no en las células del tumor. En algunos casos, se han añadido los transgenes como GM-CSF (factor de estimulante de colonias de macrófagos en granulocitos) para potenciar la respuesta inmune o NIS (symporter del yoduro de sodio) para permitir la proyección de imagen in vivo y la absorción celular del radioiodide para terapéutica propósitos. Sin embargo, ha habido muy poco trabajo centrado en manipular los genes del anfitrión, tumor y explorar el impacto de genes del anfitrión, tumor en la replicación de virus oncolíticos. Con el advenimiento de la tecnología de proyección de alto rendimiento, ahora es posible para sondar interacciones virus host en una escala genoma y descifrar oportunidades para manipular el genoma del anfitrión para mejorar la terapia de virus oncolíticos (revisado en16, 17,18).

Nosotros reportamos el primer estudio que prueba-de-concepto para usar la investigación para identificar los host objetivos que podrían ser manipulados para mejorar la terapia de virus oncolíticos genética de alto rendimiento. Para descubrir genes de host que modulan Maraba virus oncolysis, un rhabdovirus oncolíticos están probando en fase I y II de ensayos, realizamos pantallas de RNAi del genoma a través de tres líneas celulares de tumor diferentes por duplicado con un siRNA (short interferencia RNA) Biblioteca dirigido a 18.120 genes15. Análisis de la vía de golpes en las pantallas revelaron enriquecimiento de los miembros de las vías de respuesta de estrés de ER (retículo endoplásmico). Se seleccionaron 10 golpes de estas vías para validación secundaria usando siRNA con secuencias de objetivos diferentes de los de la pantalla principal. Como parte de la validación terciario, se realizó un experimento de rescate con IRE1α (inositol-requerir alpha enzima 1) para confirmar que el golpe estaba en blanco. In vitro y en vivo la prueba usando un inhibidor de molécula pequeña de IRE1α dio lugar a eficacia dramáticamente mejorada oncolíticos.

Workenhe et al. 12 también realizó una pantalla de RNAi del genoma con un shRNA lentivirales combinado (horquilla corto RNA) Biblioteca dirigida a 16.056 genes para identificar los factores de host restringir el virus herpes simple humano tipo 1 oncolysis de KM100-mediados de (HSV-1) de mutante de mama células cancerosas. En la pantalla principal, identificaron 343 genes la caída de que conducen a mayor citotoxicidad de células infectadas KM100 sobre células infectadas con mofa; seleccionaron 24 de estos genes para la validación secundaria. De los 24 genes, 8 genes fueron confirmados en la pantalla secundaria con uno de ellos ser SRSF2 (arginina-serina/rico empalmar factor 2) que posteriormente fue confirmado mediante un experimento de rescate genético durante la validación terciario. El grupo pasó a identificar un ADN inhibidor de la topoisomerasa quimioterapéutico que reduce la fosforilación de la SRSF2 y demostró que el tratamiento combinado de KM100 de HSV-1 con el plomo de este inhibidor a la prolongada supervivencia de ratones con tumores TUBO.

En los estudios antes mencionados, fue seguido un flujo de trabajo similar. Cada uno comenzó con una pantalla de ARNi genoma principal seguida por una pantalla secundaria en un número selecto de aciertos identificados en la pantalla principal. Esto fue seguido por el terciario validación estudios, confirmando que el golpe era en blanco realizando genética rescate de experimentos in vitro con validación definitiva realizada por manipular el objetivo gen producto en vivo. En este artículo, ofrecemos primero un protocolo general para el desarrollo y validación de un ensayo de siRNA-proyección de alto rendimiento, que consiste en determinar las condiciones óptimas de la transfección, cantidad de virus y la longitud de la infección. También ofrecemos un protocolo detallado para la realización de una primaria, una pantalla de siRNA de alto rendimiento así como una descripción general del método para realizar validación de pantalla secundario y terciario validación.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. desarrollo y validación de un siRNA de alto rendimiento, análisis de detección

Nota: Para todos los experimentos, utilizar medios de cultivo tamponado con Hepes apropiados para cada línea celular. Vea la figura 1 para un resumen del flujo de trabajo de optimización análisis de validación terciario.

  1. Determinación de las condiciones óptimas de la transfección
    1. Seleccione una línea de células de tumor o idealmente tumor de múltiples células de líneas con las que optimizar las condiciones de la transfección (e.g. 786-O, NCI-H226, SF268, U20S, U373, OVCAR-8; ver discusión para más información sobre la selección de líneas celulares).
    2. Seleccione un reactivo de transfección o varios para probar. Puede ser necesario probar varios reactivos de transfección, como algunos pueden ser más tóxicos o más eficientes que otros en una línea celular determinada. También, tenga en cuenta que algunos pueden afectar en la infección por el virus o pueden generar una señal de euforia sobre la proyección de imagen.
    3. Decidir en positivo [e. g. siRNA dirigidas a PLK-1(Polo Like Kinase 1) ARNm, que induce la muerte celular] y negativa controles de transfección (p. ej. no metas siRNA).
    4. Seguir el protocolo de la transfección inversa para el reactivo de transfección particular, pero varían la cantidad de reactivo de transfección (e.g. 0.05, 0.1, 0.15 y 0.2 μL/pocillo) y célula siembra densidades (p. ej. 625, 1250, 2500 células/pocillo). Son repeticiones de las siguientes condiciones: no se trata de células, simulado transfected las células (es decir, las células más reactivo de transfección) y las células transfected con siRNA de control positivo y negativo de la transfección (ver figura 2A para la placa de una muestra diseño de página).
      1. En general, preparar 80 diluciones de nM de cada siRNA para una concentración final en el pozo de 10 nM (dependiendo de la biblioteca, una mayor concentración de siRNA puede ser requerida). A menos que se especifique lo contrario, diluir el siRNA con el reactivo de transfección diluyente. Preparar las diluciones del reactivo de transfección.
      2. Pipeta de 5 μL de siRNA por bien seguido de 5 μL de reactivo de transfección diluido. Para facilitar este paso, distribuir a lo largo de una columna de una placa de fondo U 96 pocillos, las mezclas de siRNA y el diluyente de siRNA (para células transfected untreated y simulacros). Distribuir a lo largo de una segunda columna, el reactivo de transfección diluido y diluyente reactivo de transfección sola (para las células no tratadas).
        1. Utilizando una pipeta electrónica, pipeta de 5 μL/pozo de los contenidos de la primera columna que contiene siRNA o siRNA diluyente en los pocillos correspondientes de la placa de 384 pozos seguida de 5 μL/pocillo del reactivo de transfección diluido o reactivo de transfección diluyente de la segunda columna.
      3. Centrifugue las placas a 1026 x g durante 1 min a temperatura ambiente e incubar durante el tiempo determinado por el reactivo de transfección (p. ej. 5-20 min).
      4. Mientras que las placas se incuban, preparar suspensiones celulares de diferentes densidades. Pipeta de 30 μL de la suspensión celular por pozo. Antes de colocar las placas en la incubadora, que las placas reposar 45-60 min a temperatura ambiente para permitir el asentamiento uniforme de células19.
        Nota: Si el período de incubación para el reactivo de transfección con siRNA es corto, preparar las suspensiones de la célula antes de la incubación.
      5. Incubar durante 48 a 72 h dependiendo de la longitud deseada de la caída para la pantalla.
    5. Preparar una fijación y coloración de la solución de formaldehído, Hoechst 33342 y PBS (tampón fosfato salino) para una concentración final en cada pozo de formaldehído al 4% y 5 ug/mL de Hoechst 33342. Según sea necesario, probar con una más alta (e.g. 7.5 ug/mL) o menor concentración (e.g. 2 ug/mL) de Hoechst si la señal es demasiado débil o demasiado fuerte, respectivamente.
    6. Dispensar 30 μL de la solución de fijación y tinción directamente en todos los pocillos. Incubar las placas durante 30 min a 37 ° C. Almacenar las placas a 4 ° C. Si se utiliza un microscopio no confocal, lave las placas con PBS utilizando una arandela de placa; en la mayoría de los casos, lavar es innecesario cuando se utiliza un microscopio confocal.
    7. Desarrollar un guión para cuantificar el número de células por pocillo.
      Nota: Se dispone de varias suites de software para este propósito y, aunque cada uno puede tener diferentes maneras de generar secuencias de comandos, todos generalmente tienen un medio de identificación de núcleos, células y regiones de interés así como cálculo de intensidades y propiedades morfológicas. En el desarrollo de una secuencia de comandos de detección, es importante considerar el tiempo requerido para ejecutar el script por placa y tal vez incluir mediciones sólo esenciales para minimizar el tiempo de procesamiento. Por ejemplo, para cuantificar el número de células, uno puede calcular el área de Hoechst por muy por encima de una intensidad especificada; y para cuantificar la extensión del virus, se puede calcular el área GFP (proteína verde fluorescente) por muy por encima de una intensidad especificada. El guión "preparado por" tendrá que ser comparado con el guión más elaborado para garantizar que ninguna información esencial se pierde.
    8. Analizar los resultados para determinar las condiciones óptimas de la transfección, que es la cantidad de reactivo de transfección y la célula siembra densidad que resulta en muerte celular importante (supervivencia de la célula de 0-30%) y mínimamente tóxico para las células (por ejemplo, 90-100% supervivencia de la célula). Nota: Puede tomar más tiempo para observar el fenotipo de muerte celular en las líneas celulares con tiempos de duplicación largo. Ver figura 2B y 2C para obtener resultados representativos. También, que sean las células transfectadas con siRNA dirigidas no a aproximadamente 90-100% confluente en el momento de la fijación que luego uno quiere infectar células que de esta confluencia.
  2. Determinación de la óptima cantidad de virus y la duración de la infección
    1. Realizar los mismos pasos de transfección inversa como se describe arriba (véase 1.1.4.1 a 1.1.4.4); sin embargo, utilizar solamente las condiciones óptimas de la transfección (ver 1.1.8) (por ejemplo, para las células O 786: 1500 células/pozo y 0.05 μL/pocillo de RNAiMAX) y, además, incluir pozos adicionales a ser infectados con el virus [p. ej. pozos con las células no tratadas, simulacros las células transfected las células transfected con no-siRNA y las células transfected con controles positivos de virus si los conocen (es decir, siRNA dirigidos a genes del anfitrión que inhibir o aumentar la replicación)].
      1. Ver Figura 3A para un diseño de placa de la muestra. Incubar durante 48-72 h.
    2. Infectar los pozos adicionales de virus con un virus oncolítico expresan una proteína fluorescente reportera (e.g. GFP) con una gama de multiplicidades de infección (MOIs) (por ejemplo, 0,001 a 10; El rango elegido se dependerá el nivel de resistencia o susceptibilidad de las células.). Incluyen pozos no infectados también. Pipeta de 40 μL de cada dilución de virus por pozo para un volumen final de 80 μL. Centrifugar la placa a 400 x g durante 30 min a temperatura ambiente.
    3. Siguiente la infección, las células viven con un alto contenido de imagen automatizado microscopio a intervalos regulares (por ejemplo, cada 4-8 h). Ver figura 3B y 3C.
    4. Desarrollar un guión para cuantificar la extensión de virus (por ejemplo área de GFP por pozo) (véase 1.1.7). Analizar las imágenes y seleccione un punto del tiempo y un MOI que permiten la detección de los aumentos y disminuciones en la extensión. Asegúrese de que el punto del tiempo y la caída MOI dentro de un rango lineal para facilitar la detección de pequeños cambios en la extensión. Calcular el factor Z (o Z') para el punto de tiempo dado y MOI.
      Nota: Estimado factor Z = 1-3 (σp + σn) / | μp- μn|, donde σp es la desviación estándar de muestra de los controles positivos de virus y σn es la desviación estándar de muestra negativa del virus de la controles; y μp es la media muestral de los controles de virus positivo y μn la media de la muestra de los controles negativos. Estimado Z-factor de 0.5 - 1.0 es considerada un ensayo excelente y adecuado para la detección de20,21.
    5. Confirmar que el siRNA control de virus negativo no tiene impacto en la replicación del virus por comparación con los pozos transfected y sin tratamiento simulados. A menudo es necesario probar varios controles negativos como algunos siRNA negativa controles pueden impactar en la replicación del virus.
  3. Validación final de la prueba de cribado de alto rendimiento
    1. Repita pasos 1.2.1 y 1.2.2 anterior, pero sólo este tiempo infectar las células con el Ministerio del interior óptima. En lugar de la proyección de imagen vivo, fijar y teñir la placa (como se describe en la 1.1.5 y 1.1.6) en el óptimo momento (véase 1.2.4).
    2. Imagen de la placa. Analizar los resultados usando el mismo script que se utilizará para la pantalla (véase 1.1.7 y 1.2.4). Confirmar las condiciones de transfección (es decir, de buena caída en pozos transfected con el control positivo de la transfección y mínima toxicidad en los pozos transfectadas con el control negativo de la transfección). Calcular el factor Z para determinar la robustez del ensayo (véase 1.2.4).
  4. Pruebas y consideraciones para la realización de cribado de alto rendimiento
    1. Probar la durabilidad de las placas de microtitulación como algunos platos pueden agrietarse durante la centrifugación, especialmente cuando las tapas estén y placas múltiples se centrifugaron a la vez. Para reducir el agrietamiento, centrifugar sin las tapas (siempre las placas juntas), o disminuir el número de placas se centrifugó por cubeta.
    2. Compruebe la estabilidad de la mezcla de reactivo de transfección con el tiempo. Una vez que se agrega el reactivo de transfección para las placas, puede haber una demora significativa antes de la adición de células; por lo tanto, es importante saber el período de tiempo para que la combinación de reactivo de transfección seguirá siendo eficaz. Para la pantalla, puede ser necesario preparar las células antes de agregar la combinación de reactivo de transfección para las placas.
    3. Preparar para usar el dispensador de líquidos. Determinar los volúmenes requeridos para dispensar el reactivo de transfección de las células, virus y fijar teniendo en cuenta el volumen que los asimientos de la tubería, el volumen perdieron a la distribución (si la unidad tiene esta característica) y el volumen residual en las botellas utilizadas para de dispensación.
      1. Establecer y probar los programas que se utilizarán para la dosificación de reactivo de transfección, virus y células. Para minimizar la pérdida de reactivo de transfección, límite, si es posible, el número de la dispensa. Establecer un protocolo para el depósito de líquido de calibración y pruebas de su exactitud y precisión.
    4. Prepararse para la distribución a granel de virus, células y reactivo de transfección
      1. Primero determine el número de placas a procesar en un lote, teniendo en cuenta el número de placas de células que pueden se tripsinizaron viable a la vez, el número de placas de microtitulación se puede centrifuga a la vez, la longitud de tiempo requerido para procesar un lote de placas con el dispensador de líquido y también el tiempo necesario para la proyección de imagen. Nota: Generalmente, aproximadamente 30 placas de procesamiento a la vez es bastante factible y 3 lotes de placas de procesamiento es manejable en un día.
      2. Verificar empíricamente el volumen de reactivo de transfección para procesar un lote de placas. Prueba de que este volumen es adecuada por dispensación 5 μL de agua destilada varias veces a través de una placa el número de veces que se necesitará para procesar un lote equivalente.
      3. Para asegurar la distribución uniforme de las células, estimar el tiempo necesario para distribuir las células a través de un lote de placas. Preparar una botella que contiene el volumen de las células necesarias para un lote y dispensar las células en varias columnas de una placa a la vez, a intervalos regulares durante el mismo tiempo que se necesita para dispensar a través de un lote de placas. Con qué frecuencia será necesario mezclar las células para mantener una distribución uniforme de las células de la prueba.
      4. Para asegurar la distribución uniforme del virus, repetir el mismo procedimiento anteriormente (véase 1.4.4.3), pero esta vez virus en pozos confluentes de dispensación. Si el virus no se distribuye uniformemente, considere preparar el virus en tubos cónicos y Vortex cada tubo antes de la dispensación.
    5. Seguir el crecimiento de las células para determinar la línea de tiempo para el crecimiento de suficientes células para la pantalla. También, determinar el número promedio de células que pueden ser cosechados por placa de células en fase logarítmica de crecimiento para poder estimar la cantidad necesaria para la pantalla.
  5. Pasos de la preparación final para el cribado de alto rendimiento
    1. Hasta un mes antes de comenzar el examen, determinar todos los materiales necesarios para la pantalla. Ordenar cualquier requiere reactivos (ver materiales). Asegurar la cantidad necesaria de virus es en mano (preferiblemente, usar el mismo caldo que se utilizó durante la optimización.).
    2. Dos semanas antes de comenzar la proyección, descongelar y crecen las células necesarias para la pantalla. Asegurar la disponibilidad de la centrífuga y centrifugar cuadrados cubos.
    3. Durante la semana antes de comenzar la proyección, preparar botellas de los medios de comunicación para la transfección inversa y la infección, un stock de etanol al 70%, diluyente de reactivo de transfección de 2 X (e.g. 2 X Opti-MEM), si es necesario (por ejemplo, si la biblioteca de siRNA se diluye en RNase-free de agua, uno va a querer usar 2 X para transfectar las células) y alícuotas de virus (uno por cada lote de placas). Verificar la condición de las células.
      1. Prepare una solución de tinción de Hoechst 33342 (por ejemplo, 5 mg/mL). Preparar un plato de equilibrio si uno va a ser necesario para la centrifugación.
      2. Asegúrese de que la arandela de placa es en buenas condiciones si se va a utilizar. Asegúrese de que el dispensador líquido es debidamente calibrado y dispensación con exactitud y precisión. También, asegurar que los programas se establecen correctamente en el dispensador líquido.

2. realización de la pantalla principal de alto rendimiento

Nota: Antes de comenzar la pantalla de ARNi, placas de microtitulación (p. ej. placas de 384 pocillos) deban ser vestida con la biblioteca de siRNA y controles de detección. Los siguientes pasos son mejor realizados por dos personas con una persona (es decir, persona A) siendo responsable de dispensar el reactivo de transfección y las células a través de las placas y la segunda persona (es decir, persona B) siendo responsable de la centrifugacion de las placas antes de transfección y para la preparación de las células. Entre paréntesis figuran algunos detalles para el procesamiento de un lote de 33 placas (es decir, la mitad de la biblioteca) con la línea celular 786-O.

  1. Preparación para la inversa de la transfección
    1. Persona A: poner suficientes medios, tripsina y PBS necesaria para procesar un lote de placas en un baño de agua de 37 ° C. Opcional: Trypsinize una placa de células y contar el número de células por placa con el fin de proporcionar una estimación en tiempo real de la cantidad de placas requeridas por lote.
    2. Obtener un lote de placaspor ejemplo 33 del congelador y esperar 20-30 min para permitir que las placas descongelar. Mientras que las placas están descongelando, continúe con los pasos siguientes.
      1. Persona A: pipeta en cónico 50 mL la cantidad de diluyente reactivo de transfección es necesario para el procesamiento de un lote de placas de los tubos (por ejemplo 2 x 37.125 mL) y colóquelos en un baño de agua de 37 ° C. Llenar dos botellas con etanol al 70% (por ejemplo botellas de 250-500 mL). Llene dos tubos cónicos de 50 mL con PBS y uno con agua destilada.
      2. Persona A: sumerja el depósito líquido de la tubería en una botella de etanol al 70%. Si no todas las puntas se utiliza para dispensar el reactivo de transfección (por ejemplo, si no se utilizan los pozos exteriores de la placa), separar el tubo innecesarias primero. Coloque un pedazo de cinta adhesiva alrededor del tubo para marcar el punto por debajo del cual el tubo puede ser considerado estéril. Cebar con aproximadamente 25 mL. Vierta más etanol en la botella para reemplazar el volumen perdido. Deje que el tubo siente en etanol durante un mínimo de 5 minutos.
      3. Persona B: Prepare a trypsinize las células. Rocíe la campana de cultivo de tejidos (TC) con etanol al 70%. Aerosol y coloque la pipeta necesaria, consejos, botellas y tubos de microcentrífuga para la preparación de las células en la campana (véanse 2.2.1.1 y 2.2.1.2). Centrifugue las placas selladas en sets a 1026 x g durante 2 min a temperatura ambiente. Retire las tapas de las placas en una campana de TC, si anteriormente se determina que las placas podrían quebrarse durante el centrifugado, cuando los párpados se mantienen (ver 1.4.1).
    3. Persona A: Retire las juntas de las placas. Antes, durante o después de los sellos se han quitado (dependiendo de la duración de incubación requerido), pipetear la cantidad necesaria de reactivo de transfección (e.g. 375 μL/tubo para una concentración final de 0.05 μl de RNAiMAX/pozo) en tubos cónicos que contiene el diluyente reactivo de transfección precalentado (e.g. 37.125 mL/tubo).
    4. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo 10 veces. Incubar a temperatura ambiente durante el tiempo determinado por el reactivo de transfección se utiliza (e.g. 0-10 min).
  2. Inversa de la transfección
    1. Que persona B complete las siguientes tareas.
      1. Comenzar trypsinizing las células (por ejemplo, 3 placas de células 786-O). Aspire los medios de comunicación de cada placa. Enjuague con 9 mL de PBS. Pipetear 3 mL de tripsina por placa. Incubar a 37 ° C por aproximadamente 5 minutos resuspender las células con 22 mL de medios de comunicación. Pipeta de arriba y abajo 10 veces.
      2. La suspensión de células de cada placa de cultivo de tejidos se combinan en una botella estéril. Mezclar la suspensión de células por inversión del tubo. Alícuotas de pipeta 1 mL de la suspensión de células en los tubos del microfuge separada dos. Retire una muestra de cada tubo de microcentrífuga y contar las células. Calcular el volumen de la suspensión celular para la densidad requerida (p. ej. 1500 células/pocillo) y preparar suficiente suspensión diluida (por ejemplo 500 mL) para distribuir a través de un lote de placas.
    2. Tener persona A completar las siguientes tareas en paralelo a la persona B.
      1. Vacíe el depósito de líquido de la tubería de etanol. Cebe el tubo con aproximadamente 25 mL de PBS y luego vaciar la tubería. Tenga cuidado al manipular la tubería para asegurarse de que la sección de la tubería por debajo de la cinta adhesiva que estarán inmersos en el reactivo de transfección y más tarde en la suspensión de células se mantiene estéril. Establecer aparte las placas que con seguridad se pueden hacer con un tubo cónico de solución de reactivo de transfección.
      2. Pipetear las soluciones de reactivo de transfección para arriba y abajo 10 veces. Cebe el tubo con la solución de reactivo de transfección. Para minimizar la pérdida de reactivo de transfección, cebar con suficiente solución para borrar apenas las puntas. Seleccionar el programa correcto en el dispensador líquido y dispensar 5 μl de reactivo de transfección por pozo.
        PRECAUCIÓN: Vigilar de cerca el nivel del reactivo de transfección para que se vuelva antes de que acabe. La terminación de las placas que son apartado debe proporcionar una indicación para agregar más solución de reactivo de transfección.
      3. Centrifugue las placas a 1026 x g durante 1 min a temperatura ambiente. Esta vez las tapas será, por lo que puede ser necesario centrifugar menos placas a la vez para evitar grietas (e.g. 2 placas por cubeta). Incubar las placas a temperatura ambiente durante el tiempo determinado por el reactivo de transfección se utiliza (por ejemplo 10-20 min).
      4. Durante la incubación, vaciar la tubería de la solución de reactivo de transfección y colóquelo en un tubo cónico de 50 mL completo con PBS. Enjuague el tubo con aproximadamente 25 mL de PBS de cebado y vaciado.
        1. Si más de los consejos va a ser utilizado para la dosificación de las células que fueron utilizados para la dosificación de reactivo de transfección, vuelva a colocar el tubo sin uso y vuelva a esterilizar los tubos con etanol al 70% antes de enjuagar el tubo con PBS (véase 2.1.2.2).
      5. La botella que contiene la suspensión de células una vez que se ha preparado de la mezcla. Colocar el tubo en la suspensión de células y cebar basta con ver que cada Consejo es dispensar correctamente. Dispensar 30 μL por pocillo de la suspensión de células a través de las placas. Si es necesario, mezcle la suspensión de células a intervalos regulares para evitar el asentamiento.
        PRECAUCIÓN: Algunas veces las gotas de la suspensión que contiene los medios de comunicación pueden adherirse a los lados de las puntas. Cuando esto se observa, tan pronto como sea posible aspirar o limpie con pelusa empaparon en etanol al 70%.
      6. Vacíe el tubo de la suspensión de células. Enjuague el tubo con aproximadamente 25 mL de PBS, seguido por aproximadamente 50 mL de agua destilada.
    3. Permita que las placas para reposar 45-60 min desde el momento de la siembra a temperatura ambiente antes de retornar las placas a la incubadora de la célula. Incubar las placas en una incubadora sin perturbaciones para la longitud deseada del gen silenciador (por ejemplo, 48 h) (véase 1.1.4.5).
  3. Infección
    1. Para ahorrar tiempo, el día antes de infectar las células, pipeta en estéril botellas la cantidad precisa de medios necesarias para infectar a cada lote de placas incluyendo medios para pozos no infectadas (por ejemplo, 2 x 350 mL y 2 x 50 mL para placas de 33). Además, el líquido dispensador de precisión y exactitud de la prueba y volver a calibrar si es necesario.
    2. Calentar el medio a 37 ° C. Llenar dos botellas con etanol al 70%, dos tubos cónicos de 50 mL con PBS y uno con agua destilada. Verifique que la centrífuga esté a temperatura ambiente.
    3. Esterilizar el tubo con etanol al 70% y lavar con PBS como se describió anteriormente (véase 2.1.2.2 y 2.2.2.1). Mientras que la tubería está sentado en el etanol, pipeta el volumen exacto del virus requerida al frasco que contiene los medios de comunicación previamente preparado para la infección (ver 2.3.1). Enjuague el tubo con PBS por cebado con 25 mL y luego vaciado.
    4. Sacar las placas de la incubadora y en la campana de TC. Cebe el tubo con los medios de comunicación. Verter 40 μL de medios de comunicación en los pocillos de control no infectado. Vaciar el tubo de media y lavar con 25 mL de PBS. (véase 2.2.2.5 por PRECAUCIÓN)
    5. Después de mezclar el virus, coloque el tubo en la botella que contiene el virus. Suministrar 40 μl de virus a través de las placas. Centrifugue las placas durante 30 min a 400 x g a temperatura ambiente. Devolver las placas en la incubadora. Incubar las placas para la longitud previamente determinada de tiempo (por ejemplo 24 h) (véase 1.2.4).
  4. Fijación y tinción de las células
    1. Para ahorrar tiempo, el día antes de la fijación, preparar una botella de fijación y coloración de la solución que contiene formaldehído y PBS (e.g. 179 mL de formaldehído al 37% y 270 mL de PBS para una concentración final de formaldehído al 4%) por cada lote de placas, pero omita la Tinción de Hoechst. Almacenar en el gabinete de luz es inflamable.
    2. Enjuague el tubo con etanol al 70% y PBS como se describió anteriormente (véase 2.1.2.2 y 2.2.2.1). Añadir el volumen necesario de Hoechst (ej. 2,5 mL a 5 mg/ml de Hoechst para una concentración final en el pozo de 7.5 μg/mL) para la fijación y coloración de la solución y mezcla.
    3. Dispensar 30 μL de fijación y tinción de solución a través de las placas. Coloque las placas en la incubadora durante 30 minutos. Tras la incubación, los sellos se aplica a las placas y almacenar las placas a 4° C protegido de la luz. Lavar las placas si es necesario (véase 1.1.6).
  5. Proyección de imagen y análisis de imagen
    1. Las placas de la imagen con un microscopio automatizado, alto contenido. Utilice los ajustes previamente, pero primero prueba los ajustes para asegurar que ajustes no es necesario.
    2. Cuantificar la GFP (u otro reportero fluorescente) y Hoechst zona por bien usando el script previamente desarrollado (ver 1.3.2). Prueba el script con un puñado de placas primero para determinar si cualquier ligeras modificaciones es necesario antes lote analizar todas las placas.
    3. Identificar hits. Nota: El robusto método Z-score/MAD (desviación media absoluta) es un método que se utiliza a menudo para tal fin. Por lo general, decenas de > 2 o < -2 se establecen como cortes. Este método se utiliza mejor cuando las muestras de siRNA se distribuyeron al azar a través de las placas y no, por ejemplo, agrupadas por función, las muestras se utilizan como controles negativos de hecho . Filtrar siRNAS citotóxicos como estos se espera disminuir no específicamente virus extendido (ver la discusión para más detalles sobre filtros hits citotóxicos).

3. validación de la pantalla secundario de golpes con la biblioteca de shRNAs TRC (el consorcio de RNAi)

Nota: Vea la discusión para más detalles en la selección de hits de validación secundaria y las posibles tecnologías de detección. Si la tecnología siRNA es seleccionada para la validación secundaria, el mismo protocolo de desarrollo y validación de ensayo puede ser utilizado como fue utilizado para la pantalla principal (ver 1).

  1. Obtener una biblioteca personalizada de shRNAs TRC dirigida a los genes candidatos de interés como stocks de glicerol.
  2. Preparar la transfección calidad plásmido ADN de las poblaciones de glicerol. Nota: Un protocolo detallado (es decir, "ShRNAs/sgRNA/ORF glicerol y preparación de DNA plasmídico") puede encontrarse aquí: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
  3. Producir el lentivirus expresando shRNAs dirigidos a los genes de interés con la plásmidos de ADN. Nota: Un protocolo detallado para la producción de lentivirus en placas de 96 pocillos [es decir, "shRNAs/sgRNA/ORF alto rendimiento producción Viral (96 bien)"] se puede encontrar aquí: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
  4. Infectar las células con el lentivirus. Nota: Un protocolo detallado para la infección lentivirales en placas de 96 pocillos (es decir, "Infección lentivirales") está disponible en línea en http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/dir/download?dirpath=protocols/production&filename=TRC%20viral % 20infection%20200909.pdf.
  5. Infectar las células con virus oncolíticos o siguiente selección de puromicina (ver 3.4 para el protocolo de selección) de células transduced con éxito o transducción inmediatamente después (sin selección de puromicina). Para determinar la cantidad óptima de virus y la duración de la incubación con virus, utilice el mismo método utilizado para la pantalla principal.

4. validación terciaria

Nota: El propósito de validación terciario es principalmente confirmar que el golpe es en destino, tumor específico y mejora la eficacia en vivo. Uno puede también probar si modula la propagación en un espectro de líneas celulares tumorales

  1. Confirmación que precipitación del gene del candidato está en blanco
    1. En primer lugar confirmar que existe una correlación entre el fenotipo y el silenciamiento de genes. Utilice el mismo análisis que se desarrolló para la pantalla o modificarlo para un formato 6-pozo evaluar la mejora o la inhibición de la propagación en un formato más grande. Realizar un curso de tiempo con las células transfectadas con siRNA dirigidos a los genes de más interés y menos virus.
    2. Los pocillos con células infectadas por el virus de la imagen y recoger los lysates de la célula de los pozos no infectados en intervalos regulares de tiempo. Determinar si existe una correlación entre el silenciamiento génico y la mejora o la inhibición de la propagación. Evaluar el silenciamiento del gen por reacción en cadena de polimerasa cuantitativa (qPCR) o Western blot.
    3. Realizar un experimento de rescate genético para confirmar que el éxito está en blanco. Nota: En un experimento típico de rescate, el gen candidato es derribado con ARNi mientras que al mismo tiempo las células son transfectadas transitoriamente con cDNA ARNi resistente (e.g. ortólogo del gen) expresando el gen candidato para determinar si el fenotipo del gen es restaurado o "rescatado". También se pueden emplear líneas celulares estables de overexpressing ARNi resistente cDNA de los genes candidatos de interés.
    4. Como alternativa, en lugar de un experimento de rescate genético, utilizar múltiples análisis ortogonales para confirmar que el golpe es en el blanco [por ejemplo, determinar si se obtiene el mismo fenotipo sobre la caída del gene de la blanco con siRNAs múltiples, sobre la caída de el gene de la blanco en varias líneas celulares estables expresando shRNA contra el gene de la blanco y en octavos de final con CRISPR (clusters regularmente otro corta repetición palindrómico)-tecnología de Cas9 en múltiples líneas celulares.].
  2. Confirmación de que el golpe es específico de tumor y modula la propagación a través de una gama de líneas celulares tumorales
    1. Realizar un análisis similar en 4.1.1, pero con las células normales así como con otras líneas de células tumorales.
  3. Confirmación de que la manipulación del gene del candidato mejora eficacia en vivo
    Nota: Se describen a continuación es tres posibles métodos para manipular el gen blanco en vivo.
    1. Encontrar un medicamento para manipular el destino de gene. Si existe un medicamento como un inhibidor de molécula pequeña que se dirige el mismo gen, administrar con el de virus oncolíticos en vivo. Es importante determinar el momento óptimo para la administración de la droga.
    2. Ingeniero el virus para inhibir o sobreexpresan el objetivo gen dependiendo si uno desea inhibir o potenciar el objetivo gene. Para inhibir el gen, el ingeniero el virus oncolíticos para expresar un dominante negativa del gene o shRNA expreso contra el gen. Para mejorar la expresión del objetivo gene, clon de virus oncolíticos con un transgénico overexpressing el gen.
    3. Ingeniero líneas de células con el gen derribado o golpeado-hacia fuera usando shRNA o CRISPR Cas9, respectivamente. La línea celular ingeniería del implante y el tipo de la célula línea en vivo y posteriormente infectar con virus oncolíticos. Nota: Este método sirve como una prueba de principio y puede ayudar a determinar si invertir más tiempo y recursos para desarrollar un fármaco para manipular el gen en vivo, por ejemplo, valdría la pena.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Un resumen del flujo de trabajo para la identificación de objetivos de host para mejorar la terapia de virus oncolíticos se presenta en la figura 1.

Como se ilustra en la figura 1, el primer paso crítico a la realización de una pantalla de alto rendimiento RNAi es desarrollo de ensayos. Figura 2A proporciona un diseño de placa de muestra para el ensayo de optimización de transfección. Figura 2B consiste de imágenes representativas de los resultados esperados, y 2 de la figura es un diagrama representativo de los resultados esperados. Tras la caída de siRNA de PLK-1, un gen que induce la muerte celular y puede utilizarse como control positivo para monitorear la eficiencia de precipitación de siRNA, uno esperaría que la supervivencia de la célula entre 0-30%, a menos que la línea celular tiene una larga doble tiempo en cuyo caso tendrá l onger observar el fenotipo de la célula de la muerte. El siRNA dirigidas no a también debe ser mínimamente tóxico para las células con una supervivencia relativa similar a la de las células no tratadas.

Otro elemento clave del desarrollo del ensayo es determinar el MOI que infectar a las células y la longitud del tiempo de infección. Figura 3A proporciona un diseño de placa de muestra para determinar la cantidad de virus y la duración de la incubación con el virus. Figura 3B muestra los resultados de un curso de tiempo vivo de 786-O células infectadas con vvDD-eGFP (oncolíticos virus de vaccinia expresando GFP mejorada con los genes de la timidina kinasa y Factor de crecimiento de Vaccinia eliminados) en varios MOIs. En figura 3se muestran imágenes representativas de células infectadas con vvDD-eGFP en una MOI de 0.05. Basado en los resultados graficados en la figura 3B, uno puede seleccionar una MOI de 0.05 y una longitud de infección de 21 h, esto permitiría la detección de los aumentos y disminuciones en la extensión que este momento está dentro de un rango lineal y el factor Z estimado en este ti punto es 0.6 para cohortes que aumentan y cohortes que disminuyen la propagación. Como parte de la validación de este ensayo, uno querrá fijar las células en esta MOI y punto del tiempo y calcular el factor Z.

Siguiendo el protocolo descrito, realizamos pantallas de RNAi del genoma a través de tres líneas de células tumorales diferentes (por ejemplo OVCAR-8, U373, NCI-H226) por duplicado con una biblioteca de siRNA dirigidos a genes 18.12015. El método MAD, identificamos 1008 hits común a por lo menos 2 de las líneas celulares de 3 cáncer (Figura 4A). Análisis de la vía de golpes en las pantallas revelaron enriquecimiento de los miembros de la UPR (respuesta de la proteína desplegada) y ERAD (degradación de proteínas retículo endoplasmático asociada) vías (Figura 4A). Se seleccionaron 10 golpes de estas vías para validación secundaria usando siRNA con secuencias de objetivos diferentes de los de la pantalla principal (Figura 4B). Como parte de la validación terciario, se realizó un experimento de rescate genético con IRE1α y ATF6α (activación transcripción factor 6 alfa) para confirmar que estos éxitos fueron en blanco (figura 4).

Figure 1
Figura 1: esquema de flujo de trabajo para la identificación de objetivos de host para mejorar la terapia de virus oncolíticos. El primer paso es desarrollar y validar un análisis para detección de alto rendimiento ARNi, que incluye la optimización de las condiciones de transfección para introducir siRNA en las células, determinar la cantidad óptima de virus (es decir MOI) para infectar las células con la duración de la incubación con el virus. El segundo paso es realizar una pantalla de alto rendimiento en todo el genoma. Una biblioteca de siRNA dirigidos a genes en el genoma completo es dispuesta en placas de microtitulación. Las células son entonces revés transfected con la biblioteca de siRNA. Después de un período de incubación de 48-72 h para permitir el silenciamiento del gen, las células están infectadas con la cantidad óptima de virus. Después de la longitud óptima de incubación con el virus, las células son fijo manchadas y posteriormente fotografiadas con un microscopio de alto contenido. Posterior de imagen y análisis de datos le ayudará a identificar los genes que modulan significativamente la replicación del virus, que se denominan "hits." Una pantalla de validación secundaria se realiza en seleccionarlos hits desde la pantalla principal generalmente con siRNA o shRNA regiones diferentes semillas. Experimentos de validación terciario se realizan para confirmar que los golpes son en blanco, específico de tumor y mejoran la eficacia en vivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: optimización de la transfección condiciones para análisis de proyección de ARNi de alto rendimiento. (A) un diseño de placa de muestra para la optimización de las condiciones de la transfección con dos líneas celulares diferentes. (B) imágenes representativas de 786-O células (1500 células/pocillo) teñidos con Hoechst 33342 tras 72 h incubación con transfección reactivos diluyente solo (es decir, no se trata), con reactivo de transfección y diluyente (es decir, mock transfectados), con siRNA dirigidas no a y con siRNA dirigidas a PLK-1. (C) representante de los resultados del experimento de optimización de transfección con 22% de supervivencia de las células transfectadas con siRNA PLK-1 (n = 24) y 94% de supervivencia de las células transfectadas con siRNA dirigidas no a (n = 8). Barras de error = ± SD, desviación estándar. barras de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: determinación de la cantidad de virus y la duración de la incubación con virus para ensayo de cribado de alto rendimiento ARNi. (A) un diseño de placa muestra para optimizar la cantidad de virus y la duración de la incubación con el virus. Columnas 1 y 24 contienen transfección controles y son izquierda no infectados. Las columnas 2 a 23 contienen las células no tratadas y simulacros células transfected las células transfectadas con los controles positivo y negativo de virus todos infectados con una gama de MOIs a partir de ningún virus en las columnas 2 y 3. (B) 786-O células eran inversas transfected con siRNA dirigidas no a y se incubaron durante 48 h. Posteriormente fueron infectados con vvDD-GFP en el MOIs indicado e imagen a intervalos de 8 h a partir de infección después de 5 horas (hpi). El área media del GFP por pozo (± SD) fue calculado para cada punto del tiempo (n = 12) y trazado en el gráfico. El factor Z calculado entre los puntos A y B es de 0.6 y el factor Z calculado entre los puntos B y C es 0,6. (C) representativas imágenes en vivo de bien infectado con una MOI de 0.05 en los momentos indican. Aumento, x 10; 9 campos/pozo; barras de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: pantalla de genoma identifica bloqueo de respuesta de estrés de ER como un sensibilizador potente de Rhabdovirus-mediada Oncolysis. (A) diagrama de Venn que el número de golpes superpuestos de alto rendimiento RNAi pantallas en 3 líneas celulares de tumor y una mesa (+ sintético letal;-, no hay interacción) y esquema (hits contorneado en rojo) hits claves dentro de la UPR y ERAD vías. (B) cambios de50 EC (barras de color negro, eje a la izquierda) se determinaron para células U373 tratadas con el virus de Maraba (48 h) después del tratamiento con siRNA (72 h) a una serie de golpes UPR/ERAD en la pantalla. Relativa expresión de mRNA para cada gen tras caída de siRNA (72 h) se representa en blanco (eje derecho). (C) ensayos de viabilidad celular se llevaron a cabo 48 horas después de la infección del virus de Maraba, en U373 células expresar ectópicamente ratón control GFP (o ATF6α) ± siRNA dirigidos a humanos ATF6α (o dirigida de a [NT] control, panel de la izquierda) o XBP1(s) humanos (o el control ) ± siRNA dirigidos a humano α IRE1(o de control, a la derecha panel). Se muestran manchas blancas /negras occidentales demostrar silenciamiento de genes y expresión génica ectópica. Cambios de CE50 = el cambio en la dosis de virus necesaria para matar al 50% de las células; Barras de error = ±SD; XBP1(s) = proteína de unión a X-box 1 (empalmado); En (B), se realizaron ANOVAs unidireccionales seguida por un Bonferroni prueba post-hoc de comparación múltiple para derivar los valores de p; En la letra C, t-pruebas del estudiante se realizaron para derivar los valores de p; * p < 0.05; #p < 0.05. (Esta cifra ha sido modificada de Mahoney et al., 201115). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aquí presentamos un protocolo para el empleo de proyección de ARNi de alto rendimiento para identificar objetivos de host que se pueden manipular para mejorar la terapia de virus oncolíticos. Esto ha sido probado con éxito con oncolíticos Maraba virus y virus de la vaccinia oncolíticos, pero, como se ha señalado, puede ser adaptado para su uso con otros virus oncolíticos u otros virus generalmente para identificar host genes que modulan la replicación del virus. El protocolo de investigación también está diseñado para identificar los genes que aumentan o disminuyen la propagación, pero se puede modificar fácilmente para otras lecturas. Nuestras pantallas con Maraba virus, por ejemplo, fueron diseñados para identificar los genes moduladores oncolysis utilizando un ensayo simple colorante vital basada en la resazurina para conseguir viabilidad celular (ver figura 4)15. En estas pantallas, tras incubación con virus, en lugar de fijar las células con formaldehído y la coloración con Hoechst, nos dispensa de resazurina colorante en cada pocillo (concentración final de 20 μg/mL) y, después de una incubación de 6 h, medimos la absorbancia (573 nm) con una lector de placas. Nosotros podríamos también han utilizado número de celular basado en la tinción de Hoechst como una lectura. Mientras que era innecesario en esta pantalla con un reportero sustituto para supervisar la replicación del virus, un virus con una proteína de reportero, particular una proteína fluorescente facilitar la optimización de la pantalla como uno puede, por ejemplo, supervisar replicación del virus vivo; por otra parte, un virus con una proteína de reportero es menos engorroso y costoso que usando los anticuerpos a la mancha para antígenos virales, pero es posible a la pantalla sin uno. Además, uno podría modificar aún más el análisis para investigar factores de huésped que impactan en la infectividad, tamaño de ráfaga y aún más detallada los fenotipos como muerte de las células inmunológicas. En cada caso, se seguiría un similar desarrollo protocolo, proyección, estrategia y métodos de validación secundaria y terciaria.

En el protocolo, le sugerimos optimizar condiciones de transfección idealmente con múltiples líneas de células tumorales. Hay al menos dos razones para la optimización de múltiples líneas celulares. Una razón es que no todas las líneas celulares susceptibles de proyección de alto rendimiento como algunos pueden ser difíciles de transfectar o pueden no adherirse bien, pero es una razón clave para permitir la investigación con líneas celulares de múltiples con el fin de evitar el sesgo intrínseco de la célula. La elección de líneas de células depende en gran medida de los objetivos. Uno puede decidir concentrarse en un tipo de cáncer en particular o seleccionar tipos de cáncer diferentes para cubrir un espectro más amplio. Alternativomente, uno puede centrarse en líneas celulares tumorales que son resistentes a identificar factores de host que se pueden manipular para hacer las líneas celulares de tumor menos resistentes a la infección por el virus oncolíticos.

Además de la selección de líneas de células, la selección de los controles positivo y negativo de virus es una consideración importante para cualquier pantalla. En algunos casos, genes de virus que son necesarios para limitan la replicación no se conoce o, si son conocidos, pueden ser específicos de la célula. Por lo tanto, uno puede todavía determinar la robustez aproximado y el rango dinámico del ensayo utilizando controles de suplente. Por ejemplo, uno podría utilizar células no infectadas o células infectadas con un bajo MOI como control positivo de sustituto para la identificación de genes que disminuyen la propagación en caída. Para la identificación de genes que mejoran la difusión sobre la caída, uno podría infectar las células con una serie de diluciones del virus y usar pozos con la máxima de la señal como un control positivo de suplente.

Selección de éxitos para la validación de la pantalla secundaria y el tipo de tecnología a emplear es otro asunto que requiere de cuidadosa deliberación. Los candidatos se seleccionan generalmente para la validación de la pantalla secundaria basado en la magnitud del golpe, a si significativamente modulan la difusión en múltiples líneas celulares de cáncer (si pantallas de primarias realizaron en múltiples líneas celulares) y de interés biológico. Herramientas bioinformáticas como DAVID22,23, Pantera24, cadena25 y26 de PINdb pueden ayudar a aislar las vías y hits de interés biológico. Mercer et al. 8 describe el uso de software de análisis de imágenes de código abierto y también han hecho disponibles de un algoritmo que desarrollaron para la visualización y análisis de resultados. Un factor a tener en cuenta al interpretar los resultados es ese silenciamiento del gen puede tener diferentes efectos dependiendo de la etapa en el ciclo de vida del virus que está siendo investigado. Por ejemplo, es posible que caída de un gene temprano en el ciclo de vida puede inhibir la replicación del virus, mientras que la caída en una etapa posterior puede aumentar la replicación. A menudo, pantallas secundarias se realizan con siRNA de un proveedor con regiones diferentes semillas con múltiples siRNAs por gene. Sin embargo, se pueden emplear tecnologías complementarias dirigidas a genes candidatos como vectores CRISPR Cas9 o lentivirus expresando shRNA.

El método de análisis también es una consideración crítica. Aquí sugerimos el robusto Z-score o MAD20,27 con sugirió cortes para llamar golpe de > 2 o < -2. Los cortes se pueden aumentar o disminuir dependiendo de si el enfoque es en la eliminación más falsos positivos o capturar más falsos negativos. Por ejemplo, en una pantalla de alto rendimiento reciente con vaccinia virus9, el corte más baja se fijó en -1.5 (no cortes superiores fueron descritos como el foco en la identificación de genes que disminuyeron propagación en caída). También hay otros métodos que pueden emplearse como z-score, SSMD (diferencia de medias estandarizada estrictamente), B puntuación20,28,29,30. Carretillas et al.31 en comparación con listas de golpe generadas por fila suma, loco, z-score y SSMD y encontrado que cada método de análisis resultó en diferentes listas de éxito. En su totalidad, no hay método perfecto o corte. En última instancia, estudios de validación validación y terciario secundario pantalla confirmará verdaderos hits.

También debe considerarse el método de filtrar hits citotóxicos. Una forma es realizar pantallas principales en paralelo más o menos virus. Esto permite la detección de siRNAs que son citotóxicos por cuenta propia. Este fue nuestro enfoque en nuestra Maraba virus pantallas15; sin embargo, esto no es a menudo práctico. Quizás un método más práctico, además de ser robusta, es determinar los hits que son citotóxicos como parte de la secundaria de la pantalla validación, especialmente si su foco es identificar éxitos que disminución de la replicación sobre la caída. Por ejemplo, en una pantalla principal de todo el genoma con virus del mixoma, Teferi et al. 11 había identificado 1.588 siRNAs que disminuye la replicación del virus en caída. Para filtrar los siRNAs citotóxicos, llevó a cabo una pantalla secundaria de citotoxicidad con estos siRNAs; midieron la célula viabilidad 72 h post-transfección usando un análisis de viabilidad de la célula de resazurina. SiRNAs citotóxicos fueron identificados basado en un Z-score de ≤-1.96. Otro enfoque es simplemente filtrar siRNAs citotóxicos de los datos de cribado primario basados en una reducción del número de células de un determinado porcentaje, por ejemplo, por una reducción > 50% como en Sivan et al. 9, o en base a una partitura como en Lee et al. 14; en su estudio de los factores de host requeridos para la replicación de virus de estomatitis vesicular, excluyen hits siRNA que redujo la viabilidad celular por > 3.0 desviaciones de estándar de la media. El número medio de células fue determinado basado en la tinción de Hoechst de núcleo celular y, aunque no explícitamente indicado, la media aparentemente fue calculada sobre una base por placa, ya que es claro que la media señal GFP se calculó una por placa.

Una limitación de cualquier pantalla de ARNi de alto rendimiento es el frecuentemente elevado número de falsos positivos y negativos, que pueden venir como consecuencia del diseño del ensayo, la tecnología utilizada o a través de errores sistemáticos. Por ejemplo, una proteína significativamente puede afectar la replicación del virus, pero el momento elegido para el silenciamiento del gen puede ser demasiado corto dada la vida media de la proteína para detectar su efecto conduce a un resultado falso negativo en virtud del diseño del ensayo. Está bien establecido que precipitación incompleta y los efectos del objetivo de la tecnología de siRNA también pueden introducir negativos y falsos positivos. Errores sistemáticos, tales como el efecto de borde32, pueden generar resultados engañosos también. Aquí la señal en el exteriores pocillos de la placa puede ser sistemáticamente más alta o más baja que el resto de la placa debido a la evaporación. Son las estrategias para la dirección de algunos de estos problemas como, por ejemplo: disminuyendo la concentración de siRNA para reducir efectos off-target33, reconfiguración de los diseños de la placa para rellenar los pozos exteriores con los medios de comunicación para mitigar el efecto de borde o empleando métodos computacionales que se han desarrollado para detectar y contrarrestar los errores sistemáticos tales como el efecto de borde32,34,35. Un método general para hacer frente a los falsos positivos es llevar a cabo una pantalla secundaria después de la pantalla principal. Como una forma de lidiar con falsos negativos, uno puede relajarse el atajo para llamar golpe y son posibles falsos negativos para inspección secundaria. Esto, por supuesto, no captará falsos negativos que están muy por debajo del corte. Pantallas de primarias también deben realizarse en duplicado o triplicado para limitar los resultados espurios. En última instancia, no importa de qué estrategias se emplean, ninguna pantalla de alto rendimiento a identificar exhaustivamente todos los éxitos verdaderos, pero puede proporcionar un tesoro de datos de los cuales uno es probable que algunos éxitos valiosos que pueden ser capitalizados en la mina.

En este protocolo, describe el uso de matriz siRNA y shRNA tecnología, aunque otra alternativa es la utilización de shRNAs agrupado y CRISPR Cas9 bibliotecas. Una biblioteca de shRNAs agrupado fue empleada en Workenhe et al. 12 estudio esbozado en la introducción. Combinado de CRISPR Cas9 tecnología ha sido utilizado para realizar pantallas de escala de genoma para identificar los factores de host requeridos para la replicación del virus Zika virus36West Nile virus37,38, dengue virus39 y hepatitis C virus39. La ventaja de usar bibliotecas combinadas es que son menos caros para comprar, no requieren infraestructura especializada (por ejemplo, dispositivos, microscopios de alto contenido y equipos robóticos para manejo de líquidos), ni con los altos costos de operación y el mantenimiento de esta infraestructura, que requieren pocos insumos. La desventaja es que los tipos de lecturas son más limitados. En las pantallas de interacción biblioteca la mayoría si no todos los virus host hasta la fecha, la lectura es viabilidad celular o falta de ella; uno no puede fácilmente sondeo de fenotipos más complejos. La elección del formato depende de la pregunta biológica hecha.

Los avances en la tecnología de cribado genético en las últimas décadas que primeras pantallas habilitadas en bacterias y levaduras ahora actual pantallas escala genoma en células humanas han abierto la puerta para el descubrimiento en diversos campos de estudio. Estas pantallas genéticas no sólo nos han permitido responder a preguntas fundamentales de la biología, pero nos han dado las llaves para liberar ideas en desarrollo y mejora de biotherapeutics. Si bien todavía hay lecciones a ser aprendidas y los desafíos a superar con esta tecnología, los resultados hasta la fecha han sido emocionantes. Los descubrimientos probablemente sea aún mayores como novela tecnología incluyendo bibliotecas CRISPR Cas9 para tamizar, microfluídica y en vivo tecnologías siguen a madurar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por becas del Instituto de Ontario para la investigación del cáncer, la Fundación de Canadá para la innovación, la Fundación de cáncer Regional de Ottawa y el Instituto de investigación del zorro de Terry. K.J.A. fue apoyado por una beca postgrado Vanier Canadá, un Instituto canadiense de salud investigación-Master Award y una beca de postgrado de Ontario.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumables
siRNA library GE Dharmacon G-005005-02
Corning 384-well plate Corning 3985
Falcon 384-well plate Becton Dickinson 353962
Water Sigma W4502
siGenome SMARTpool PLK1 GE Dharmacon M-003290-01
AllStars Negative Control siRNA Qiagen SI03650318
siGenome Non-targeting siRNA Pool #2 GE Dharmacon D-001206-14-20
DMEM/HIGH Glucose GE Healthcare Life Sciences SH30022.01
Fetal Bovine Serum Sigma F15051-500ML
HEPES solution (1M) Sigma H3535-100ML
Penicillin-Streptomycin 100X solution GE Healthcare Life Sciences SV30010
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific 2500056
DPBS/Modified GE Healthcare Life Sciences SH30028.02
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778100
Oligofectamine Thermo Fisher Scientific 1225011
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 22600-050
Resazurin sodium salt Sigma R7017-5G
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H21492
Formaldehyde (37% by weight) Fisher Scientific F79-4
500 ml bottles Corning 430282
Adhesive Sealing Film For Microplates Excel Scientific 361006007
Peelable Heat Sealing Foil Thermo Fisher Scientific AB-3720
BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette Fisher Scientific 11-120-625
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
MicroFlo Select (liquid dispenser) Fisher Scientific 11120621
BioTek Synergy HT plate reader Biotek N/A
Opera Imaging and Analysis Instrument PerkinElmer HH10000115
KiNEDx Robotic Arm Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) KX-300-660
Cytomat 24C Series Automated Incubator Thermo Fisher Scientific 50080227
JANUS Automated Workstation PerkinElmer AJI4M01
Plate Carousel Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) N/A
Alps 3000 plate sealer Thermo Fisher Scientific AB-3000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cherry, S. What have RNAi screens taught us about viral-host interactions? Curr. Opin. Microbiol. 12 (4), 446-452 (2009).
  2. Panda, D., Cherry, S. Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions. Curr. Opin. Virol. 2 (6), 784-792 (2012).
  3. Houzet, L., Jeang, K. T. Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis. Exp. Biol. Med. 236 (8), 962-967 (2011).
  4. Friedel, C. C., Haas, J. Virus-host interactomes and global models of virus-infected cells. Trends Microbiol. 19 (10), 501-508 (2011).
  5. Gao, S., Yang, C., et al. Applications of RNA interference high-throughput screening technology in cancer biology and virology. Protein Cell. 5 (11), 805-815 (2014).
  6. Kilcher, S., Mercer, J. Next generation approaches to study virus entry and infection. Curr. Opin. Virol. 4, 8-14 (2014).
  7. Ramage, H., Cherry, S. Virus-Host Interactions: From unbiased genetic screens to function. Annu. Rev. Virol. 2 (1), 497-524 (2015).
  8. Mercer, J., Snijder, B., et al. RNAi screening reveals proteasome- and Cullin3-dependent stages in vaccinia virus infection. Cell Rep. 2 (4), 1036-1047 (2012).
  9. Sivan, G., Martin, S. E., et al. Human genome-wide RNAi screen reveals a role for nuclear pore proteins in poxvirus morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (9), 3519-3524 (2013).
  10. Beard, P. M., Griffiths, S. J., et al. A loss of function analysis of host factors Influencing vaccinia virus replication by RNA Interference. PLoS ONE. 9 (6), e98431 (2014).
  11. Teferi, W. M., Dodd, K., Maranchuk, R., Favis, N., Evans, D. H. A whole-genome RNA interference screen for human cell factors affecting myxoma virus replication. J. Virol. 87 (8), 4623-4641 (2013).
  12. Workenhe, S. T., Ketela, T., Moffat, J., Cuddington, B. P., Mossman, K. L. Genome-wide lentiviral shRNA screen identifies serine/arginine-rich splicing factor 2 as a determinant of oncolytic virus activity in breast cancer cells. Oncogene. 35 (19), 2465-2477 (2015).
  13. Panda, D., Das, A., et al. RNAi screening reveals requirement for host cell secretory pathway in infection by diverse families of negative-strand RNA viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (47), 19036-19041 (2011).
  14. Lee, A. S. -Y., Burdeinick-Kerr, R., Whelan, S. P. J. A genome-wide small interfering RNA screen identifies host factors required for vesicular stomatitis virus infection. J. Virol. 88 (15), 8355-8360 (2014).
  15. Mahoney, D. J., Lefebvre, C., et al. Virus-tumor interactome screen reveals ER stress response can reprogram resistant cancers for oncolytic virus-triggered Caspase-2 cell death. Cancer Cell. 20 (4), 443-456 (2011).
  16. Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. A call to arms: Using RNAi screening to improve oncolytic viral therapy. Cytokine Growth Factor Rev. 21 (2-3), 161-167 (2010).
  17. Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. Functional genomic screening to enhance oncolytic virotherapy. Br. J. Cancer. 108 (2), 245-249 (2012).
  18. Allan, K. J., Stojdl, D. F., Swift, S. L. High-throughput screening to enhance oncolytic virus immunotherapy. Oncolytic Virother. 5, 15-25 (2016).
  19. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8 (5), 566-570 (2003).
  20. Birmingham, A., Selfors, L. M., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6 (8), 569-575 (2009).
  21. Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  22. Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
  23. Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).
  24. Thomas, P. D., Campbell, M. J., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
  25. Szklarczyk, D., Morris, J. H., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D362-D368 (2017).
  26. Luc, P. -V., Tempst, P. PINdb: a database of nuclear protein complexes from human and yeast. Bioinformatics. 20 (9), 1413-1415 (2004).
  27. Chung, N., Zhang, X. D., et al. Median absolute deviation to improve hit selection for genome-scale RNAi screens. J. Biomol. Screen. 13 (2), 149-158 (2008).
  28. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z Score, SSMD*, z* Score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
  29. Zhang, X. D., Lacson, R., et al. The use of SSMD-based false discovery and false nondiscovery rates in genome-scale RNAi screens. J. Biomol. Screen. 15 (9), 1123-1131 (2010).
  30. Amberkar, S. High-throughput RNA interference screens integrative analysis: towards a comprehensive understanding of the virus-host interplay. World J. Virol. 2 (2), 18-31 (2013).
  31. Barrows, N. J., Le Sommer, C., Garcia-Blanco, M. A., Pearson, J. L. Factors affecting reproducibility between genome-scale siRNA-based screens. J. Biomol. Screen. 15 (7), 735-747 (2010).
  32. Carralot, J. -P., Ogier, A., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28 (2), 261-268 (2011).
  33. Caffrey, D. R., Zhao, J., et al. siRNA off-target effects can be reduced at concentrations that match their individual potency. PLoS ONE. 6 (7), e21503-e21511 (2011).
  34. Makarenkov, V., Zentilli, P., Kevorkov, D., Gagarin, A., Malo, N., Nadon, R. An efficient method for the detection and elimination of systematic error in high-throughput screening. Bioinformatics. 23 (13), 1648-1657 (2007).
  35. Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Brief. Bioinform. 16 (6), 974-986 (2015).
  36. Savidis, G., McDougall, W. M., et al. Identification of Zika virus and dengue virus dependency factors using functional genomics. Cell Rep. 16 (1), 232-246 (2016).
  37. Ma, H., Dang, Y., et al. A CRISPR-Based screen identifies genes essential for West-Nile-virus-induced cell death. Cell Rep. 12 (4), 673-683 (2015).
  38. Zhang, R., Miner, J. J., et al. A CRISPR screen defines a signal peptide processing pathway required by flaviviruses. Nature. 535 (7610), 164-168 (2016).
  39. Marceau, C. D., Puschnik, A. S., et al. Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens. Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).

Tags

Investigación de cáncer número 134 oncolíticos virus RNAi pantalla de alto rendimiento cáncer vaccinia rhabdovirus celular host genómica funcional
Detección del genoma-ancha de RNAi para identificar los Host factores que modulan la terapia de Virus oncolíticos
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Allan, K. J., Mahoney, D. J., Baird, … More

Allan, K. J., Mahoney, D. J., Baird, S. D., Lefebvre, C. A., Stojdl, D. F. Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy. J. Vis. Exp. (134), e56913, doi:10.3791/56913 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter