Summary
Здесь мы описываем протокол для применения высокопроизводительного скрининга RNAi раскрыть узел целевые объекты, которые можно манипулировать для повышения онколитического вирус терапии, специально rhabodvirus и vaccinia вируса терапия, но она может быть легко адаптированы для других онколитического вирус платформ или для обнаружения узла генов, которые модулируют репликации вируса в целом.
Abstract
Высок объём генома общесистемной интерферирующих РНК (РНК-интерференции) скрининг технология широко используется для обнаружения хоста факторов, которые влияют на репликацию вируса. Здесь мы представляем применение этой технологии для раскрытия узла цели, которые конкретно модулировать репликации вируса Мараба, онколитического rhabdovirus и vaccinia вируса с целью повышения эффективности терапии. В то время как протокол был протестирован для использования с онколитического Мараба вирус и онколитического vaccinia вируса, этот подход применим к другим онколитического вирусов и также может быть использован для идентификации узла цели, которые модулируют репликацию вируса в клетках млекопитающих в Общие. Этот протокол описывает разработку и проверку assay для высокопроизводительного скрининга RNAi в mammalian клеток, основные соображения и этапы подготовки, важное значение для проведения начального экрана RNAi высокой пропускной способности и шаг за шагом руководство для проведение основной экран RNAi высокой пропускной способностью; Кроме того он широко описаны методы для проведения проверки вторичного экрана и третичного проверки исследований. В интересах RNAi высокопроизводительного скрининга является, что она позволяет каталог, в обширной и беспристрастной моды, принимающей факторы, которые модулируют любой аспект вирусной репликации, для которого можно разработать в vitro assay например инфективности, лопнул размер, и цитотоксичность. Он имеет право раскрыть биотерапевтической целей непредвиденных на основе современных знаний.
Introduction
Высокопроизводительного скрининга RNAi генома общесистемной оказался бесценным инструментом для выявления биологических идеи в различных областях исследований, включая вирус биологии. За последние десять лет или около того многочисленные группы провели на основе ячеек крупномасштабных RNAi скрининг широко определить хост генов, которые модулируют репликации вируса (Проверено в1,2,3,4 , 5 , 6 , 7). интересно, что большое количество этих экранов были проведены в раковые клетки и несколько с вирусами, которые являются текущие онколитического вирус кандидатов, включая vaccinia вируса8,9,10 , Миксома вирус11, вирус простого герпеса12,13,вирус везикулярного стоматита14и Мараба вирус15. Хотя основное внимание в большинстве этих исследований на определении узла факторов, которые влияют некоторые аспекты репликации вируса и не на выявлении биотерапевтической цели для повышения онколитического вирус терапии, ценные данные могут быть заминированы из этих наборов данных в этой связи. Ясно, что мощный потенциал для идентификации узла цели, которые можно манипулировать для повышения онколитического терапии вирус не был полностью задействован.
Множество платформ вируса онколитического в настоящее время испытываются в доклинических и клинических исследований, включая симплекс вирус, реовирусной и vaccinia вируса герпеса, которые имели ощутимый успех в поздней стадии клинических испытаний. Для большинства из этих платформ усилия были направлены на изменяя геномов вируса для повышения терапии. Например для увеличения специфичности опухолей, конкретные вирус гены были удалены или мутировал значительно ограничить вирусной репликации в нормальных клеток, но не в опухолевых клетках. В некоторых случаях, как ГМ-КСФ (гранулоцитарный макрофагальный колониестимулирующий фактор) для полифункциональное иммунный ответ или NIS (Симпорт йодида натрия) для включения в vivo изображений и клеточных radioiodide поглощения были добавлены трансгенов для терапевтических целей. Однако там было очень мало работы сосредоточены на манипулирование хост/опухоль гены и изучает влияние генов хост/опухоли на репликацию вируса онколитического. С появлением технологии высокопроизводительного скрининга, теперь это возможно прозондирует область взаимодействия хост вирус в масштабе генома и расшифровать возможность манипулировать геном хоста для повышения онколитического вирус терапии (пересмотрена в16, 17,18).
Мы сообщили первый исследование демонстрирует доказательства в концепция использования высокопроизводительных генетический скрининг для выявления узла цели, которые могут быть использованы для повышения онколитического вирус терапии. Чтобы обнаружить узел генов, которые модулируют Мараба вирус oncolysis, онколитического rhabdovirus, в настоящее время проходит испытания в фазе I и II испытаний, мы провели генома общесистемной RNAi экраны через три различных опухолевых клеток линии в двух экземплярах с интерферирующей (короткая вмешательства РНК) Библиотека, ориентация 18,120 генов15. Путь анализ хитов, определены в экранах показал обогащение членов ER (эндоплазматического ретикулума) стресс ответ пути. Мы выбрали 10 хитов в течение этих путей для вторичной проверки с использованием малых интерферирующих РНК с различными таргетинга последовательности от тех из основного экрана. В рамках третичной проверки, мы провели эксперимент спасения с IRE1α (инозит требуя фермента 1 альфа), чтобы подтвердить, что хит на целевом. В пробирке и в vivo тестирование с помощью маленькой молекулы ингибитор IRE1α привели к усовершенствованными онколитического эффективность.
Workenhe и др. 12 также провел геном-RNAi Широкоэкранные с помощью пула лентивирусные индуцируемый (коротких шпильки РНК) библиотека ориентации 16,056 генов для идентификации узла факторов, ограничивающих вирус герпеса человека типа 1 (ВПГ-1) мутантный при посредничестве KM100 oncolysis груди раковые клетки. В основном экране они определили 343 генов нокдаун которые приводят к расширенной цитотоксичность KM100-инфицированных клеток на макет инфицированных клеток; они выбрали 24 этих генов для вторичной проверки. Из 24 генов, 8 гены были подтверждены на вторичный экрана с одним из них является SRSF2 (Серин/аргинин богатые сплайсинга фактор 2), которое впоследствии было подтверждено с помощью генетических спасения эксперимента во время третичного проверки. Группа поехала для выявления ДНК ингибитор топоизомеразы химиотерапевтических, сократить фосфорилирование SRSF2 и показали, что сочетание лечения HSV-1 KM100 с ингибитором привело к расширенной выживания TUBO опухоли подшипник мышей.
В вышеупомянутых исследований последовали аналогичные рабочего процесса. Каждый начал с первичной геном-RNAi Широкоэкранные последовал второй экран выберите количество хитов, определены в основном экране. Последовал третичного проверки исследований, которые включены, подтверждающий, что хит был на цель, выполняя генетических спасти эксперименты в пробирке с конечной проверки, осуществляется путем манипулирования целевого гена продукт в естественных условиях. В этой статье мы сначала предоставить общий протокол для разработки и проверки анализа малых интерферирующих РНК скрининг высокой пропускной способности, которая включает в себя определение условий оптимального трансфекции, количество вируса и длина инфекции. Мы также предлагаем подробный протокол для проведения основного экрана высок объём siRNA, а также общее описание метода для выполнения проверки вторичного экрана и третичного проверки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Разработка и утверждение высок объём siRNA, скрининг пробирного
Примечание: Для всех экспериментов, используйте Hepes амортизированное питательных сред для каждой ячейки строки. Смотрите Рисунок 1 обзор рабочего процесса от пробирного оптимизации высших проверки.
- Определение условий оптимального Трансфекция
- Выберите линии клетки опухоли или идеально несколько опухолевых клеток линии с которой оптимизировать трансфекции условия (например 786-O, NCI-H226, SF268, U373, Овчарско-8, U20S; см. обсуждение для больше о выборе клеточных линий).
- Выберите трансфекции реагента или несколько для тестирования. Это может быть необходимо проверить несколько трансфекции реагентов, как некоторые могут быть более токсичными или эффективным, чем другие в ячейки строки. Кроме того Имейте в виду, что некоторые могут повлиять на вирусной инфекции или может генерировать высокий фоновый сигнал при визуализации.
- Решение о положительных [e. г. siRNA, ориентация ПЛК 1(Polo Like Kinase 1) мРНК, который вызывает гибель клеток] и отрицательные трансфекции элементы управления (например ненацеливания siRNA).
- Выполните обратный трансфекции протокол для конкретного трансфекции реагента, но различаются количество трансфекции реагента (например 0,05, 0,1 и 0,15 0,2 мкл/а) и клеток, заполнение плотности (например 625, 1250, 2500 клеток/хорошо). Включать реплицирует следующих условий: лечить клетки, макет transfected клетки (то есть клетки плюс трансфекции реагент) и клетки transfected с положительной и отрицательной трансфекции управления малых интерферирующих РНК (см. рисунок 2A для образца пластины макет).
- В общем, подготовить 80 Нм разведений каждого siRNA конечная концентрация в колодец из 10 Нм (в зависимости от библиотеки, может потребоваться более высокую концентрацию siRNA). Если не указано иное, разбавляют siRNA с реактивом трансфекции разбавителя. Приготовляют разведения трансфекции реагента.
- Накапайте 5 мкл интерферирующей РНК в хорошо следуют 5 мкл Реагента разреженных transfection. Чтобы облегчить этот шаг, распространять вдоль колонны U-дно 96-луночных пластины, смеси siRNA и разбавителя siRNA самостоятельно (для необработанных и макет transfected клеток). Распространите вдоль второй столбец, разбавленным трансфекции реагента и трансфекции реагент разбавителя самостоятельно (для без лечения клетки).
- С помощью электронные пипетки, накапайте 5 мкл/хорошо содержания первого столбца, содержащего siRNA или siRNA разбавителя в соответствующий скважины пластину 384-ну следуют 5 мкл/хорошо разреженных трансфекции реагента или трансфекции реагент разбавителя от второй столбец.
- Центрифуга пластины на 1026 x г за 1 мин при комнатной температуре и проинкубируйте времени, предписанного для transfection реагента (например 5-20 мин).
- В то время как инкубации пластины, подготовьте суспензий клеток различной плотности. Накапайте 30 мкл суспензии клеток в колодец. Перед укладкой пластин в инкубаторе, пусть сидеть за 45-60 мин при комнатной температуре для единообразного решения клетки19пластины.
Примечание: Если короткий инкубационный период, предписанные для transfection реагента с siRNA, подготовьте суспензий клеток до инкубации. - Проинкубируйте 48-72 ч в зависимости от желаемой длины нокдаун, выбранных на экране.
- Подготовьте фиксации и окраски раствор, состоящий из формальдегида, Hoechst 33342 и PBS (фосфат амортизированное saline) для окончательного концентрация в каждой скважине 4% формальдегида и 5 мкг/мл Hoechst 33342. При необходимости, попробуйте выше (например 7.5 мкг/мл) или низкой концентрации (например 2 мкг/мл) Hoechst, если сигнал слишком слабый или слишком сильным, соответственно.
- Отказаться от 30 мкл фиксации и окраски раствора непосредственно на всех скважинах. Инкубировать пластины для 30 минут при 37 ° C. Хранить пластины при 4 ° C. При использовании не конфокального микроскопа, мыть тарелки с PBS с помощью пластины шайбы; в большинстве случаев Стиральная ненужных при использовании конфокального микроскопа.
- Разработка сценария подсчитать количество ячеек на хорошо.
Примечание: Существует несколько комплекты программного обеспечения доступны для этой цели, и, хотя каждый может иметь различные способы создания скриптов, они все как правило имеют средства идентификации ядер, клетки и регионами, а также расчета интенсивности и Морфологические особенности. При разработке сценария скрининга, важно учитывать время, необходимое для запуска сценария на пластину и возможно включить только самые необходимые измерения для сведения к минимуму время обработки. Например для количественной оценки количества клеток, одно может вычислить районе Хехст за намного выше указанного интенсивности; и поддается распространение вируса, одно может вычислить площадь GFP (Зеленый флуоресцирующий белок) за намного выше указанного интенсивности. «Урезанный вниз» сценарий необходимо будет сравнить с более сложный сценарий чтобы убедиться, что нет необходимой информации теряется. - Анализ результатов для определения условий оптимального трансфекции, которые является объем реагента transfection и клеток, заполнение плотности, что приводит к значительным клеточную смерть (0-30% выживаемость клеток) и минимально токсичны для клеток (например 90-100% выживание клетки). Примечание: Это может занять больше времени, чтобы наблюдать за смерть фенотипа клетки в клеточных линиях с длиной удвоение раз. Смотрите Рисунок 2B и 2 C для представителя результаты. Кроме того убедитесь, что transfected с ненацеливания siRNA клетки являются примерно 90-100% притока в момент фиксации, как позже один хотят заразить клетки, которые находятся в этой confluency.
- Определение оптимального количества вируса и длина инфекции
- Выполните те же шаги обратный трансфекции, как описано выше (см. 1.1.4.1 для 1.1.4.4); Однако, использовать только оптимальной трансфекции условия (см. 1.1.8) (например для 786-O клетки: 1500 клеток/Ну и 0,05 мкл/хорошо RNAiMAX) и, Кроме того, включать дополнительных скважин, чтобы быть заражены вирусом [например скважин с необработанной клетки, макет transfected клеток, клеток transfected ненацеливания siRNA, и клетки transfected с позитивным вируса контроля, если те известны (то есть ориентация хост генов, которые будут препятствовать или улучшают репликации siRNA)].
- Смотрите Рисунок 3A макет пластины образца. Проинкубируйте 48-72 ч.
- Заразить дополнительные вирус скважин с онколитического вирусом, выражая флуоресцентные репортер белок (например GFP) с диапазоном кратности инфекции (MOIs) (например 0,001 до 10; Выбранный диапазон будет зависеть уровень сопротивления или восприимчивость клеток линии.). Включать неинфицированных Уэллс также. Накапайте 40 мкл каждого разведения вирусов за хорошо окончательный объем 80 мкл. Центрифуга для каждой пластины на 400 x г за 30 мин при комнатной температуре.
- Следующие инфекции, изображение клетки живут с высоким содержанием, автоматизированные Микроскоп на регулярной основе (например каждые 4-8 ч). Смотрите рисунок 3B и 3 C.
- Разработать сценарий для количественной оценки распространения вируса (например , GFP области за хорошо) (см. 1.1.7). Анализировать изображения и выберите точку времени и МВД, которые позволяют для обнаружения увеличение и сокращение распространения. Обеспечить время точки и MOI падения в пределах диапазона линейной для облегчения обнаружения небольших изменений в распространении. Определить Z-фактор (или Z') на данный момент времени и MOI.
Примечание: По оценкам Z-фактор = 1-3 (σp + σn) / | μp- μn|, где σp — это стандартное отклонение выборки положительных вируса контроля и σn — это стандартное отклонение выборки негативные вируса элементы управления; и μp — это среднее выборочное значение положительных вируса контроля и μn выборочное среднее негативных элементов управления. Оценкам Z-фактор 0,5 - 1,0 считается отличным пробирного и подходит для скрининга20,21. - Подтвердите, что негативные вирус управления siRNA не влияет на репликацию вируса, сравнивая его макет transfected и неочищенных скважин. Часто бывает необходимо проверить несколько негативный контроль как некоторые негативные siRNA, что элементы управления могут повлиять на репликацию вируса.
- Выполните те же шаги обратный трансфекции, как описано выше (см. 1.1.4.1 для 1.1.4.4); Однако, использовать только оптимальной трансфекции условия (см. 1.1.8) (например для 786-O клетки: 1500 клеток/Ну и 0,05 мкл/хорошо RNAiMAX) и, Кроме того, включать дополнительных скважин, чтобы быть заражены вирусом [например скважин с необработанной клетки, макет transfected клеток, клеток transfected ненацеливания siRNA, и клетки transfected с позитивным вируса контроля, если те известны (то есть ориентация хост генов, которые будут препятствовать или улучшают репликации siRNA)].
- Окончательное подтверждение высокопроизводительного скрининга пробирного
- Повторите шаги 1.2.1 и 1.2.2 выше, но только этот время заразить клетки с оптимальной MOI. Вместо живых изображений, исправить и пятна пластины (как описано в 1.1.5 и 1.1.6) в оптимальный момент времени (см. 1.2.4).
- Изображение пластину. Анализировать результаты, используя тот же сценарий, который будет использоваться для экрана (см. 1.1.7 и 1.2.4). Подтвердите трансфекции условия (то есть хороший нокдаун в скважинах transfected с позитивным трансфекции управления и минимальная токсичность в скважинах transfected с отрицательным трансфекции управления). Оценить Z-фактора для определения надежности анализа (см. 1.2.4).
- Дальнейшие испытания и соображения для проведения высокопроизводительного скрининга
- Проверьте на прочность пластин микротитровальных, как некоторые плиты могут треснуть во время центрифугирования, особенно когда крышки хранятся на и несколько пластин центрифугировали одновременно. Чтобы уменьшить крекинга, центрифуга без крышки (при условии пластины имеют пломбы), или уменьшить количество пластин, центрифугируют в ведро.
- Тест стабильности смеси реагентов трансфекции с течением времени. Как только трансфекции реагент добавляется к пластинам, может быть значительная задержка перед добавлением клеток; Таким образом важно знать, период времени, для которого будет действовать трансфекции реагент микс. Для экрана это может быть необходимо подготовить клетки до добавления смеси реагентов трансфекции пластины.
- Подготовка для использования жидкого мыла. Определить объемы требуется обойтись трансфекции реагента, клетки, вирус и исправить, принимая во внимание объем, что держит трубы, объем проиграл предварительного дозирования (если устройство имеет эту возможность) и остаточный объем в бутылки, используемые для дозирования.
- Установка и тестирование программы, которые будут использоваться для дозирования реагента трансфекции, клетки и вирус. Чтобы свести к минимуму потери трансфекции реагента, предел, если это возможно, количество предварительно распределяет. Разработать протокол для калибровки жидкого мыла и тестирования его точность и повторяемость.
- Подготовить для дозирования сыпучих трансфекции реагента, клеток и вирус
- Сначала определить количество пластин для обработки в одной партии, учитывая количество пластин клеток, которые реально могут быть trypsinized одновременно, количество микротитровальных пластин, которые могут быть одновременно, центрифугировали продолжительность времени, необходимого для обработки одной партии пластины с жидкого мыла, а также время, необходимое для обработки изображений. Примечание: Как правило, обработка приблизительно 30 пластин одновременно является вполне осуществимым и обработки 3 пакетов пластин является управляемым в один день.
- Эмпирически Проверьте объем трансфекции реагентов, необходимых для обработки одного пакета пластин. Проверьте, что этот объем является адекватной, дозирования 5 мкл дистиллированной воды несколько раз на одной тарелке эквивалентное количество раз, которые будут необходимы для обработки одного пакета.
- Чтобы обеспечить равномерное распределение клеток, оцените время, необходимое для обойтись клетки через один пакет пластин. Подготовить флакон, содержащий количество клеток, необходимых для выпечки и отказаться от клетки в несколько столбцов листа, в то время, регулярные промежутки времени в течение же это займет отказаться через пакет пластин. Проверьте, как часто будет необходимо смешать клетки поддерживать равномерное распределение клеток.
- Чтобы обеспечить равномерное распределение вируса, повторите ту же процедуру, как и выше (см. 1.4.4.3), но на этот раз дозирования вирус на вырожденная скважин. Если вирус не распределяется равномерно, рассмотреть вопрос о подготовке вируса в конические трубы и vortexing каждой трубы до отказа.
- Отслеживайте рост клеток, чтобы определить сроки для выращивания достаточно клетки для экрана. Кроме того определите среднее количество клеток, которые могут быть собраны за тарелку клеток, растущих в фазе журнала для того, чтобы иметь возможность оценить число необходимых для экрана.
- Заключительная подготовка шаги для высокопроизводительного скрининга
- До одного месяца до начала отбора, определите все материалы, необходимые для экрана. Закажите любые необходимые реагенты (см. материалы). Обеспечить необходимое количество вируса с стороны (желательно, используйте тот же запас, который был использован во время оптимизации.).
- Две недели до начала отбора, оттепель и расти клеток, необходимых для экрана. Обеспечьте наличие центрифуги и центрифуги квадратных сегментов.
- В течение недели до начала отбора, подготовить СМИ бутылки для обратного transfection и инфекции, запас 70% этанола, 2 X трансфекции реагент разбавителя (например 2 X Opti-MEM), если необходимо (например если библиотека siRNA растворяется в RNase-free воды, один будет хотите использовать 2 X для transfect клеток) и аликвоты вируса (по одному в пакете пластин). Проверьте состояние клеток.
- Подготовить раствор Hoechst 33342 пятна (например 5 мг/мл). Подготовьте тарелку баланс, если один будет необходимо для центрифугирования.
- Убедитесь, что пластины шайба находится в хорошем рабочем состоянии, если он будет использоваться. Убедитесь, что жидкого мыла правильно откалиброван и дозирования, аккуратно и точно. Кроме того убедитесь, что программы правильно установленные для жидкого мыла.
2. проведение первичного высокая пропускная способность экрана
Примечание: Перед началом RNAi экран, микротитровальных плиты (например , 384-ну пластины) нужно выстроились с библиотекой siRNA и проверки элементов управления. Следующие шаги лучше всего проводятся двумя лицами с одним человеком (т.е. человек A) прежде всего отвечает за дозирования реагента transfection и клетки через пластины и второе лицо (т.е. лицо B) отвечает за Центрифугирование пластины непосредственно перед transfection и для подготовки клетки. В скобках включены некоторые особенности для обработки одной партии 33 пластин (т.е. половина библиотеки) с линией клеток 786-O.
- Подготовка для обратного Трансфекция
- Человек A: место достаточно средств массовой информации, трипсина и PBS необходимо обработать один пакет пластин в ванну воды 37 ° C. Дополнительно: Trypsinize плиты клеток и подсчитать количество ячеек на пластине с целью дать оценку реального времени количество пластин, необходимых в пакете.
- Получить пакет пластин (например 33 плиты) из морозильника и подождите 20-30 мин, чтобы позволить пластины для размораживания. В то время как пластины размораживания, продолжайте с помощью следующих шагов.
- Человек A: накапайте в 50 мл конические трубы количество трансфекции реагент разбавителя необходимые для обработки одной партии плит (например 2 x 37.125 мл) и поместите их в ванну воды 37 ° C. Заполните две бутылки с 70% этанола (например , 250-500 мл бутылки). Заполните две 50 мл конические трубы с PBS и один с дистиллированной водой.
- Человек A: погружайте жидкого мыла, трубы в бутылку на 70% спирте. Если все советы не будет использоваться для дозирования трансфекции реагент (например если не используются внешние скважин пластины), отсоедините ненужные трубы сначала. Поместите кусок липкой лентой вокруг трубки для обозначения точки, ниже которого можно считать стерильные трубы. Премьер с приблизительно 25 мл. Наливайте в бутылку, чтобы заменить потерянные объем дополнительных этанола. Дайте трубке сидеть в этаноле менее 5 мин.
- Человек B: подготовка к trypsinize клеток. Спрей культуры ткани (TC) капот с 70% этиловом спирте. Спрей и разместить необходимые пипец, советы, бутылки и отцентрифугировать трубы для подготовки клетки в капюшоне (см. 2.2.1.1 и 2.2.1.2). Центрифуга запечатанном пластины в наборах в 1026 x g на 2 мин при комнатной температуре. Удаление крышки из пластин в TC капот, если ранее определено, что пластины может трещины во время центрифугирования, когда крышки хранятся на (см. 1.4.1).
- Человек A: удалите печатей из пластин. До, во время или после уплотнения были удалены (в зависимости от длины инкубации требуется), накапайте необходимое количество трансфекции реагента (например 375 мкл/трубка для конечной концентрации 0,05 мкл RNAiMAX/скважины) в конические трубы содержащие подогретым трансфекции реагент растворителя (например 37.125/мл).
- Смешайте закупорить вверх и вниз по 10 раз. Инкубации при комнатной температуре, для времени, предписанного для transfection реагент используется (например 0-10 мин).
- Обратный Трансфекция
- У человека B выполните следующие задачи.
- Начните trypsinizing клетки (например 3 плиты 786-O клеток). Аспирационная СМИ от каждой плиты. Промойте с 9 мл ФСБ. Накапайте 3 мл трипсина на пластину. Инкубируйте при 37 ° C для приблизительно 5 минут Ресуспензируйте клетки с 22 мл средств массовой информации. Накапайте вверх и вниз по 10 раз.
- Объедините суспензию клеток от каждой плиты культуры ткани в стерильные бутылки. Перемешать суспензию клеток путем инвертирования. Накапайте 1 мл аликвоты суспензию клеток в два отдельных отцентрифугировать трубы. Удалить образец из пробирки отцентрифугировать и подсчитать количество ячеек. Рассчитать объем суспензии клеток, необходимых для плотности требуется (например 1500 клеток/хорошо) и подготовить достаточно разбавленный ячейки подвеска (например 500 мл) отказаться через один пакет пластин.
- Есть человек A выполните следующие задачи параллельно в лицо.
- Пустые дозатор жидкого трубки этанола. Премьер трубки с приблизительно 25 мл PBS, а затем очистить трубку. Будьте внимательны при обработке труб для обеспечения того, чтобы секции труб ниже малярный скотч, который будет погружен в трансфекции реагента и позднее в суспензию клеток остается стерильной. Отделил пластин, которые можно безопасно сделать с одной конические трубы трансфекции раствора реагента.
- Пипетки решений реагент transfection вверх и вниз в 10 раз. Премьер трубки с раствора реагента transfection. Чтобы свести к минимуму потери трансфекции реагента, премьер с достаточно решение едва очистить советы. Выберите правильную программу на жидкого мыла и распределить 5 мкл Реагента трансфекции за хорошо.
Предупреждение: Внимательно контролировать уровень трансфекции реагента таким образом, чтобы он пополняется, прежде чем она закончится. Завершение пластин, которые являются набор отдельно следует обеспечивать сигнал, чтобы добавить больше раствора реагента transfection. - Центрифуга пластины на 1026 x г за 1 мин при комнатной температуре. На этот раз крышки будет, поэтому он может быть необходимо для центрифуг меньше пластин одновременно для предотвращения растрескивания (например 2 пластины на ведро). Инкубируйте времени, предписанного для transfection реагент используются пластины при комнатной температуре (например 10-20 мин).
- Во время инкубации пустые трубы трансфекции раствора реагента и поместите его в полной 50 мл конические трубка, содержащая PBS. Промойте трубы с приблизительно 25 мл PBS, грунтовки и опорожнения.
- Если больше советов будет использоваться для выдачи клетки не были использованы для дозирования реагента трансфекции, повторно присоедините неиспользуемых труб и повторно стерилизовать все трубки с 70% этанол до промывки труб с PBS (см. 2.1.2.2).
- Смешайте флакон, содержащий суспензию клеток после того, как он был подготовлен. Место труб в суспензии клеток и премьер-достаточно, чтобы видеть, правильно дозирования каждый отзыв. Отказаться от 30 мкл на хорошо суспензию клеток во все пластины. При необходимости, перемешать суспензию клеток на регулярной основе, чтобы избежать урегулирования.
Предупреждение: Иногда каплями суспензии, содержащие средства массовой информации могут придерживаться стороны советы. При этом наблюдается, аспирационная как можно скорее или протереть безворсовой ткани, облили 70% этиловом спирте. - Пустых труб суспензию клеток. Промойте трубы с приблизительно 25 мл PBS, следуют примерно 50 мл дистиллированной воды.
- Разрешить пластины сидеть за 45-60 мин с момента посева при комнатной температуре до возвращения пластины в инкубаторе ячейки. Инкубировать пластины в ненарушенных инкубатора для желаемой длины гена глушителей (например 48 ч) (см. 1.1.4.5).
- У человека B выполните следующие задачи.
- Инфекции
- Чтобы сэкономить время, за день до заражение клетки, накапайте в стерильные бутылки точное количество средств массовой информации, необходимых для заражения каждого пакета пластин, включая средства массовой информации для неинфицированных скважин (например 2 x 350 мл и 2 x 50 мл для 33 пластин). Кроме того проверить жидкого мыла для точности и точности и повторной калибровки при необходимости.
- Теплый СМИ при 37 ° C. Заполните две бутылки с 70% этанол, две 50 мл конические трубы с PBS и один с дистиллированной водой. Убедитесь, что центрифуги при комнатной температуре.
- Стерилизации труб с 70% этиловом спирте и промыть с PBS как описано выше (см. 2.1.2.2 и 2.2.2.1). Трубы, сидя в этаноле, накапайте точный объем вируса требуется в бутылку, содержащие СМИ ранее подготовленные для инфекции (см. 2.3.1). Промойте трубы с PBS с 25 мл и потом опустошить.
- Удаление пластины из инкубатора и поместите их в TC Худ. Премьер труб со средствами массовой информации. Отказаться от 40 мкл СМИ в незараженных контроль скважины. Пустые трубы СМИ и промыть 25 мл PBS. (см. 2.2.2.5 осторожность)
- После смешивания вирус, поместите трубки в бутылки, содержащие вирус. Отказаться от 40 мкл вируса через пластины. Центрифуга для пластин для 30 мин при 400 x g при комнатной температуре. Возвращение пластины в инкубаторе. Инкубировать пластин для ранее определяется продолжительность времени (например 24 h) (см. 1.2.4).
- Фиксации и окраски клеток
- Чтобы сэкономить время, за день до фиксации, подготовить бутылку фиксации и окраски раствора содержит формальдегид и PBS (например 179 мл 37% формальдегида и 270 мл PBS для конечной концентрации 4% формальдегида) для каждого пакета пластин, но опустить "Хёхст" пятно. Хранить легковоспламеняющиеся кабинета от света.
- Промойте трубы с 70% этанола и PBS как описано выше (см. 2.1.2.2 и 2.2.2.1). Добавьте необходимый объем Хехст (например. 2,5 мл 5 мг/мл Hoechst для конечной концентрации в скважине 7.5 мкг/мл) для фиксации и окраски раствора и перемешать.
- Отказаться от 30 мкл фиксации и окраски раствора через все пластины. Поместите пластины в инкубаторе для 30 мин. После инкубации применять пломбы на тарелки и хранить пластины на 4° C, защищать от света. Мыть тарелки, при необходимости (см. 1.1.6).
- Обработка изображений и анализ изображений
- Изображения пластины с помощью автоматизированной, высоким содержанием микроскопа. Использование ранее определенных параметров, но сначала проверить параметры, чтобы убедиться, что никакие корректировки должны быть сделаны.
- Количественно GFP (или других флуоресцентные репортер) области и Hoechst за хорошо разработанной ранее скриптом (см. 1.3.2). Тестовый сценарий с горсть пластины, чтобы определить, если любые незначительные изменения должны быть сделаны до пакета анализа всех номерных знаков.
- Идентифицировать хитов. Примечание: Надежный метод Z-Оценка/MAD (среднее абсолютное отклонение) является метод, который часто используется в этом направлении. Как правило, десятки > 2 или < -2 установлены как обрезков. Этот метод лучше всего использовать, когда образцы siRNA случайным образом распределены между пластинами и не, к примеру, сгруппированные по функциям как образцы используются как де-факто негативный контроль. Отфильтровать цитотоксических малые интерферирующие РНК, как это ожидается, будет неспецифически уменьшить вирус распространяется (см. обсуждение для более подробной информации о фильтрации цитотоксических хитов).
3. вторичный экран проверки хитов с библиотекой индуцируемый КИП (RNAi консорциум)
Примечание: Смотрите обсуждение для подробной информации о выборе хиты для вторичной проверки и возможные технологии растеризации. Если для вторичной проверки выбран siRNA технологии, же развития и проверки протокол assay может использоваться как был использован для начального экрана (см. 1).
- Получите пользовательскую библиотеку индуцируемый КИП ориентации кандидат генов интерес как глицерин запасов.
- Подготовьте трансфекции качества плазмида ДНК из глицерина запасов. Примечание: Подробный протокол (т.е. «Индуцируемый/sgRNA/ORF глицерина и подготовку плазмида ДНК») можно найти здесь: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
- Производят lentiviruses, выражая индуцируемый ориентации генов интерес с ДНК плазмиды. Примечание: Подробный протокол для производства Лентивирусы в 96-луночных плиты [т.е. «индуцируемый/sgRNA/ORF высокой пропускной способности вирусный производства (96 хорошо)»] можно найти здесь: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
- Заразить клетки с lentiviruses. Примечание: Подробный протокол для лентивирусные инфекции в 96-луночных пластины (т.е. «Лентивирусные инфекции») доступна онлайн на http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/dir/download?dirpath=protocols/production&filename=TRC%20viral % 20infection%20200909.pdf.
- Заразить клетки с онколитического вирусом либо следующий выбор puromycin (см. 3.4 для выбора протокола) успешно transduced клеток или сразу после трансдукции (без puromycin выбор). Чтобы определить оптимальное количество вируса и длина инкубации с вирусом, используйте тот же метод, используемый для начального экрана.
4. Высшее проверка
Примечание: Цель третичной проверки является главным образом подтвердить, что хит на цели, конкретные, опухоли и повышает эффективность в vivo. Один можно также проверить ли он модулирует распространение по всему спектру линий клетки опухоли
-
Подтверждение, что нокдаун гена кандидата на цель
- Сначала убедитесь, что существует корреляция между фенотипа и сайленсинга генов. Использовать же assay, который был разработан для экрана или изменить его формат 6-ну оценить повышение или торможении распространения в более крупном формате. Провести время курс с клетками transfected с siRNA, ориентация gene(s) интереса плюс и минус вирус.
- Изображение скважин, содержащие инфицированные вирусом клетки и собирать lysates клетки от неинфицированных скважин через регулярные интервалы времени. Определите, есть ли взаимосвязь между сайленсингом генов и улучшение или торможении распространения. Оценка количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР) и/или Западный blotting сайленсинга генов.
- Выполняют генетических спасения эксперимент, чтобы подтвердить, что хит на цель. Примечание: В эксперименте типичной спасения, кандидат ген является постучал вниз с RNAi в то время, как в то же время клетки являются transfected временно с устойчивостью RNAi cDNA (например , ortholog гена) выражения гена кандидата для определения ли фенотип гена восстановлен или «спас». Стабильных клеточных линий, экспрессирующих RNAi устойчивостью cDNA кандидат гена интереса также могут быть использованы.
- Кроме того, вместо того, чтобы генетические спасения эксперимент, использовать несколько ортогональных анализов для подтверждения, что хит на целевой [например определить ли же фенотип получается после целевого гена с несколькими малые интерферирующие РНК, на нокдаун целевых генов в несколько стабильных клеточных линий, выражая индуцируемый против целевых генов и после плей-офф с ТРИФОСФАТЫ (Clustered регулярно interspaced короткие палиндром повтор)-Cas9 технологии в несколько клеточных линий.].
-
Подтверждение, что хит опухоль – специфичные и модулирует охватывают широкий спектр линий клетки опухоли
- Провести аналогичные пробирного как 4.1.1, но с нормальных клеток, а также с другими линиями опухолевых клеток.
-
Подтверждение, что манипуляции кандидат гена повышает эффективность в естественных условиях
Примечание: Ниже описаны три возможных методов для манипулирования ген целевые в естественных условиях.- Найти препарат для манипулирования генов цели. Если есть препарат как ингибитор малые молекулы, ориентированном же ген, применять его с онколитического вирусов vivo в. Важно определить оптимальные сроки для управляющей наркотиков.
- Инженер, вирус, чтобы препятствовать или overexpress целевых генов в зависимости ли один из желания препятствовать или расширения целевых генов. Для подавления гена, инженер онколитического вирус выразить доминирующей негативные гена или Экспресс индуцируемый ориентации ген. Для повышения экспрессии гена целевого, клонировать онколитического вирус с трансген, экспрессирующих ген.
- Инженер клеточных линий с геном разобранном или постучал out с помощью индуцируемый или ТРИФОСФАТЫ-Cas9 технологии, соответственно. Имплантат линии инженерии клетки и клетки одичал тип линии в естественных условиях и впоследствии заразить вирусом онколитического. Примечание: Этот метод служит доказательством принципа и может помочь определить инвестиции дополнительное время и ресурсы для разработки препарата для манипулирования генов в естественных условиях, например, будет ли целесообразным.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1представлен обзор рабочего процесса для определения целей хост для повышения онколитического вирус терапии.
Как показано на рисунке 1, важнейшим первым шагом к проведению RNAi экран высокой пропускной способности является пробирного развития. Рисунок 2A предоставляет макет образца пластины для оптимизации assay transfection. Рисунок 2B состоит из представителя изображения ожидаемых результатов, и Рисунок 2 c является представительный участок ожидаемых результатов. После siRNA нокдаун ПЛК-1, ген, который вызывает гибель клеток и может использоваться как позитивный элемент управления для наблюдения за нокдаун эффективность siRNA, можно было бы ожидать выживание клетки между 0-30%, если только линии клеток имеет долгую удвоение время в этом случае он будет принимать l Онгер соблюдать фенотип смерти клетки. Ненацеливания siRNA также должно быть минимально токсичны для клеток с аналогичные относительная выживаемость, неочищенные клеток.
Еще одним ключевым элементом анализа развития необходимо определить МВД в котором заразить клетки и продолжительность времени для инфекции. На рисунке 3A предоставляет макет пластины образца для определения количества вируса и длина инкубации с вирусом. Рисунок 3B изображает результаты курса живой время-786-O клеток, инфицированных vvDD-eGFP (онколитического vaccinia вируса, выражая расширенной GFP с Тимидинкиназа и фактор роста Vaccinia гены удалены) в различных MOIs. Представителя изображения клеток, инфицированных vvDD-eGFP в MOI 0,05 показаны на рисунке отождествлены. Основываясь на результатах диаграмме на рисунке 3B, одно может выбрать MOI 0,05 и длиной инфекции 21 h как это позволит для обнаружения увеличение и сокращение распространения, как это время точка находится в пределах диапазона линейной и оценкам Z-фактор в этом ti Me точка — 0,6 для когорты, которые увеличивают и когорты, которые уменьшают распространение. В рамках проверки этот assay один хотите исправить клетки на этом MOI и момент времени и рассчитать коэффициент Z.
После протокол описал мы провели генома общесистемной RNAi экраны через три различных опухолевых клеток линии (например Овчарско-8, U373, NCI-H226) в двух экземплярах с библиотекой siRNA, ориентация 18,120 генов15. С помощью метода ума, мы определили 1008 хитов общие для по крайней мере 2 из 3 рак клеточных линий (рис. 4A). Путь анализ хитов, определены в экранах показал обогащение членов УНР (ответ развернул белка) и ERAD (эндоплазматического ретикулума связанные белком деградации) пути (рис. 4A). Мы выбрали 10 хитов в течение этих путей для вторичной проверки с использованием малых интерферирующих РНК с различными таргетинга последовательности от тех из основного экрана (рис. 4B). В рамках третичной проверки, мы провели генетических спасения эксперимент с IRE1α и ATF6α (активация транскрипции фактор 6 альфа) чтобы убедиться, что эти удары были на цель (рис. 4 c).
Рисунок 1: схема рабочего процесса для идентификации узла цели повышения терапии вирус онколитического. Первый шаг заключается в разработке и проверке assay для высокопроизводительного скрининга RNAi, который включает в себя оптимизацию трансфекции условия для введения малых интерферирующих РНК в клетки, определение оптимального количества вируса (т.е. МВД), чтобы заразить клетки с и Длина инкубации с вирусом. Вторым шагом является проведение генома широкий экран высокой пропускной способности. Библиотеку siRNA, ориентация генов через весь геном выстроились на микротитровальных пластины. Клетки, затем transfected реверс с библиотекой siRNA. После 48-72 ч инкубационный период для подавления экспрессии гена клетки заражены оптимальное количество вируса. После оптимальной длины инкубации с вирусом клетки фиксированной и витражи и впоследствии образы с высоким содержанием микроскопа. Последующие изображения и анализ данных поможет выявить гены, которые значительно модулировать репликации вируса, которые называются «хитов». Вторичной проверки экрана выполняется выбор хиты от начального экрана, обычно с использованием малых интерферирующих РНК или индуцируемый с регионами различных семян. Третичный проверки эксперименты для подтверждения, что показов на цель, опухоль конкретные и повысить эффективность в естественных условиях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: оптимизация трансфекции условия для высокопроизводительного assay скрининга RNAi. (A) образец расположения пластины для оптимизации условий трансфекции с двух различных клеточных линий. (B) представитель изображения клеток (1500 клеток/хорошо) 786-O витражи с Hoechst 33342 после 72 ч инкубации с трансфекции реагент разбавителя только (т.е. не лечить), transfection реагента и разбавителя (т.е. МОК transfected), с ненацеливания siRNA и siRNA, ориентация ПЛК-1. (C) представитель результаты от трансфекции оптимизации эксперимент показаны 22% выживаемости клеток transfected с ПЛК-1 малых интерферирующих РНК (n = 24) и 94% выживаемости клеток transfected с ненацеливания siRNA (n = 8). Планки погрешностей = ± SD, стандартное отклонение; масштаб баров = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: определение количества вируса и длина инкубации с вирусом для высокой пропускной способности assay скрининга RNAi. (A) макет образца пластины для оптимизации количества вируса и длина инкубации с вирусом. Колонки 1 и 24 содержат трансфекции элементов управления и которые оставлены неинфицированных. Столбцы 2 и 23 содержат необработанные клетки, макет transfected клеток и клеток transfected с положительной и отрицательной вирус контроля всех инфицированных диапазон MOIs, начиная с ни один вирус в колонках 2 и 3. (B) 786-O клетки были обратный transfected с ненацеливания siRNA и инкубировали в течение 48 часов. Впоследствии они были заражены vvDD ГФП в MOIs указал и образы каждые 8 ч, начиная в 5 часов после инфекции (ХПИ). Средняя площадь GFP в колодец (± SD) была рассчитана для каждой точки времени (n = 12) и нанесены на график. Z-коэффициент, рассчитываемый между точками A и B — 0,6 и Z-коэффициент, рассчитываемый между пунктами B и C — 0,6. (C) указал представитель живут образы хорошо инфицированных MOI 0,05 в моменты времени. 10 крат; 9 полей/скважины; масштаб баров = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: геном широкий экран идентифицирует ER стресс ответ блокаду как мощным сенсибилизатор Rhabdovirus опосредованной Oncolysis. (A) диаграммы Венна, изложением количество перекрывающихся хитов высок объём RNAi экраны в 3 линии клетки опухоли и таблицы (+, синтетические летально;-, нет взаимодействия) и схема (хиты в красный) иллюстрирующие основные хиты в рамках УПО и ERAD пути. (B) ЕС50 смены (черные полосы, левой оси y) были определены для U373 клетках, обработанных вирусом Мараба (48 часов), после обработки с siRNA (72 h) ориентации серии хитов УНР/ERAD от экрана. Относительное выражение mRNA для каждого гена, после siRNA нокдаун (72 h) изображен в белом (справа y ось). (C) анализов жизнеспособность клеток были проведены 48 ч после инфицирования вирусом Мараба, в U373 ectopically выражая клетки мыши ATF6α (или управления GFP) ± siRNA ориентации человека ATF6α (или ориентации [NT] управления; левая панель) или человеческого XBP1(s) (или элемент управления ) ± siRNA ориентации человека IRE1α (или управлять; правой панели). Показываются западной помарки, демонстрируя сайленсинга генов и экспрессии генов внематочной. Сдвигает ЕС50 = сдвиг в дозе вируса требуется убить 50% клеток; Планки погрешностей = болезни; XBP1(s) = X-box белок 1 (сращивания); В пункте (B), были выполнены односторонней ANOVAs следуют Бонферрони post hoc множественные сравнения теста для получения значения p; В (C) Студенческая t тесты были проведены для получения значения p; * p < 0,05; #p < 0,05. (Эта цифра была изменена от Махони и др., 201115). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы представляем собой протокол для применения высокопроизводительного скрининга RNAi для идентификации узла цели, которые можно манипулировать для повышения онколитического вирус терапии. Это была успешно протестирована с онколитического Мараба вирус и онколитического vaccinia вируса, но, как отмечалось, она может быть адаптирована для использования с другими онколитического вирусы или другие вирусы обычно для идентификации узла генов, которые модулируют репликации вируса. Протокол проверки также предназначена для идентификации генов, которые увеличивают или уменьшают распространение, но она может быть легко модифицирован для других показаний. Наши экраны с вирусом Мараба, например, были разработаны для идентификации генов, модулирует oncolysis, используя простой жизненно краска на основе резазурина пробирного оценка жизнеспособности клеток (см. рис. 4)15. В этих экранов, после инкубации с вирусом, вместо фиксации клетки с формальдегидом и пятнать с Hoechst, мы обойтись резазурина красителя в каждой скважине (конечная концентрация 20 мкг/мл), и после 6 ч инкубации, мы измерили поглощения (573 Нм) с пластина читателя. Мы могли бы также использовать номер ячейки, основанные на Hoechst окрашивание как индикация. В то время как с помощью суррогатной репортер для мониторинга репликации вируса нет необходимости в этом экране, живой вирус с репортером белка, особенно флуоресцентный белок облегчения оптимизации экран как одно можно например, монитор репликации вируса; Кроме того вирус с протеином репортер менее обременительным и дорогостоящим, чем с использованием антител пятно для вирусных антигенов, но это возможно для экрана без одного. Кроме того можно было бы сделать даже дальнейшие изменения assay исследовать хост факторы, которые влияют на инфективности, размер пакета и даже более подробную суб фенотипов как иммунологический клеточной смерти. В каждом случае один будет следовать подобный протокол assay развития, скрининг стратегии и методы вторичной и третичной проверки.
В протоколе мы предлагаем, оптимизации условий трансфекции идеально с несколькими линиями опухолевых клеток. Существует по меньшей мере две причины для оптимизации с несколько клеточных линий. Одной из причин является, что не каждая линия клетки поддается высокопроизводительного скрининга, как некоторые могут быть трудно transfect или не могут придерживаться хорошо, но ключевой причиной является возможность скрининга с несколько клеточных линий для того, чтобы избежать смещения внутренние ячейки. Выбор линий клеток во многом зависит от своих целей. Один может предпочесть, чтобы сосредоточиться на конкретной рака типа или выбрать типы разрозненных рака для охвата более широкого спектра. Кроме того один, возможно, пожелает сосредоточиться на линии клетки опухоли, которые устойчивы к идентификации узла факторов, которые можно манипулировать, чтобы сделать линии клетки опухоли, менее устойчивы к онколитического инфекции вирус.
Помимо выбора клеточных линий выделение вируса положительных и отрицательных элементов управления является важным фактором для любого экрана. В некоторых случаях вирус гены, которые требуются для или ограничить репликации не может быть известно или, если они известны, они могут быть специфичные для ячейки. Следовательно один все еще используя можно определить приблизительное надежности и динамический диапазон assay суррогатные элементы управления. Например можно было бы использовать неинфицированных клетки или клетки, зараженные с низкой мои как суррогат положительный контроль для выявления генов, которые уменьшают распространение по бросовым. Для идентификации генов, которые улучшают спреда по бросовым, можно заразить клетки с серией разрежения вируса и использовать скважин с максимальный сигнал как положительный контроль суррогатной.
Выбор хитов для проверки вторичного экрана и тип технологии на работу является еще одним вопросом, который требует тщательного обсуждения. Кандидаты обычно выбирается для проверки вторичного экрана на основе величины хит, на ли они значительно модулировать распространение в нескольких линий клетки рака (если первичный экраны были проведены в нескольких клеточных линий) и на биологических интереса. Биоинформатика инструменты, такие как Дэвид22,23, пантера24, строка25 и26 PINdb может помочь изолировать пути и хиты биологического интереса. Мерсер и др. 8 описывают использование программного обеспечения для анализа открытым исходным кодом изображения и также сделали доступными алгоритм, который они разработали для визуализации и анализа хитов. Одним из факторов учитывать при интерпретации результатов что сайленсинга генов может иметь различные последствия в зависимости от стадии вирус жизненного цикла, который ведется расследование. Например, вполне возможно, что нокдаун гена в начале жизненного цикла может препятствовать репликации вируса, в то время как сногсшибательно на более позднем этапе может увеличить репликации. Часто вторичные экраны проводятся с siRNA от разных поставщиков с регионами различных семян с несколькими малые интерферирующие РНК на ген. Однако взаимодополняющих технологий, ориентация кандидат гены могут быть использованы как ТРИФОСФАТЫ-Cas9 или Лентивирусы векторов, выражая индуцируемый.
Метод анализа является также важным фактором. Мы предлагаем здесь, используя надежные Z-скор или27 MAD20,с предложил обрезков для хит вызов > 2 или < -2. Обрезков может быть увеличивается или уменьшается в зависимости от ли основное внимание уделяется ликвидации ложных срабатываний или захвата больше ложных негативов. Например в недавней экран высокой пропускной способностью с vaccinia вируса9, Нижняя отсечения была установлена в -1,5 (без верхнего обрезков были описаны как основное внимание уделялось идентификации генов, которые снижение спреда по бросовым). Есть также другие методы, которые могут быть использованы, включая z скор, SSMD (строго стандартизированной разницы средних) и B Оценка20,28,29,30. Курганы et al.31 по сравнению списки хит порожденных сумма ранга, MAD, z счет и SSMD и обнаружил, что каждый метод анализа привели в различных списках хит. В целом, существует не идеальный метод или отсечения. В конечном счете вторичный экран проверки и третичный проверки исследования подтвердят истинный хитов.
Необходимо также учитывать метод фильтрации цитотоксических хитов. Одним из способов является проведение первичного экраны в параллельных плюс или минус вирус. Это позволяет обнаружить малые интерферирующие РНК, цитотоксических на их собственных. Это был наш подход в наших Мараба вирус экраны15; Однако это часто не практично. Возможно более практический метод, являясь надежной, состоит в выяснении хитов, которые являются цитотоксические как часть среднего экран проверки, особенно если в фокус заключается в выявлении хитов уменьшение репликации по бросовым. Например, в основной экран весь геном с вирусом миксома Тефери и др. 11 определены 1588 малые интерферирующие РНК, которые снизились репликации вируса по бросовым. Чтобы отфильтровать цитотоксических малые интерферирующие РНК, они провели вторичный цитотоксичность экран с эти малые интерферирующие РНК; Они измерили клеток жизнеспособности 72 ч после трансфекции используя assay жизнеспособность на основе резазурина клетки. Цитотоксические малые интерферирующие РНК были определены на основании Z-счет ≤-1.96. Другой подход заключается в том, чтобы просто отфильтровать цитотоксических малые интерферирующие РНК от первичного скрининга данные, основанные на уменьшение количества клеток на определенный процент, например, > 50% сокращение как Сиван et al. 9, или на основании конкретного Оценка как Lee et al. 14; в своем исследовании принимающей факторов, необходимых для репликации вируса везикулярного стоматита они исключены siRNA хитов, что жизнеспособность клеток уменьшено > 3.0 стандартных отклонений от среднего значения. Среднее количество клеток была определена на основании Hoechst пятнать клеточных ядер и, хотя не оговорено, среднее казалось бы было рассчитано на основе за пластины, как становится ясно, что означает GFP сигнал был рассчитывается на основе за тарелку.
Ограничение любого экрана RNAi высок объём является частым большое количество ложных срабатываний и негативы, которые могут возникнуть вследствие пробирного дизайн, используемой технологии или путем систематической ошибки. Например белок может существенно повлиять на репликацию вируса, но время выбран для подавления экспрессии гена может быть слишком коротким, учитывая half-life белка для обнаружения его эффект, ведет к ложноотрицательные силу пробирного дизайн. Хорошо известно, что неполные сногсшибательно и пробить эффекты малых интерферирующих РНК технология также может ввести ложных срабатываний и негативы. Систематические ошибки, такие как эффект edge32, может генерировать заблуждение результаты, как хорошо. Здесь сигнал в наружной скважинах пластины могут быть систематически выше или ниже, чем остальная часть плиты из-за испарения. Есть стратегии решения проблем, некоторые из этих вопросов, включая, например: снижение концентрации малых интерферирующих РНК, чтобы уменьшить последствия мимо33, перенастройка пластины макеты для заполнения внешней скважин с СМИ для смягчения эффекта края или используя вычислительные методы, которые были разработаны для выявления и противодействия систематические ошибки, такие как эффект края32,34,35. Общий способ иметь дело с ложных срабатываний является провести вторичный экран после начального экрана. Как способ борьбы с ложными негативов одно может расслабиться отсечения для хит призвание и включают потенциальных ложных негативы для вторичного скрининга. Это, конечно, не будет захватить ложных негативов, которые значительно ниже минимально приемлемого уровня. Основной экран должна также проводиться в двух экземплярах или экземплярах ограничить ложные результаты. В конечном счете независимо от того, какие стратегии используются, не высок объём экран будет исчерпывающе определить все верно хитов, но он может предоставить клад данных, из которых один может добывать некоторые ценные хитов, которые могут быть капитализированы на.
В этом протоколе мы описали использование выстроились siRNA и индуцируемый технологии, хотя другой альтернативой является использование пула индуцируемый и ТРИФОСФАТЫ-Cas9 библиотек. Пула индуцируемый библиотека использовалась в Workenhe и др. 12 исследование, изложенные во введении. Объединенные технологии ТРИФОСФАТЫ-Cas9 были использованы для проведения геном масштаба экраны для идентификации узла факторы, необходимые для репликации вирусов, таких как вирус36Зика, вирус37,38Западного Нила, вирус денге39 и гепатит C вирус39. Преимущество использования пула библиотек является, что они являются менее дорогостоящими для приобретения, не требуют специализированной инфраструктуры (например жидкость, обработка устройства, высоким содержанием Микроскопы и робототехнические оборудования), и они не имеют высокие расходы на эксплуатацию и поддержание этой инфраструктуры, и они требуют меньше расходных материалов. Недостатком является, что типы отсчетов более ограничены. Большинство, если не все объединенные библиотеки хост вирус взаимодействия экранах на сегодняшний день индикация является жизнеспособность клеток или об отсутствии таковых; один не может легко зонд для более сложных фенотипов. Выбор формата зависит от биологических вопрос.
Выдвижения в генетический скрининг технологии в последние несколько десятилетий, что первый включен экраны в бактерий и дрожжей теперь современной геном масштаба экраны в клетках человека открыли двери для обнаружения в различных областях исследований. Эти генетические экраны не только позволили нам ответить на основные биологии, но дали нам ключи для разблокировки идеи в развитие и совершенствование применения инновационных технологий биотерапевтических. Хотя все еще существуют исторические уроки и вызовы преодолевать с этой технологией, на сегодняшний день результаты были захватывающие. Открытий, вероятно, будет еще больше, как роман, скрининг технологии, включая ТРИФОСФАТЫ-Cas9 библиотеки, микрофлюидика и в естественных условиях скрининг технологии продолжают Зрелые.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантов из Онтарио института для исследований рака, Канадский фонд для инноваций, Оттава региональный фонд рака и Терри Фокс научно-исследовательский институт. K.J.A. была поддержана Ванье Канада аспирантов стипендии, Канадский институт медицинских исследований-мастер премию и Онтарио Магистратура стипендии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| siRNA library | GE Dharmacon | G-005005-02 | |
| Corning 384-well plate | Corning | 3985 | |
| Falcon 384-well plate | Becton Dickinson | 353962 | |
| Water | Sigma | W4502 | |
| siGenome SMARTpool PLK1 | GE Dharmacon | M-003290-01 | |
| AllStars Negative Control siRNA | Qiagen | SI03650318 | |
| siGenome Non-targeting siRNA Pool #2 | GE Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| DMEM/HIGH Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30022.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F15051-500ML | |
| HEPES solution (1M) | Sigma | H3535-100ML | |
| Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare Life Sciences | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 2500056 | |
| DPBS/Modified | GE Healthcare Life Sciences | SH30028.02 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778100 | |
| Oligofectamine | Thermo Fisher Scientific | 1225011 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 22600-050 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma | R7017-5G | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H21492 | |
| Formaldehyde (37% by weight) | Fisher Scientific | F79-4 | |
| 500 ml bottles | Corning | 430282 | |
| Adhesive Sealing Film For Microplates | Excel Scientific | 361006007 | |
| Peelable Heat Sealing Foil | Thermo Fisher Scientific | AB-3720 | |
| BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette | Fisher Scientific | 11-120-625 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MicroFlo Select (liquid dispenser) | Fisher Scientific | 11120621 | |
| BioTek Synergy HT plate reader | Biotek | N/A | |
| Opera Imaging and Analysis Instrument | PerkinElmer | HH10000115 | |
| KiNEDx Robotic Arm | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | KX-300-660 | |
| Cytomat 24C Series Automated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 50080227 | |
| JANUS Automated Workstation | PerkinElmer | AJI4M01 | |
| Plate Carousel | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | N/A | |
| Alps 3000 plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-3000 |
References
- Cherry, S. What have RNAi screens taught us about viral-host interactions? Curr. Opin. Microbiol. 12 (4), 446-452 (2009).
- Panda, D., Cherry, S. Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions. Curr. Opin. Virol. 2 (6), 784-792 (2012).
- Houzet, L., Jeang, K. T. Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis. Exp. Biol. Med. 236 (8), 962-967 (2011).
- Friedel, C. C., Haas, J. Virus-host interactomes and global models of virus-infected cells. Trends Microbiol. 19 (10), 501-508 (2011).
- Gao, S., Yang, C., et al. Applications of RNA interference high-throughput screening technology in cancer biology and virology. Protein Cell. 5 (11), 805-815 (2014).
- Kilcher, S., Mercer, J. Next generation approaches to study virus entry and infection. Curr. Opin. Virol. 4, 8-14 (2014).
- Ramage, H., Cherry, S. Virus-Host Interactions: From unbiased genetic screens to function. Annu. Rev. Virol. 2 (1), 497-524 (2015).
- Mercer, J., Snijder, B., et al. RNAi screening reveals proteasome- and Cullin3-dependent stages in vaccinia virus infection. Cell Rep. 2 (4), 1036-1047 (2012).
- Sivan, G., Martin, S. E., et al. Human genome-wide RNAi screen reveals a role for nuclear pore proteins in poxvirus morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (9), 3519-3524 (2013).
- Beard, P. M., Griffiths, S. J., et al. A loss of function analysis of host factors Influencing vaccinia virus replication by RNA Interference. PLoS ONE. 9 (6), e98431 (2014).
- Teferi, W. M., Dodd, K., Maranchuk, R., Favis, N., Evans, D. H. A whole-genome RNA interference screen for human cell factors affecting myxoma virus replication. J. Virol. 87 (8), 4623-4641 (2013).
- Workenhe, S. T., Ketela, T., Moffat, J., Cuddington, B. P., Mossman, K. L. Genome-wide lentiviral shRNA screen identifies serine/arginine-rich splicing factor 2 as a determinant of oncolytic virus activity in breast cancer cells. Oncogene. 35 (19), 2465-2477 (2015).
- Panda, D., Das, A., et al. RNAi screening reveals requirement for host cell secretory pathway in infection by diverse families of negative-strand RNA viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (47), 19036-19041 (2011).
- Lee, A. S. -Y., Burdeinick-Kerr, R., Whelan, S. P. J. A genome-wide small interfering RNA screen identifies host factors required for vesicular stomatitis virus infection. J. Virol. 88 (15), 8355-8360 (2014).
- Mahoney, D. J., Lefebvre, C., et al. Virus-tumor interactome screen reveals ER stress response can reprogram resistant cancers for oncolytic virus-triggered Caspase-2 cell death. Cancer Cell. 20 (4), 443-456 (2011).
- Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. A call to arms: Using RNAi screening to improve oncolytic viral therapy. Cytokine Growth Factor Rev. 21 (2-3), 161-167 (2010).
- Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. Functional genomic screening to enhance oncolytic virotherapy. Br. J. Cancer. 108 (2), 245-249 (2012).
- Allan, K. J., Stojdl, D. F., Swift, S. L. High-throughput screening to enhance oncolytic virus immunotherapy. Oncolytic Virother. 5, 15-25 (2016).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8 (5), 566-570 (2003).
- Birmingham, A., Selfors, L. M., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6 (8), 569-575 (2009).
- Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
- Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).
- Thomas, P. D., Campbell, M. J., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
- Szklarczyk, D., Morris, J. H., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D362-D368 (2017).
- Luc, P. -V., Tempst, P. PINdb: a database of nuclear protein complexes from human and yeast. Bioinformatics. 20 (9), 1413-1415 (2004).
- Chung, N., Zhang, X. D., et al. Median absolute deviation to improve hit selection for genome-scale RNAi screens. J. Biomol. Screen. 13 (2), 149-158 (2008).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z Score, SSMD*, z* Score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
- Zhang, X. D., Lacson, R., et al. The use of SSMD-based false discovery and false nondiscovery rates in genome-scale RNAi screens. J. Biomol. Screen. 15 (9), 1123-1131 (2010).
- Amberkar, S. High-throughput RNA interference screens integrative analysis: towards a comprehensive understanding of the virus-host interplay. World J. Virol. 2 (2), 18-31 (2013).
- Barrows, N. J., Le Sommer, C., Garcia-Blanco, M. A., Pearson, J. L. Factors affecting reproducibility between genome-scale siRNA-based screens. J. Biomol. Screen. 15 (7), 735-747 (2010).
- Carralot, J. -P., Ogier, A., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28 (2), 261-268 (2011).
- Caffrey, D. R., Zhao, J., et al. siRNA off-target effects can be reduced at concentrations that match their individual potency. PLoS ONE. 6 (7), e21503-e21511 (2011).
- Makarenkov, V., Zentilli, P., Kevorkov, D., Gagarin, A., Malo, N., Nadon, R. An efficient method for the detection and elimination of systematic error in high-throughput screening. Bioinformatics. 23 (13), 1648-1657 (2007).
- Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Brief. Bioinform. 16 (6), 974-986 (2015).
- Savidis, G., McDougall, W. M., et al. Identification of Zika virus and dengue virus dependency factors using functional genomics. Cell Rep. 16 (1), 232-246 (2016).
- Ma, H., Dang, Y., et al. A CRISPR-Based screen identifies genes essential for West-Nile-virus-induced cell death. Cell Rep. 12 (4), 673-683 (2015).
- Zhang, R., Miner, J. J., et al. A CRISPR screen defines a signal peptide processing pathway required by flaviviruses. Nature. 535 (7610), 164-168 (2016).
- Marceau, C. D., Puschnik, A. S., et al. Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens. Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).
