Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Genomet hele RNAi Screening å identifisere vert faktorer som modulerer kan viruset terapi

Published: April 3, 2018 doi: 10.3791/56913
Automatic Translation
1,2, 1,4, 1, 1, 1,2,3
1Children's Hospital of Eastern Ontario (CHEO) Research Institute, 2Department of Biology, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 3Department of Pediatrics, University of Ottawa, 4Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary

Summary

Her beskriver vi en protokoll for å ansette høy gjennomstrømming RNAi screening å avdekke vert mål som kan manipuleres til å forbedre kan viruset terapi, spesielt rhabodvirus og vaccinia virus terapi, men det kan være lett tilpasses andre kan virus plattformer eller for å oppdage vert gener som modulerer virus replikering generelt.

Abstract

Høy gjennomstrømming genomet hele RNAi (RNA-interferens) screening teknologi har vært mye brukt for å oppdage vert faktorer som påvirker virus replikering. Her presenterer vi bruk av denne teknologien for å avdekke vert mål som spesielt modulerer replikering av Maraba virus, kan rhabdovirus, og vaccinia virus med mål om å forbedre terapi. Mens protokollen har blitt testet for bruk med kan Maraba virus og kan vaccinia virus, dette gjelder for andre kan virus og kan benyttes for å identifisere vert mål som modulerer virus replikasjon i pattedyrceller i generelt. Denne protokollen beskriver utvikling og validering av analysen for høy gjennomstrømming RNAi screening i pattedyrceller, nøkkelfaktorer og klargjøringstrinn som er viktige for å utføre en primær høy gjennomstrømming RNAi skjerm, og en trinnvis innføring i gjennomføre en primær høy gjennomstrømming RNAi skjermen. i tillegg beskriver det grovt metodene for å gjennomføre sekundær skjerm validering og tertiær validering studier. Fordelen med høy gjennomstrømming RNAi screening er at det gjør det mulig å katalogisere, i en omfattende og upartiske mote, vert faktorer som modulerer noen aspekter av viruset replikering som man kan utvikle i vitro analysen som infectivity, brast størrelse, og cytotoksisitet. Det har makt til å avdekke biotherapeutic mål uforutsette basert på dagens kunnskap.

Introduction

Høy gjennomstrømming genomet hele RNAi screening har vist seg for å være et uvurderlig verktøy for å avsløre biologiske innsikt i ulike områder av studiet inkludert virus biologi. Det siste tiåret eller så, har mange grupper foretatt cellebasert storstilt RNAi screening for å identifisere mye vert gener som modulerer virus replikering (anmeldt i1,2,3,4 , 5 , 6 , 7). interessant, mange av disse skjermene har vært utført i kreftceller og flere med virus som er gjeldende kan virus kandidater inkludert vaccinia virus8,9,10 , Myxoma virus11, herpes simplex virus12, vesicular stomatitt virus13,14og Maraba virus15. Mens fokus for fleste av disse studiene var identifisere vert faktorer som påvirker noen aspekter av viruset replikering og ikke identifisere biotherapeutic mål for forbedring kan viruset terapi, kan verdifulle data være minelagt fra disse datasett i denne forbindelse. Det er klart at mektige potensialet til å identifisere vert mål som kan manipuleres til å forbedre kan viruset terapi ikke har blitt fullt utnyttet.

En mengde kan virus plattformer blir nå testet i prekliniske og kliniske studier inkludert herpes simplex virus, reovirus og vaccinia virus, som har hatt påviselig suksess i sent kliniske forsøk. For fleste av disse plattformene, har innsatsen vært rettet mot endre virus genomer å forbedre terapi. For eksempel, for å øke svulst spesifisitet, er spesifikt virus gener slettet eller mutert for å begrense viral replikasjon i normale celler, men ikke i kreftceller. I noen tilfeller effekter av transgener ha blitt addert som GM-CSF (granulocytt macrophage koloni-stimulerende faktor) å forsterke immunforsvaret eller NIS (natrium iodide symporter) å aktivere i vivo bildebehandling og mobilnettet radioiodide opptak for terapeutisk formål. Imidlertid har det vært svært lite arbeid fokusert på manipulere vert/svulst gener og utforske virkningen av vert/svulst gener på kan virus replikering. Med bruk av høy gjennomstrømming screening teknologi, er det nå mulig å sondere vert-virus interaksjoner i genomet skala og dechiffrere muligheter manipulere vert genomet for å forbedre kan viruset terapi (omtalt i16, 17,18).

Vi rapporterte den første studie demonstrere proof-of-concept for bruk av høy gjennomstrømming genetisk screening for å identifisere vert mål som kan manipuleres til å forbedre kan viruset terapi. For å oppdage vert gener som modulerer Maraba virus oncolysis, en kan rhabdovirus testes i fasen jeg og II prøvelser, vi gjennomført genomet hele RNAi skjermer over tre forskjellige svulst cellelinjer i duplikat med en siRNA (kort konflikt RNA) bibliotek målretting 18,120 gener15. Sti analyse av treff i skjermene avdekket anriking av medlemmer av de ER (endoplasmatiske retikulum) stress respons. Vi valgte 10 treff i disse trasé for sekundær godkjenningen siRNA med forskjellige målretting sekvenser fra de primære skjermen. Som del av tertiær validering, gjennomførte vi en redning eksperimentere med IRE1α (inositol-krever enzym 1 alfa) til at treffet var på målet. In vitro og i vivo testing ved bruk av et lite molekyl inhibitor av IRE1α resulterte i dramatisk forbedret kan effekt.

Workenhe et al. 12 også gjennomført et genom hele RNAi skjermen ved hjelp av en gruppert lentiviral shRNA (kort hårnål RNA) bibliotek målretting 16,056 gener for å identifisere vert faktorer begrense menneskelig herpes simplex virus type 1 (HSV-1) mutant KM100-mediert oncolysis bryst kreftceller. Primære skjermen identifisert de 343 gener knockdown fører til forbedret cytotoksisitet KM100-infiserte celler over uekte-infiserte celler. de valgte 24 av disse genene for sekundær validering. Av 24 genene, 8 gener ble bekreftet i sekundære skjermen med en av dem som SRSF2 (serine/arginine-rik skjøting faktor 2) senere bekreftet ved hjelp av en genetisk redning eksperiment under tertiær valideringen. Gruppen fortsatte med å identifisere en DNA topoisomerase hemmer chemotherapeutic som redusert fosforylering i SRSF2 og viste at Kombinasjonsbehandling av HSV-1 KM100 med dette hemmer fører til lengre overlevelse TUBO svulst rentebærende mus.

I de nevnte studiene, ble en lignende arbeidsflyt fulgt. Hver begynte med en primær genomet-RNAi widescreen etterfulgt av en sekundær skjerm på et utvalgt antall treff i primære skjermen. Dette ble etterfulgt av tertiær validering studier, som bekrefter at treffet var på målet ved å utføre genetiske redde eksperimenter i vitro med ultimate validering utført ved å manipulere målet gene produktet i vivo. I denne artikkelen gi vi først en generell protokoll for utvikling og validering av en høy gjennomstrømming siRNA-screening analysen, som innebærer å bestemme de optimale transfection forholdene, mengde virus, og lengden på infeksjon. Vi tilbyr også en detaljert protokoll for å gjennomføre en primær en høy gjennomstrømming siRNA skjerm samt en helhetlig beskrivelse av metoden for å utføre sekundær skjerm validering og tertiær validering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. utviklingen og validering av en høy gjennomstrømming siRNA screening analysen

Merk: For alle eksperimentene, bruk Hepes-bufret vekst medier passer for hver celle linje. Se figur 1 for en oversikt over arbeidsflyten fra analysen optimalisering tertiær validering.

  1. Bestemmelse av den optimale transfection forhold
    1. Velg en svulst celle linje eller ideelt flere tumor celler linjer med å optimalisere transfection forhold (f.eks 786-O, NCI-H226, SF268, U373, OVCAR-8, U20S, se diskusjon for mer om valg av linjer).
    2. Velg en transfection reagens eller flere for å teste. Det kan være nødvendig å teste flere hva reagenser, som noen kanskje mer giftig eller effektiv enn andre i en gitt celle linje. Også huske på at noen kan ha innvirkning på virusinfeksjon eller kan generere høye signal på bildebehandling.
    3. Bestemme positiv [e. g. siRNA målretting PLK-1(Polo Like Kinase 1) mRNA, som induserer celledød] og negative transfection kontroller (f.eks ikke målretting siRNA).
    4. Følg omvendt transfection protokollen for bestemt hva reagensen, men variere mengden av hva reagens (f.eks 0,05, 0.1, 0,15 og 0,2 μL/vel) og celle seeding tettheter (f.eks 625, 1250, 2500 celler/vel). Ta av følgende: ubehandlet celler, mock transfekterte cellene (i.e. celler pluss transfection reagens), og transfekterte med positive og negative transfection kontroll siRNA (se figur 2A for en eksempel plate Oppsett).
      1. Generelt, forberede 80 nM fortynninger av hver siRNA en siste konsentrasjon i brønnen 10 nM (avhengig av biblioteket, en høyere konsentrasjon av siRNA kan være nødvendig). Med mindre annet fortynne siRNA med hva reagensen fortynner. Forberede fortynninger av transfection reagensen.
      2. Pipetter 5 μL siRNA per brønn etterfulgt av 5 μL utvannet transfection reagens. For å lette dette trinnet, kan du distribuere langs en kolonne med en U-bunn 96-brønns plate, siRNA mikser og den siRNA fortynningsmiddel alene (for ubehandlede og narr transfekterte celler). Distribuere en andre kolonne, utvannet transfection reagens og transfection reagens fortynner alene (for ubehandlet celler).
        1. Bruke en elektronisk Pipetter, Pipetter 5 μL/vel av innholdet i den første kolonnen som inneholder siRNA eller siRNA fortynningsmiddel i tilsvarende brønnene av 384-vel plate etterfulgt av 5 μL/vel utvannet transfection reagens eller hva reagens fortynningsmiddel fra den andre kolonnen.
      3. Sentrifuge platene 1026 x g i 1 min i romtemperatur og ruge for gang foreskrevet for transfection reagensen (f.eks 5-20 min).
      4. Mens platene er incubating, forberede celle suspensjoner av forskjellig tetthet. Pipetter 30 μL celle suspensjon per brønn. Før du plasserer platene i inkubator, la platene sitte i 45-60 min ved romtemperatur å tillate uniform bosetting av celler19.
        Merk: Hvis inkubasjonstiden foreskrevet for transfection reagensen med siRNA er kort, forberede celle suspensjoner før inkubasjon.
      5. Inkuber 48 til 72 h avhengig av ønsket lengden på knockdown valgt for skjermen.
    5. Forberede en feste og flekker løsning med formaldehyd, Hoechst 33342 og PBS (fosfat-bufret saltvann) for en siste konsentrasjon i hver brønn av 4% formaldehyd og 5 ug/mL Hoechst 33342. Etter behov, prøv en høyere (f.eks 7.5 ug/mL) eller lavere konsentrasjon (f.eks 2 ug/mL) av Hoechst hvis signalet er for svak eller for sterk, henholdsvis.
    6. Dispensere 30 μL fikse og flekk løsningen direkte i alle brønnene. Inkuber platene i 30 min på 37 ° C. Lagre platene på 4 ° C. Hvis bruker ikke AC confocal mikroskop, vask platene med PBS med en plate skive; i de fleste tilfeller er vask unødvendig ved AC confocal mikroskop.
    7. Utvikle et skript for å kvantifisere antall celler per brønn.
      Merk: Det finnes flere programvarepakkene for dette formålet og, mens hver kan ha ulike måter å generere skript, de all hovedsak har en måte å identifisere kjerner, celler og områder av interesse samt beregning av intensitet og morfologiske egenskaper. Når utvikle et screening-skript, er det viktig å vurdere tiden det tar å kjøre skriptet per plate og kanskje inkludere bare viktig mål å minimere behandlingstid. For eksempel for å kvantifisere celle nummer, kan én beregne Hoechst området per godt over en angitt intensitet; og for å kvantifisere virus spres, kan en beregne GFP (grønn fluorescerende protein) området per godt over en angitt intensitet. Skriptet "avdempet ned" må være i forhold til mer forseggjort skriptet slik ingen viktig informasjon er tapt.
    8. Analysere resultatene for å fastslå de optimale transfection forholdene, hvor transfection reagens og cellen seeding tetthet som fører til betydelig celledød (0-30% celle overlevelse) og er minimal giftig for cellene (f.eks 90-100% cellen overlevelse). Merk: Det kan ta lengre tid å observere celle død fenotypen i linjer med lang dobling ganger. Se figur 2B og 2 C representant resultater. Kontroller også at cellene transfekterte med ikke målretting siRNA er ca 90-100% confluent ved fiksering som senere en vil infisere celler av denne confluency.
  2. Bestemmelse av den optimale mengden av virus og lengden av infeksjon
    1. Utføre samme omvendt transfection trinn som beskrevet ovenfor (se 1.1.4.1 til 1.1.4.4); bruker imidlertid optimale transfection vilkårene (se 1.1.8) (f.eks for 786-O celler: 1500 celler/godt og 0,05 μL/vel i RNAiMAX), og i tillegg inneholde ekstra brønner er infisert med viruset [f.eks brønner med ubehandlet celler, mock transfekterte celler, celler transfekterte med ikke målretting siRNA og celler transfekterte med positiv virus kontroller hvis de er kjent (dvs. siRNA målretting vert gener som vil hemme eller forsterke replikering)].
      1. Se figur 3A for et utvalg plate oppsett. Inkuber 48-72 h.
    2. Infisere andre virus brønnene med en kan virus uttrykke et fluorescerende reporter protein (f.eks GFP) med en rekke multiplicities infeksjon (MOIs) (f.eks 0,001 til 10; Området valgt være avhengig av nivået av motstand eller mottakelighet av cellen linje.). Inkluder infisert brønner også. Pipetter 40 μL av hver virus fortynning per brønn for et siste volum av 80 μL. Sentrifuge hver plate på 400 x g i 30 min ved romtemperatur.
    3. Følgende infeksjon, bilde cellene lever med en høy-innhold, automatisert mikroskop regelmessig (f.eks hver 4-8 h). Se figur 3B og 3 C.
    4. Utvikle et skript for å kvantifisere virus spres (f.eks GFP området per brønn) (se 1.1.7). Analysere bildene og velge et tidspunkt og en MOI at for påvisning av økning og nedgang i oppslag. Sikre-punkt og MOI faller innenfor en lineær å lette oppdagelsen av små endringer i oppslag. Beregne Z-faktoren (eller Z') for gitt tidspunkt og MOI.
      Merk: Anslått Z-faktor = 1-3 (σp + σn) / | μp- μn|, der σp er standardavviket til positiv virus kontrollene og σn er standardavviket av negativ virus Kontroller; μp er utvalgsgjennomsnittet for positiv virus kontrollene og μn utvalgsgjennomsnittet for negative kontrollene. En anslått Z-faktor på 0,5 - 1.0 er anses å være en utmerket analyse og egnet for screening20,21.
    5. Bekreft at negativ virus kontroll siRNA har ingen innvirkning på virus replikering å håne transfekterte og ubehandlet brønnene. Det er ofte nødvendig å teste flere negative kontroller som noen negative siRNA kontroller kan påvirke virus replikering.
  3. Endelig bekreftelse til høy gjennomstrømming screening analysen
    1. Gjenta trinn 1.2.1 og 1.2.2 ovenfor, men bare denne gangen infisere celler med den optimale MOI. I stedet for live bildebehandling, fikse og flekken plate (som beskrevet i 1.1.5 og 1.1.6) på den optimale tidspunkt (se 1.2.4).
    2. Bildet platen. Analysere resultatene med samme prosedyre som skal brukes for skjermen (se 1.1.7 og 1.2.4). Bekrefte hva betingelsene (dvs god knockdown i brønner transfekterte med positiv transfection kontroll og minimal toksisitet i brønner transfekterte med negativ transfection kontroll). Beregne Z-faktoren for å bestemme robust analysen (se 1.2.4).
  4. Ytterligere testing og hensyn for å gjennomføre høy gjennomstrømming screening
    1. Teste holdbarheten av være ferdig innen platene som noen plater kan knekke under sentrifugering, spesielt når lokkene holdes og flere plater er centrifuged samtidig. Å redusere sprengning, sentrifuge uten lokkene (forutsatt platene har sel), eller redusere antall plater sentrifugeres per bøtte.
    2. Teste stabiliteten på transfection reagens blandingen over tid. Når transfection reagensen legges til plater, kan det være en betydelig forsinkelse før tillegg av celler. Derfor er det viktig å vite tidsperioden som transfection reagens blandingen forblir effektiv. For skjermen, kan det være nødvendig å forberede celler før legge transfection reagens blandingen til platene.
    3. Forberede bruker flytende dispenser. Bestemme volumene må dispensere transfection reagens, celler, virus og fikse tar hensyn volumet at slangen plass, volumet tapt til å pre dispensing (Hvis enheten har denne funksjonen), og residualvolum kreves i flaskene brukes for utleveringen.
      1. Angi og teste programmene som skal brukes for dispensering transfection reagens, celler og virus. For å minimere tap av transfection reagens, grense, hvis mulig, antall pre dispenses. Opprette en protokoll for kalibrering flytende dispenser og dens nøyaktighet og presisjon.
    4. Forberede bulk utlevering av transfection reagens, celler og virus
      1. Først bestemme antall plater som skal behandles i én omgang vurderer hvor mange plater som kan feasibly være trypsinized samtidig, antall være ferdig innen plater som kan sentrifugeres, lengden på tiden det tar å behandle en gruppe med plater med flytende dispenser, og også tid for bildebehandling. Merk: Vanligvis behandling ca 30 plater samtidig er ganske mulig og behandling 3 grupper av platene er overkommelig på en dag.
      2. Empirisk kontrollere volumet på transfection reagens kreves for å behandle en bunke plater. Test som dette volumet er tilstrekkelig ved dispensering 5 μL destillert vann flere ganger over en plate tilsvarende antall ganger som vil være nødvendig å behandle en batch.
      3. For å sikre jevn fordeling av celler, beregne tiden nødvendig å dispensere celler over en bunke plater. Forberede en flaske som inneholder volumet av celler kreves for en bunke, og dispensere celler i flere kolonner med en plate om gangen, regelmessig i samme løpet av tiden det vil ta for å dispensere over en bunke plater. Teste hvor ofte vil det være nødvendig å blande cellene for å opprettholde en jevn distribusjon av celler.
      4. For å sikre jevn fordeling av virus, gjenta samme som ovenfor (se 1.4.4.3), men denne gangen dispensing virus på confluent brønner. Hvis viruset ikke er jevnt fordelt, kan du vurdere å forberede viruset i konisk rør og vortexing hver rør før utlevering.
    5. Spore veksten av celler til å bestemme tidslinjen for vokser nok celler for skjermen. Også bestemme gjennomsnittlig antall celler som kan høstes per plate av cellene vokser i loggen fase for å kunne anslå hvor mange kreves for skjermen.
  5. Siste forberedelsene for høy gjennomstrømming screening
    1. Opp til en måned før begynner screening, Bestem alle materialene nødvendig for skjermen. Bestille nødvendige reagenser (se materialer). Sikre den nødvendige mengden av virus er på side (helst bruke samme lager som ble brukt under optimalisering.).
    2. Opp til to uker før du setter screening, tine og vokser opp cellene kreves for skjermen. Sikre tilgjengeligheten av sentrifuger og firkantet sentrifuge bøtter.
    3. I løpet av uken før begynner screening, forberede medier flasker for omvendt transfection og infeksjon, et lager av 70% etanol, 2 X transfection reagens fortynner (f.eks 2 X Opti-MEM) hvis nødvendig (f.eks hvis siRNA biblioteket er fortynnet i RNase-free vann, en vil bruke 2 X til transfect celler), og dele virus (én per bunke plater). Kontrollere tilstanden til cellene.
      1. Forberede en lagerløsning av Hoechst 33342 flekk (f.eks 5 mg/mL). Forbered en balanse plate hvis en vil være nødvendig for sentrifugering.
      2. Kontroller platen vaskemaskinen er i orden hvis det skal brukes. Kontroller flytende dispenser er riktig kalibrert og dispensering nøyaktig og nøyaktig. Kontroller også programmene er riktig angitt på flytende dispenser.

2. gjennomføre skjermbildet primære høy gjennomstrømning

Merk: Før begynner RNAi skjermen, være ferdig innen plater (f.eks 384-vel plater) må være plassert med siRNA biblioteket og screening kontroller. Følgende er best utført av to personer med én person (i.e. Person A) er hovedsakelig ansvarlig for utlevering hva reagens og celler over platene, og den andre personen (i.e. Person B) er ansvarlig for sentrifugering platene umiddelbart før transfection og forbereder cellene. Inkludert i parentes er litt nærmere for å behandle en gruppe med 33 plater (dvs. halvparten av biblioteket) med 786-O cellen linje.

  1. Forberedelse for omvendt transfection
    1. Personen A: sett nok media, trypsin og PBS nødvendig for å behandle en gruppe med plater i et 37 ° C vannbad. Valgfritt: Trypsinize en tallerken med celler, og antall celler per plate for å gi en sanntids anslå hvor mange plater må etter satsvis.
    2. Få en bunke plater (f.eks 33 plater) fra fryseren og vent 20-30 minutter å tillate platene å avrime. Mens platene er avriming, fortsetter du med følgende trinn.
      1. Personen A: Pipetter i 50 mL konisk rør mengden transfection reagens fortynner tar å behandle en gruppe med plater (f.eks 2 x 37.125 mL) og plassere dem i en 37 ° C vannbad. Fylle to flasker med 70% etanol (f.eks 250-500 mL flasker). Fylle to 50 mL konisk rør med PBS og med destillert vann.
      2. Personen A: fordype flytende dispenser rør i en flaske med 70% etanol. Hvis alle tips ikke vil bli brukt for dispensering transfection reagensen (f.eks hvis de ytre brønnene på platen ikke brukes), kan du koble den unødvendige rør først. Legg et stykke maskeringstape rundt slangen merke punktet som slangen kan bli vurdert sterilt. Prime med ca 25 mL. Hell ekstra etanol i flasken for å erstatte tapt volumet. La forbindelsesslangen sitte i etanol i minst 5 minutter.
      3. Personen B: klar til trypsinize celler. Spray vev kultur (TC) panseret med 70% etanol. Spray og plassere den nødvendige Pipetter for flergangsbruk, tips, flasker og microfuge rør for å lage celler i panseret (se 2.2.1.1 og 2.2.1.2). Sentrifuge forseglet platene i sett 1026 x g i 2 minutter ved romtemperatur. Fjerne dekslene fra plater i TC hette, hvis tidligere fastslått at platene kan sprekke under sentrifugering når lokkene holdes på (se 1.4.1).
    3. Personen A: fjerne selene fra platene. Før, under eller etter selene er fjernet (avhengig av lengden på inkubasjon kreves), Pipetter den nødvendige mengden av hva reagens (f.eks 375 μL/rør for en siste konsentrasjon av 0,05 µL RNAiMAX/vel) til konisk rør inneholder forvarmes transfection reagens fortynningsmiddel (f.eks 37.125 mL/rør).
    4. Bland ved pipettering opp og ned 10 ganger. Inkuber ved romtemperatur for gang foreskrevet for transfection reagensen brukes (f.eks 0-10 min).
  2. Omvendt transfection
    1. Må Person B fullføre oppgavene nedenfor.
      1. Starte trypsinizing cellene (f.eks 3 plater 786-O celler). Sug opp media fra hver plate. Skyll med 9 mL PBS. Pipetter 3 mL trypsin per plate. Ruge på 37 ° C for ca 5 min. Resuspend cellene med 22 mL av media. Pipetter opp og ned 10 ganger.
      2. Kombiner celle suspensjon fra hver vev kultur plate til en steril flaske. Bland celle suspensjon ved å snu. Pipetter 1 mL dele celle suspensjon i to separate microfuge rør. Fjerne et utvalg fra hver microfuge rør og telle celler. Beregne volumet av cellen suspensjon kreves for tetthet kreves (f.eks 1500 celler/vel) og forberede nok utvannet celle suspensjon (f.eks 500 mL) til å dispensere over en bunke plater.
    2. Har Person A fullføre følgende oppgaver parallelt til Person B.
      1. Tømme flytende dispenser rør av etanol. Prime slangen med ca 25 mL PBS, og tøm deretter slangen. Vær forsiktig når du håndterer slangen for å sikre at delen av rør under av maskeringstape omringes transfection reagens og senere i cellen suspensjon oppbevares sterilt. Beskikket plater som trygt kan gjøres med en konisk tube transfection reagens løsning.
      2. Pipetter transfection reagens løsningene opp og ned 10 ganger. Prime slangen med transfection reagens løsning. For å minimere tap av transfection reagens, prime med akkurat nok løsning å fjerne knapt tips. Velg riktig programmet på flytende dispenser og dispensere 5 µL transfection reagens per brønn.
        FORSIKTIG: Nøye overvåke nivået på transfection reagensen slik at det fylles før den renner ut. Ferdigstillelse av platene som er sett fra hverandre skal gi et signal for å legge til flere transfection reagens løsning.
      3. Sentrifuge platene 1026 x g i 1 min i romtemperatur. Denne gangen blir det lokkene på, så det kan være nødvendig å sentrifuge mindre plater for å hindre sprekkdannelse (f.eks 2 plater per bøtte). Inkuber platene ved romtemperatur for gang foreskrevet for transfection reagensen brukes (f.eks 10-20 min).
      4. Under incubation, tomme slangen transfection reagens løsningen, og legg den i en full 50 mL konisk rør som inneholder PBS. Skyll slangen med ca 25 mL PBS av grunning og tømming.
        1. Hvis flere av tipsene skal brukes for utlevering cellene enn ble brukt for dispensering transfection reagens, re-fest ubrukte slangen og sterilisere re alle slangen med 70% etanol før skylling slangen med PBS (se 2.1.2.2).
      5. Bland flasken inneholder cellen suspensjon når det er utarbeidet. Plasser slangen i cellen suspensjon, og prime nok til å se at hver tips er riktig dosering. Dispensere 30 μL per brønn av cellen suspensjon over alle platene. Om nødvendig kan du blande celle suspensjon regelmessig å unngå bosetting.
        Advarsel: Noen ganger dråper av suspensjon som inneholder medier kan feste til sidene av tipsene. Når dette er observert, Sug opp så snart som mulig eller tørk lofri vev dynket i 70% etanol.
      6. Tømme slangen av cellen suspensjon. Skyll slangen med ca 25 mL PBS, etterfulgt av ca 50 mL destillert vann.
    3. La platene å sitte i 45-60 minutter etter at cellen seeding ved romtemperatur før retur platene til inkubator. Inkuber plater i en uforstyrret inkubator for ønsket lengden av genet stanse (f.eks 48t) (se 1.1.4.5).
  3. Infeksjon
    1. For å spare tid, dagen før infisere cellene, Pipetter i sterilt flasker den nøyaktige mengden media må infisere hvert sett med plater inkludert medier infisert brønner (f.eks 2 x 350 mL og 2 x 50 mL for 33 plater). I tillegg test flytende dispenser for presisjon og nøyaktighet, og kalibrere på nytt om nødvendig.
    2. Varm media på 37 ° C. Fylle to flasker med 70% etanol, to 50 mL konisk rør med PBS og med destillert vann. Kontroller at sentrifuge ved romtemperatur.
    3. Sterilisere slangen med 70% etanol, og skyll med PBS som beskrevet tidligere (se 2.1.2.2 og 2.2.2.1). Mens slangen sitter i etanol, Pipetter presis volumet av viruset må inn i flasken med media tidligere forberedt for infeksjon (se 2.3.1). Skyll slangen med PBS grunning med 25 mL og deretter tømme.
    4. Fjern platene settefiskanlegg og plassere dem i TC panseret. Prime slangen med media. Dispensere 40 μL media til uninfected kontroll brønnene. Tomme slangen av media og skyll med 25 mL PBS. (se 2.2.2.5 for forsiktig)
    5. Etter blanding viruset, plasser slangen inn i flasken som inneholder viruset. Dispensere 40 µL virus over platene. Sentrifuge platene i 30 min 400 x g ved romtemperatur. Tilbake platene til inkubator. Inkuber platene for tidligere bestemt tidsrom (f.eks 24 h) (se 1.2.4).
  4. Feste og flekker celler
    1. For å spare tid, dagen før festing, forberede en flaske fikse og flekker løsning som inneholder formaldehyd og PBS (f.eks 179 mL av 37% formaldehyd og 270 mL PBS for en siste konsentrasjon av 4% formaldehyd) for hvert sett med plater, men utelater den Hoechst flekk. Lagre i brannfarlig regjering fra lys.
    2. Skyll slangen med 70% etanol og PBS som beskrevet tidligere (se 2.1.2.2 og 2.2.2.1). Legge til den nødvendige mengden Hoechst (f.eks. 2,5 mL av en 5 mg/mL av Hoechst for en siste konsentrasjon i brønnen på 7,5 μg/mL) fastsetting og flekker løsning og bland.
    3. Dispensere 30 μL fikse og flekker løsning over alle platene. Sett platene i inkubator for 30 min. Etter inkubasjon selene gjelder platene og lagre platene på 4° C beskyttet mot lyset. Vask platene hvis nødvendig (se 1.1.6).
  5. Bildebehandling og bildeanalyser
    1. Bilde platene med en automatisert, høyt innhold mikroskop. Bruke de tidligere fastsatte innstillingene, men først teste innstillingene for å sikre at ingen justeringer må gjøres.
    2. Kvantifisere av GFP (eller andre fluorescerende reporter) og Hoechst område per godt med tidligere utviklet skriptet (se 1.3.2). Test skriptet med en håndfull først til å finne noen små endringer må gjøres før satsvise analysere alle platene.
    3. Identifisere treff. Merk: Robust Z-score/MAD (median absolutt avvik) metoden er en metode som ofte brukes mot dette formål. Vanligvis scorene til > 2 eller < -2 er satt som avskjær. Denne metoden er best brukt når siRNA prøvene er tilfeldig fordelt på platene og ikke, for eksempel gruppert etter funksjon som eksemplene brukes de facto negative kontroller. Filtrere ut cytotoksisk siRNAS disse forventet nonspecifically redusere viruset sprer seg (se diskusjon for ytterligere informasjon om filtrere ut cytotoksiske treff).

3. sekundær skjerm validering av treff med TRC (The RNAi Consortium) shRNA biblioteket

Merk: Se diskusjon for informasjon om å velge treff for sekundær validering og mulig screening teknologier. Hvis siRNA teknologi for sekundær validering, den samme analyse endrings- og protokollen kan brukes som ble brukt for den primære skjermen (se 1).

  1. Få et egendefinert TRC shRNA bibliotek målretting kandidat gener av interesse som glyserol aksjer.
  2. Forberede hva kvalitet plasmider DNA fra glyserol aksjer. Merk: En detaljert protokoll (dvs. "ShRNA/sgRNA/ORF glyserol og plasmider DNA forberedelse") kan bli funnet her: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
  3. Produsere lentiviruses uttrykke shRNA målretting genene rundt med DNA plasmider. Merk: En detaljert protokoll for lentivirus produksjon i 96-brønnen plater [dvs. "shRNA/sgRNA/ORF høy gjennomstrømning Viral produksjon (96 godt)"] her: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
  4. Infisere celler med lentiviruses. Merk: En detaljert protokoll for lentiviral infeksjon i 96-brønnen plater (dvs. "Lentiviral infeksjon") er tilgjengelig på http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/dir/download?dirpath=protocols/production&filename=TRC%20viral % 20infection%20200909.pdf.
  5. Infisere celler med kan virus enten følgende puromycin-valg (se 3.4 for utvalg protokollen) ble transduced celleområde eller umiddelbart signaltransduksjon (uten puromycin utvalg). For å bestemme den optimale mengden av virus og lengden på inkubasjon med virus, kan du bruke samme metode brukes for primære skjermen.

4. tertiær validering

Merk: Hensikten med Tertiær validering er primært bekrefte at treffet målet, svulst spesifikk, og forbedrer effekten i vivo. Man kan også teste om det modulerer spredt over et spekter av svulst cellelinjer

  1. Bekrefte at knockdown kandidat genet er på målet
    1. Først Bekreft at det er en sammenheng mellom fenotypen og gene stanse. Bruke samme analysen som ble utviklet for skjermen eller endre den for et 6-vel format å vurdere ekstrautstyr eller hemming av spredning i et større format. Gjennomføre en tid-kurs med celler transfekterte med siRNA målretting gene(s) rundt pluss og minus virus.
    2. Bilde brønnene som inneholder virus-infiserte celler, og samle celle lysates fra infisert brønnene ved jevnlige intervaller. Fastslå om det er en sammenheng mellom genet stanse og ekstrautstyr eller hemming av spredningen. Vurdere genet stanse kvantitative polymerasekjedereaksjons (qPCR) og/eller vestlige blotting.
    3. Utføre en genetisk redning eksperiment for å bekrefte rammet er på målet. Merk: I et typisk redning eksperiment, kandidat genet er banket-ned med RNAi mens samtidig celler er transfekterte transiently med RNAi mot cDNA (f.eks ortholog av genet) uttrykker kandidaten genet til å fastslå om den fenotypen av genet er gjenopprettet eller "reddet". Stabil linjer overexpressing RNAi motstandsdyktig cDNA av kandidaten genet av interesse kan også anvendes.
    4. Også i stedet for et genetisk redning eksperiment, bruke flere ortogonale analyser for å bekrefte at treffet på mål [f.eks avgjøre om samme fenotypen hentes på knockdown av målet genet med flere siRNAs, på knockdown av målet genet i flere stabile cellelinjer uttrykke shRNA mot målet genet og knockout med CRISPR (gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjenta)-Cas9 teknologi i flere cellelinjer.].
  2. Bekreftelse på at treffet svulst-spesifikke og modulerer spredt over en rekke svulst cellelinjer
    1. Gjennomføre en lignende analysen som 4.1.1, men med normale celler og andre svulst cellelinjer.
  3. Bekreftelse som manipulering av kandidaten genet øker effekten i vivo
    Merk: Beskrevet nedenfor er tre mulige metoder for å manipulere genet målrette i vivo.
    1. Finne et stoff å manipulere genet målet. Hvis det er et stoff som en lite molekyl inhibitor som er rettet mot det samme genet, administrere det med kan virus i vivo. Det er viktig å bestemme optimale tidspunktet for administrasjon av stoffet.
    2. Ingeniør viruset å hemme eller overexpress gene målet avhengig av om en ønsker å hemme eller forsterke genet målet. For å hemme genet, ingeniør kan viruset for å uttrykke en dominerende negative genet eller uttrykke shRNA målretting genet. For å styrke uttrykk for genet målet, klone kan viruset med en transgene overexpressing genet.
    3. Ingeniøren cellelinjer genet banket-ned eller slo ut med shRNA eller CRISPR-Cas9 teknologi, henholdsvis. Implantatet utviklet celle linjen og vill-type celle linje i vivo og deretter infisere med kan viruset. Merk: Denne metoden fungerer som et bevis-av-prinsipp og kan hjelpe avgjøre om investere mer tid og ressurser til å utvikle et legemiddel for å manipulere den gen i vivo, for eksempel ville være verdt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En oversikt over arbeidsflyten for å identifisere vert mål å forbedre kan viruset terapi vises i figur 1.

Som illustrert i figur 1, er det avgjørende første skrittet å gjennomføre en høy gjennomstrømming RNAi skjerm analysen utvikling. Figur 2A gir et eksempel plate oppsett for transfection optimalisering analysen. Figur 2B består av representant bilder av forventede resultater, og figur 2C er representant plotting av forventede resultater. Etter siRNA knockdown PLK-1, et gen som induserer celledød og kan brukes som en positiv overvåke siRNA knockdown effektivitet, forventer en celle overlevelse må være mellom 0-30%, hvis cellen linjen har en lang dobling tid da det vil ta l folk å observere celle død fenotypen. Ikke målretting siRNA bør også være minimal giftig for cellene med en lignende relative overlevelse som ubehandlet celler.

Et annet nøkkelelement i analysen utvikling er å avgjøre MOI vil infisere cellene og tiden for infeksjon. Figur 3A gir et eksempel plate oppsett for å bestemme mengden av virus og lengden på inkubasjon med virus. Figur 3B viser resultatene av en live tid-kurs 786-O celler infisert med vvDD-eGFP (kan vaccinia virus uttrykke forbedret GFP med Thymidine Kinase og Vaccinia vekstfaktor gener slettet) på ulike MOIs. Representant bilder av celler som er infisert med vvDD-eGFP på en MOI av 0,05 vises i Figur 3 c. Basert på resultatene i figur 3B, kan en velge en MOI av 0,05 og en lengde på infeksjon av 21 h som dette ville tillate for påvisning av økning og nedgang i spredning som dette tidspunkt er en lineær området og den estimerte Z-faktoren på denne ti meg punkt er 0,6 kohorter som øker og kohorter som reduserer spredning. Som del av validere denne analysen, vil en fastsette cellene på denne MOI og punkt, og beregne den Z-faktoren.

Etter protokoll beskrevet, gjennomførte vi genomet hele RNAi skjermer over tre forskjellige svulst cellelinjer (f.eks OVCAR-8, U373, NCI-H226) i duplikat med en siRNA bibliotek målretting 18,120 gener15. Med metoden gal identifisert vi 1008 treff felles for minst 2 av de 3 kreftcelle linjene (figur 4A). Sti analyse av treff i skjermene avdekket anriking av medlemmer av UPR (falset protein svar) og ERAD (endoplasmatiske retikulum forbundet protein fornedrelse) veier (figur 4A). Vi valgte 10 treff i disse trasé for sekundær godkjenningen siRNA med forskjellige målretting sekvenser fra de primære skjermen (figur 4B). Som del av tertiær validering, gjennomførte vi en genetisk redning eksperimentere med IRE1α og ATF6α (aktivere transkripsjon faktor 6 alfa) å bekrefte at disse treff var på målet (figur 4C).

Figure 1
Figur 1: skjematisk av arbeidsflyten for å identifisere vert mål å forbedre kan viruset terapi. Det første trinnet er å utvikle og godkjenne en analysen for høy gjennomstrømming RNAi screening, som inkluderer optimalisere transfection betingelser for å introdusere siRNA inn i celler, bestemme den optimale mengden av virus (i.e. MOI) å infisere cellene med og lengden på inkubasjon med virus. Det andre trinnet er å gjennomføre en høy gjennomstrømming genomet-widescreen. En siRNA biblioteket målretting gener over hele genomet er plassert på microtiter plater. Cellene er så motsatt transfekterte siRNA biblioteket. Etter en 48-72 h inkubasjonstid å tillate genet stanse, celler er infisert med den optimale mengden av virus. Etter optimale lengden på inkubasjon med virus, er celler fast og farget, og deretter fotografert med et høyt innhold mikroskop. Påfølgende bildet og dataanalyse vil bidra til å identifisere tilblivelse det betydelig modulerer virus replikering, som er referert til som "treff". En sekundær validering skjerm utføres på Velg treff fra primære skjermen vanligvis bruker siRNA eller shRNA med forskjellige frø regioner. Tertiær validering eksperimenter utføres for å bekrefte at treff på målet, svulst bestemt og forbedre effekten i vivo. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: optimalisering av transfection vilkår for høy gjennomstrømming RNAi screening analysen. (A) et eksempel plate oppsett for å optimalisere transfection forhold med to forskjellige linjer. (B) representant bilder av 786-O celler (1500 celler/vel) beiset med Hoechst 33342 etter 72 h inkubasjon med transfection reagens fortynner alene (dvs. ubehandlet), hva reagens og fortynner (i.e. mock transfekterte), ikke målretting siRNA og med siRNA målretting PLK-1. (C) representant resultat transfection optimeringseksperiment viser 22% overlevelse av celler transfekterte med PLK-1 siRNA (n = 24) og 94% overlevelse av celler transfekterte med ikke målretting siRNA (n = 8). Feilfelt = ± SD, standardavvik; skalere barer = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: bestemmelse av mengden av virus og lengden på inkubasjon med virus for høy gjennomstrømming RNAi screening analysen. (A) et eksempel plate oppsett for å optimalisere mengden av virus og lengden på inkubasjon med virus. Kolonne 1 og 24 inneholder transfection kontroller og venstre er infisert. Kolonnene 2 til 23 inneholder ubehandlet celler, mock transfekterte celler og celler transfekterte med positive og negative virus Kontroller alle infisert med et utvalg av MOIs starter med ingen virus i kolonner 2 og 3. (B) 786-O celler var omvendt transfekterte med ikke målretting siRNA og ruges i 48 timer. De ble senere smittet med vvDD-GFP på MOIs angitt og fotografert 8t mellomrom starter på 5 timer etter infeksjon (hpi). Gjennomsnittlig GFP området per brønn (± SD) ble beregnet for hver tidspunkt (n = 12) og tegnes inn i diagrammet. Z-faktoren beregnes mellom punkt A og B er 0,6 Z-faktoren beregnet mellom punktene B og C er 0,6. (C) representant levende bilder av en godt infisert med en MOI av 0,05 på tidspunkt er angitt. Forstørrelsen, 10 x; 9 felt/bra; skalere barer = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: genomet-wide Screen identifiserer ER Stress respons blokaden som en Potent sensitiverende for Rhabdovirus-mediert Oncolysis. (A) Venn-diagram beskriver antall overlappende treff av høy gjennomstrømming RNAi skjermer i 3 svulst cellelinjer og en tabell (+, syntetisk dødelige;-, ingen interaksjon) og skjematisk diagram (treff beskrevet i rødt) illustrerer viktige treff i UPR og ERAD veier. (B) EF50 Skift (svarte, venstre y-aksen) var bestemt for U373-cellene behandles med Maraba virus (48 h) etter behandling med siRNA (72 h) rettet mot en rekke UPR/ERAD treff fra skjermen. Relativ mRNA uttrykk for hver genet etter siRNA knockdown (72 h) er avbildet i hvitt (høyre y-aksen). (C) cellen levedyktighet analyser ble utført 48 timer etter Maraba virusinfeksjon, i U373 celler uttrykke ectopically musen ATF6α (eller kontroll GFP) ± siRNA målretting menneskelige ATF6î± (eller ikke målretting [NT] kontroll, venstre) eller menneskelig XBP1(s) (eller kontroll ) ± siRNA målretting menneskelige IRE1î± (eller kontrollere; høyre panel). Vestlige blots demonstrere genet stanse og ektopisk genuttrykk vises. EF50 skifter = skifte i dosen av virus må drepe 50% av cellene, Feilfelt = ±SD; XBP1(s) = X-box bindende protein 1 (skjøtes); Enveis ANOVAs ble utført i (B), etterfulgt av en Bonferroni flere sammenligning post hoc test å utlede p verdier. C, ble student t-tester utført for å utlede p verdier. * p < 0,05; #p < 0,05. (Dette tallet har blitt endret fra Mahoney et al., 201115). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her presenterer vi en protokoll for å ansette høy gjennomstrømming RNAi screening å identifisere vert mål som kan manipuleres til å forbedre kan viruset terapi. Dette har blitt testet med suksess med kan Maraba virus og kan vaccinia virus, men som nevnt, det kan tilpasses for bruk med andre kan virus eller andre virus vanligvis identifisere vert gener som modulerer virus replikering. Screening protokollen er også utformet for å identifisere tilblivelse det øke eller redusere spredt, men det kan være lett modifisert for andre readouts. Våre skjermer med Maraba virus, for eksempel ble utformet for å identifisere tilblivelse modulerende oncolysis bruker en enkel resazurin-baserte viktig fargestoff analysen å score celle levedyktighet (se Figur 4)15. I disse skjermene, etter inkubasjon med virus, i stedet for feste cellene med formaldehyd og flekker med Hoechst, vi utlevert resazurin fargestoff inn hver brønn (siste konsentrasjon på 20 μg/mL) og, etter en 6 h inkubasjon vi målt absorbansen (573 nm) med en plate leseren. Vi kunne også ha brukt celle nummer basert på Hoechst flekker som en avlesning. Mens bruk surrogat reporter for å overvåke virus replikering var unødvendig i dette skjermbildet, leve et virus med en reporter protein, bestemt et fluorescerende protein lette skjermen optimalisering som en kan, for eksempel virus replikering; videre et virus med en reporter protein er mindre klumpete og kostbar enn å bruke antistoffer stain for viral antigener, men det er mulig å skjermen uten en. I tillegg kan en gjøre ytterligere endringer i analysen undersøke vert faktorer som påvirker infectivity Burststørrelse og enda mer detaljert sub fenotyper som immunologiske celledød. I hvert tilfelle, ville man følge en lignende analysen utvikling protokoll, screening strategi og sekundære og tertiære validering metoder.

I protokollen foreslår vi optimalisere transfection forhold ideelt med flere svulst cellelinjer. Det er minst to grunner for å optimalisere med flere linjer. En grunn er at ikke alle cellen linje er mottakelig for høy gjennomstrømming screening som noen kan være vanskelig å transfect eller kan ikke holder seg godt, men en viktig årsak er at screening med flere linjer for å unngå celle iboende skjevheter. Valg av linjer er i stor grad avhengig av ens mål. Man kan velge å fokusere på en bestemt kreft type eller velge ulike kreft å dekke et bredere spekter. Alternativt kan man ønsker å fokusere på svulst cellelinjer som er motstandsdyktig mot identifisere vert faktorer som kan manipuleres til å gjøre svulst celle linjene mindre motstandsdyktig mot kan smitte.

I tillegg til valg av celler linjer er valg av positive og negative virus Kontroller en viktig faktor for enhver skjerm. I noen tilfeller virus gener som kreves eller begrense replikering kan ikke være kjent, eller hvis de er kjent, kan de være celle-spesifikke. Derfor kan man fortsatt finne omtrentlig robusthet og dynamisk område av analysen ved hjelp surrogat kontroller. For eksempel kan man bruke infisert celler eller celler som er infisert med en lav MOI som et surrogat positiv kontroll for å identifisere gener som reduserer spredt på knockdown. For å identifisere gener som forbedrer spredning på knockdown, kan en infisere celler med en fortynning rekke virus, og bruke brønner med maksimal signalet som en surrogat positiv kontroll.

Utvalg av treff for sekundær skjerm validering og teknologien å ansette er en annen sak som krever nøye overveielse. Kandidater er vanligvis valgt for sekundær skjerm validering basert på omfanget av populære, på om de betydelig modulerer spredning i flere kreftcelle linjer (hvis primære skjermer ble gjennomført i flere linjer) og biologiske interesse. Bioinformatikk verktøy som DAVID22,23, PANTHER24, streng25 og PINdb26 kan bidra til å isolere stier og treff biologiske rundt. Mercer et al. 8 beskriver bruk av åpen kildekode analyseprogramvare og har også gjort tilgjengelig en algoritme som de utviklet for visualisering og analyse av treff. En faktor å ta hensyn når tolke resultatene er at genet stanse kan ha ulike virkninger avhengig av scenen i livssyklusen til virus som undersøkes. For eksempel er det mulig at knockdown med et tidlig i livsløpet kan hemme virus replikering, mens knockdown senere kan øke replikering. Ofte er tilleggsskjermer gjennomført med siRNA fra en annen leverandør med forskjellige frø regioner med flere siRNAs per genet. Men kan komplementære teknologier målretting kandidat gener anvendes som CRISPR-Cas9 eller lentivirus vektorer uttrykke shRNA.

Metoden for analyse er også en kritisk vurdering. Vi foreslår bruker robust Z-skåre eller gal20,27 med foreslått avskjær for hit ringer av > 2 eller < -2. Avskjær kan økes eller senkes avhengig av om fokus er på å eliminere flere falske positiver eller fange flere falske negativer. For eksempel i siste høy gjennomstrømming skjermen med vaccinia virus9, ble lavere cut-off satt på-1.5 (ingen øvre avskjær ble beskrevet som fokus var på identifiserer gener som redusert spredning på knockdown). Det finnes også andre metoder som kan brukes som z-skåre, SSMD (strengt standardisert bety forskjellen) og B score20,28,29,30. Barrows et al.31 sammenlignet truffet listene generert av summen rang, MAD, z-skåre og SSMD og fant hver metode analyse resulterte i forskjellige truffet listene. I toto, det er ingen perfekt metoden eller cut-off. Til slutt, sekundær skjerm validering og tertiær validering studier bekrefter sant treff.

Metoden for å filtrere ut cytotoksiske treff må også vurderes. En måte er å gjennomføre primære skjermer i parallell pluss eller minus virus. Dette gjør påvisning av siRNAs som er cytotoksisk på egenhånd. Dette var vår tilnærming i vår Maraba virus skjermer15; men er dette ikke ofte praktisk. Kanskje er en mer praktisk metode, er robust, å finne treff som er cytotoksisk som del av videregående skjermen validering, spesielt hvis fokus er å identifisere treff at nedgang replikering på knockdown. For eksempel i hele genomet primære skjermen med Myxoma virus, Teferi et al. 11 identifisert 1,588 siRNAs som redusert virus replikering på knockdown. Hvis du vil filtrere ut cytotoksisk siRNAs, gjennomførte de en sekundær cytotoksisitet skjerm med disse siRNAs; de målte celle levedyktighet 72 h etter hva bruker en resazurin-baserte celle levedyktighet analysen. Cytotoksisk siRNAs ble identifisert basert på Z-poengsummen ≤-1.96. Du bare filtrerer ut cytotoksisk siRNAs fra primære screening data basert på en reduksjon av celle nummer en bestemt prosent, for eksempel av en reduksjon > 50% som Sivan et al. 9, eller basert på en bestemt poengsum som Lee et al. 14; i sin studie av vert faktorer kreves for vesicular stomatitt virus replikering, ekskludert de siRNA treff som redusert celle levedyktighet av > 3.0 standard avvik fra gjennomsnittet. Gjennomsnittlig antall celler ble fastsatt basert på den Hoechst flekker av cellen kjerner, og selv om ikke uttrykkelig, gjennomsnittet var tilsynelatende beregnet på per plate basis som det er klart at gjennomsnittet GFP signalet var beregnet på per plate basis.

En begrensning av noen høy gjennomstrømming RNAi skjermen er hyppige høyt antall falske positive og negative, som kan komme av analysen design, teknologien brukes eller systematiske feil. For eksempel et protein kan påvirke replikering av viruset, men tid til å slå av genet er for kort gitt protein's half-life å oppdage sin effekt som fører til en falsk negativt i kraft av analysen design. Det er godt etablert at ufullstendig knockdown og off-målet effekten av siRNA teknologi kan også introdusere falske positive og negative. Systematiske feil, for eksempel kanteffekt32, kan generere misvisende resultater også. Her kan signalet i ytre brønnene av platen være systematisk høyere eller lavere enn resten av platen på grunn av fordamping. Det er strategier til adresse noen av disse problemer inkludert, for eksempel: redusere konsentrasjonen av siRNA å redusere off-målet effekter33, konfigurere plate oppsett for å fylle de ytre brønnene med media å redusere edge effect eller ansette beregningsorientert metoder som er utviklet for å oppdage og motvirke systematiske feil som de kanteffekt32,34,35. En generell metode å håndtere falske positiver er å drive en sekundær skjerm etter primære skjermen. Som en måte å håndtere feilaktige negativer, kan en slappe av cut-off for hit ringer, og inkluderer potensielt falske negative for sekundær screening. Dette, selvfølgelig, vil ikke fange falske negative som er godt under cut-off. Primære skjermer bør også utføres i to og tre eksemplarer begrense falske resultater. Til slutt, uansett hvilke strategier brukes, ikke høy gjennomstrømming skjermen identifiserer grundig alle sanne treff, men det kan gi en skattekiste av data som er en sannsynlig meg noen verdifulle treff som kan være aktivert på.

I denne protokollen beskrev vi bruk av plassert siRNA og shRNA teknologi, men et annet alternativ er bruk av grupperte shRNA og CRISPR-Cas9-biblioteker. Et gruppert shRNA bibliotek var ansatt i Workenhe et al. 12 studie beskrevet i innledningen. Grupperte CRISPR-Cas9-teknologien har vært brukt til å utføre genomet skala skjermer for å identifisere vert faktorer kreves for replikering av virus som Zika virus36, West Nile virus37,38, dengue virus39 og hepatitt C virus39. Fordelen med å bruke grupperte biblioteker er at de er billigere for å kjøpe, ikke krever spesialisert infrastruktur (f.eks væske håndtering enheter, høyt innhold mikroskop og robot-utstyr), eller har de høye kostnadene ved drift og opprettholde denne infrastrukturen, og de krever færre forbruksvarer. Ulempen er at de readouts er mer begrenset. Høyst dersom ikke alle grupperte biblioteket vert-virus samhandling skjermer hittil er er avlesning cellen levedyktighet eller mangelen på dem; man kan lett sonde for mer komplekse fenotyper. Valg av format, avhenger av biologiske spørsmålet blir stilt.

Fremskritt innen genetisk screening teknologi de siste tiårene at første aktivert skjermer i bakterier og gjær til nå dagens genomet skala skjermer i menneskeceller har åpnet døren på vidt for oppdagelse i ulike felt av studien. Disse genetiske skjermene har ikke bare tillatt oss å svare på grunnleggende biologi spørsmål, men har gitt oss for å låse opp innsikt i utvikle og forbedre biotherapeutics. Mens det er fortsatt lærdom å lære og utfordringer overvinnes med denne teknologien, har resultatene hittil vært spennende. Funn vil trolig bli enda større som romanen screening teknologi inkludert CRISPR-Cas9 biblioteker, microfluidics og i vivo screening teknologier fortsette å modnes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Ontario Institutt for kreftforskning, Canada grunnlaget for innovasjon, Ottawa regionale Cancer Foundation og Terry Fox Research Institute. K.J.A. ble støttet av en Vanier Canada Graduate Scholarship, en kanadisk Institute for Health Research-Master-prisen, og en Ontario Graduate Scholarship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumables
siRNA library GE Dharmacon G-005005-02
Corning 384-well plate Corning 3985
Falcon 384-well plate Becton Dickinson 353962
Water Sigma W4502
siGenome SMARTpool PLK1 GE Dharmacon M-003290-01
AllStars Negative Control siRNA Qiagen SI03650318
siGenome Non-targeting siRNA Pool #2 GE Dharmacon D-001206-14-20
DMEM/HIGH Glucose GE Healthcare Life Sciences SH30022.01
Fetal Bovine Serum Sigma F15051-500ML
HEPES solution (1M) Sigma H3535-100ML
Penicillin-Streptomycin 100X solution GE Healthcare Life Sciences SV30010
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific 2500056
DPBS/Modified GE Healthcare Life Sciences SH30028.02
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778100
Oligofectamine Thermo Fisher Scientific 1225011
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 22600-050
Resazurin sodium salt Sigma R7017-5G
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H21492
Formaldehyde (37% by weight) Fisher Scientific F79-4
500 ml bottles Corning 430282
Adhesive Sealing Film For Microplates Excel Scientific 361006007
Peelable Heat Sealing Foil Thermo Fisher Scientific AB-3720
BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette Fisher Scientific 11-120-625
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
MicroFlo Select (liquid dispenser) Fisher Scientific 11120621
BioTek Synergy HT plate reader Biotek N/A
Opera Imaging and Analysis Instrument PerkinElmer HH10000115
KiNEDx Robotic Arm Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) KX-300-660
Cytomat 24C Series Automated Incubator Thermo Fisher Scientific 50080227
JANUS Automated Workstation PerkinElmer AJI4M01
Plate Carousel Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) N/A
Alps 3000 plate sealer Thermo Fisher Scientific AB-3000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cherry, S. What have RNAi screens taught us about viral-host interactions? Curr. Opin. Microbiol. 12 (4), 446-452 (2009).
  2. Panda, D., Cherry, S. Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions. Curr. Opin. Virol. 2 (6), 784-792 (2012).
  3. Houzet, L., Jeang, K. T. Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis. Exp. Biol. Med. 236 (8), 962-967 (2011).
  4. Friedel, C. C., Haas, J. Virus-host interactomes and global models of virus-infected cells. Trends Microbiol. 19 (10), 501-508 (2011).
  5. Gao, S., Yang, C., et al. Applications of RNA interference high-throughput screening technology in cancer biology and virology. Protein Cell. 5 (11), 805-815 (2014).
  6. Kilcher, S., Mercer, J. Next generation approaches to study virus entry and infection. Curr. Opin. Virol. 4, 8-14 (2014).
  7. Ramage, H., Cherry, S. Virus-Host Interactions: From unbiased genetic screens to function. Annu. Rev. Virol. 2 (1), 497-524 (2015).
  8. Mercer, J., Snijder, B., et al. RNAi screening reveals proteasome- and Cullin3-dependent stages in vaccinia virus infection. Cell Rep. 2 (4), 1036-1047 (2012).
  9. Sivan, G., Martin, S. E., et al. Human genome-wide RNAi screen reveals a role for nuclear pore proteins in poxvirus morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (9), 3519-3524 (2013).
  10. Beard, P. M., Griffiths, S. J., et al. A loss of function analysis of host factors Influencing vaccinia virus replication by RNA Interference. PLoS ONE. 9 (6), e98431 (2014).
  11. Teferi, W. M., Dodd, K., Maranchuk, R., Favis, N., Evans, D. H. A whole-genome RNA interference screen for human cell factors affecting myxoma virus replication. J. Virol. 87 (8), 4623-4641 (2013).
  12. Workenhe, S. T., Ketela, T., Moffat, J., Cuddington, B. P., Mossman, K. L. Genome-wide lentiviral shRNA screen identifies serine/arginine-rich splicing factor 2 as a determinant of oncolytic virus activity in breast cancer cells. Oncogene. 35 (19), 2465-2477 (2015).
  13. Panda, D., Das, A., et al. RNAi screening reveals requirement for host cell secretory pathway in infection by diverse families of negative-strand RNA viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (47), 19036-19041 (2011).
  14. Lee, A. S. -Y., Burdeinick-Kerr, R., Whelan, S. P. J. A genome-wide small interfering RNA screen identifies host factors required for vesicular stomatitis virus infection. J. Virol. 88 (15), 8355-8360 (2014).
  15. Mahoney, D. J., Lefebvre, C., et al. Virus-tumor interactome screen reveals ER stress response can reprogram resistant cancers for oncolytic virus-triggered Caspase-2 cell death. Cancer Cell. 20 (4), 443-456 (2011).
  16. Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. A call to arms: Using RNAi screening to improve oncolytic viral therapy. Cytokine Growth Factor Rev. 21 (2-3), 161-167 (2010).
  17. Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. Functional genomic screening to enhance oncolytic virotherapy. Br. J. Cancer. 108 (2), 245-249 (2012).
  18. Allan, K. J., Stojdl, D. F., Swift, S. L. High-throughput screening to enhance oncolytic virus immunotherapy. Oncolytic Virother. 5, 15-25 (2016).
  19. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8 (5), 566-570 (2003).
  20. Birmingham, A., Selfors, L. M., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6 (8), 569-575 (2009).
  21. Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  22. Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
  23. Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).
  24. Thomas, P. D., Campbell, M. J., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
  25. Szklarczyk, D., Morris, J. H., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D362-D368 (2017).
  26. Luc, P. -V., Tempst, P. PINdb: a database of nuclear protein complexes from human and yeast. Bioinformatics. 20 (9), 1413-1415 (2004).
  27. Chung, N., Zhang, X. D., et al. Median absolute deviation to improve hit selection for genome-scale RNAi screens. J. Biomol. Screen. 13 (2), 149-158 (2008).
  28. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z Score, SSMD*, z* Score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
  29. Zhang, X. D., Lacson, R., et al. The use of SSMD-based false discovery and false nondiscovery rates in genome-scale RNAi screens. J. Biomol. Screen. 15 (9), 1123-1131 (2010).
  30. Amberkar, S. High-throughput RNA interference screens integrative analysis: towards a comprehensive understanding of the virus-host interplay. World J. Virol. 2 (2), 18-31 (2013).
  31. Barrows, N. J., Le Sommer, C., Garcia-Blanco, M. A., Pearson, J. L. Factors affecting reproducibility between genome-scale siRNA-based screens. J. Biomol. Screen. 15 (7), 735-747 (2010).
  32. Carralot, J. -P., Ogier, A., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28 (2), 261-268 (2011).
  33. Caffrey, D. R., Zhao, J., et al. siRNA off-target effects can be reduced at concentrations that match their individual potency. PLoS ONE. 6 (7), e21503-e21511 (2011).
  34. Makarenkov, V., Zentilli, P., Kevorkov, D., Gagarin, A., Malo, N., Nadon, R. An efficient method for the detection and elimination of systematic error in high-throughput screening. Bioinformatics. 23 (13), 1648-1657 (2007).
  35. Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Brief. Bioinform. 16 (6), 974-986 (2015).
  36. Savidis, G., McDougall, W. M., et al. Identification of Zika virus and dengue virus dependency factors using functional genomics. Cell Rep. 16 (1), 232-246 (2016).
  37. Ma, H., Dang, Y., et al. A CRISPR-Based screen identifies genes essential for West-Nile-virus-induced cell death. Cell Rep. 12 (4), 673-683 (2015).
  38. Zhang, R., Miner, J. J., et al. A CRISPR screen defines a signal peptide processing pathway required by flaviviruses. Nature. 535 (7610), 164-168 (2016).
  39. Marceau, C. D., Puschnik, A. S., et al. Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens. Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).

Tags

Kreftforskning problemet 134 kan virus RNAi skjerm høy gjennomstrømming kreft vaccinia rhabdovirus celle vert funksjonell genomforskning
Genomet hele RNAi Screening å identifisere vert faktorer som modulerer kan viruset terapi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Allan, K. J., Mahoney, D. J., Baird, … More

Allan, K. J., Mahoney, D. J., Baird, S. D., Lefebvre, C. A., Stojdl, D. F. Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy. J. Vis. Exp. (134), e56913, doi:10.3791/56913 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter