Summary
Hier beschrijven we een protocol voor de toepassing van high-throughput RNAi screening te ontdekken van de doelen van de gastheer die kunnen worden gemanipuleerd om het verbeteren van oncolytische virus therapie, specifiek rhabodvirus en vaccinia virus therapie, maar het kan gemakkelijk aangepast worden aan andere oncolytische virus platformen of voor het ontdekken van host-genen die virus replicatie in het algemeen moduleren.
Abstract
High-throughput genoom-brede RNAi (RNA-interferentie) screening technologie is wijd verbeid gebruikt om gastheer factoren die van invloed zijn virus replicatie te ontdekken. Hier presenteren we de toepassing van deze technologie op blootleggen host doelen die specifiek het moduleren van de replicatie van Maraba virus, een oncolytische rhabdovirus en vacciniavirus met als doel verbetering van de therapie. Terwijl het protocol is getest voor gebruik met oncolytische Maraba virus en oncolytische vacciniavirus, deze aanpak geldt voor andere oncolytische virussen en kan ook worden gebruikt voor de identificatie van de host-doelen die moduleren virus replicatie in zoogdiercellen in algemene. Dit protocol beschrijft de ontwikkeling en validatie van een assay voor high-throughput RNAi screening in zoogdiercellen, belangrijke overwegingen en voorbereiding maatregelen belangrijk zijn voor het uitvoeren van een primaire high-throughput RNAi scherm, en een stapsgewijze handleiding voor uitvoeren van een primaire high-throughput RNAi scherm; Bovendien is het in grote lijnen schetst voor de methoden voor de uitvoering van de secundaire scherm validatie en tertiaire validatieonderzoek. Het voordeel van high-throughput RNAi screening is dat het maakt het mogelijk een catalogus, in een uitgebreide en onbevooroordeelde manier, gastheer factoren die enig aspect van virus replicatie waarvoor een een in vitro assay zoals infectiviteit ontwikkelen kan, moduleren barsten grootte, en cytotoxiciteit. Het heeft de bevoegdheid om te ontdekken van biotherapeutic doelstellingen onvoorziene op basis van de huidige kennis.
Introduction
High-throughput genoom-brede RNAi screening is gebleken een instrument van onschatbare waarde voor het openbaren van biologische inzichten in diverse gebieden van studie, met inbegrip van virus biologie. In de afgelopen tien jaar of zo, talrijke groepen hebben zich ertoe verbonden cel-gebaseerde grootschalige RNAi screening om te identificeren uitgebreid host genen die virus replicatie (herzien in1,2,,3,4 moduleren , 5 , 6 , 7). interessant, een groot aantal van deze schermen zijn uitgevoerd in kankercellen en diverse met virussen die zijn huidige oncolytische virus kandidaten waaronder vaccinia virus8,9,10 , Myxoma virus11, herpes simplex virus12,13,,14van de virus van de vesiculaire stomatitis en Maraba virus15. Terwijl de focus van de meerderheid van deze studies was op het identificeren van gastheer factoren die invloed hebben op bepaalde aspecten van de replicatie van het virus en niet op het identificeren van biotherapeutic doelstellingen ter verbetering van de oncolytische virus therapie, kan waardevolle gegevens worden gedolven uit deze data sets in dit verband. Het is duidelijk dat het krachtige potentieel te identificeren host doelen die kunnen worden gemanipuleerd om het verbeteren van oncolytische virus therapie heeft niet ten volle zijn benut.
Een overvloed aan oncolytische virus platformen worden momenteel getest in preklinische en klinische studies met inbegrip van herpes simplex virus, reovirus en vaccinia virus, die aantoonbaar succes in laat-stadium klinische proeven hebben gehad. Voor de meerderheid van deze platforms, hebben inspanningen zijn gericht op het veranderen van het genoom van het virus ter verbetering van de therapie. Bijvoorbeeld het vergroten van tumor specificiteit, zijn specifieke virus genen verwijderd of gemuteerd om aanzienlijk beperken van virale replicatie in normale cellen, maar niet in tumorcellen. In sommige gevallen transgenen bijgekomen zoals GM-CSF (granulocyt macrofaag kolonie-stimulerende factor) te versterken het immuunrespons of NIS (natrium jodide symporter) in vivo imaging en cellulaire radioiodide opname inschakelen voor therapeutische doeleinden. Echter is er zeer weinig werk, gericht op het manipuleren van genen van de gastheer/tumor en het verkennen van de impact van gastheer/tumor genen op oncolytische virus replicatie. Met de komst van high-throughput screening technologie, is het nu mogelijk om te sonderen virus-gastheer interacties op de schaal van een genoom en te ontcijferen van mogelijkheden voor het manipuleren van het genoom van de gastheer om oncolytische virus therapie (herzien in16, 17,,18).
We gemeld de eerste studie demonstrerende proof-of-concept voor het gebruik van high-throughput genetische screening ter identificatie van de host-doelen die kunnen worden gemanipuleerd om het verbeteren van oncolytische virus therapie. Om te ontdekken van host-genen die moduleren Maraba virus oncolysis, een oncolytische rhabdovirus momenteel getest in fase I en II proeven, voerden we genoom-brede RNAi schermen over drie verschillende tumor cellijnen in tweevoud met een siRNA (korte inmenging van RNA) bibliotheek gericht op 18,120 genen15. Traject analyse van hits geïdentificeerd in de schermen geopenbaard verrijking van leden van het ER (endoplasmatisch reticulum) stress reactie trajecten. Wij hebben 10 hits binnen deze trajecten voor secundaire validatie met behulp van siRNA met verschillende targeting sequenties van die van het primaire scherm hebt geselecteerd. Als onderdeel van de tertiaire validatie, voerden we een redding experiment met IRE1α (inositol-vereisen enzym 1 alpha) om te bevestigen dat de hit op doel was. In vitro en in vivo tests met een klein molecuul inhibitor van IRE1α resulteerde in sterk verbeterde oncolytische werkzaamheid.
Workenhe et al. 12 leidee een genoom-brede RNAi scherm met behulp van een gebundelde lentivirale shRNA (korte haarspeld RNA) bibliotheek gericht op 16,056 genen te identificeren gastheer factoren beperken het menselijke herpes simplexvirus type 1 (HSV-1) mutant KM100-gemedieerde oncolysis van borst kankercellen. In het primaire scherm ze geïdentificeerd 343 genen de knockdown van die leiden tot verbeterde cytotoxiciteit van KM100-geïnfecteerde cellen over mock-geïnfecteerde cellen; ze geselecteerd 24 van deze genen voor secundaire validatie. Uit de 24 genen, 8 genen werden bevestigd in de secundaire scherm met één van hen wordt SRSF2 (serine/arginine-rijke splicing factor 2) die werd vervolgens bevestigd met behulp van een genetische redding experiment tijdens de tertiaire validatie. De groep ging naar het identificeren van een DNA topoisomerase remmer chemotherapeutische dat verminderd de fosforylatie van SRSF2 en is gebleken dat de behandeling van de combinatie van HSV-1 KM100 met dit remmer leidde tot uitgebreide voortbestaan van TUBO tumor-dragende muizen.
In de bovengenoemde studies volgde een soortgelijke workflow. Elk begon met een primaire genoom-brede RNAi scherm gevolgd door een secundaire scherm op een select aantal hits geïdentificeerd in het primaire scherm. Dit werd gevolgd door tertiaire validatieonderzoek, waaronder om te bevestigen dat de hit op de doelsoort was redden door het uitvoeren van genetische experimenten in vitro met uiteindelijke validatie uitgevoerd door het manipuleren van de target gene product in vivo. In dit artikel geven we eerst een algemeen protocol voor de ontwikkeling en validatie van een high-throughput siRNA-screening test, waarbij sprake is van een vaststelling van de voorwaarden van de optimale transfectie, hoeveelheid virus en de duur van de infectie. Wij bieden ook een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van een primaire, een high-throughput siRNA scherm evenals een algemene beschrijving van de methode voor het uitvoeren van validatie van de secundaire scherm en tertiaire validatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ontwikkeling en validatie van een siRNA van de high-throughput screening test
Opmerking: Voor alle experimenten, groei Hepes-buffer media geschikt is voor elke cel-regel gebruiken. Zie afbeelding 1 voor een overzicht van de workflow van assay optimalisatie tot tertiaire validatie.
- Vaststelling van de voorwaarden van de optimale transfectie
- Selecteer een tumor cellijn of een ideale meerdere tumor cellen lijnen waarmee het optimaliseren van de transfectie voorwaarden (bijvoorbeeld 786-O, NCI-H226, SF268, U373, OVCAR-8, U20S; Zie voor meer informatie over de selectie van cellijnen discussie).
- Selecteer een transfectiereagens of meerdere om te testen. Wellicht om te testen verschillende transfectie reagentia, zoals sommigen meer toxische of efficiënter dan anderen in een bepaalde cel-lijn wellicht. Ook, houd er rekening mee dat sommige invloed kunnen zijn op virusinfectie of hoge achtergrond signaal op imaging genereren kan.
- Beslissen over positieve [e. g. PLK-1(Polo Like Kinase 1) mRNA, die celdood induceert targeting siRNA] en negatieve transfectie controles (bijvoorbeeld niet-targeting siRNA).
- Het omgekeerde transfectie protocol voor de bijzondere transfectiereagens volgen, maar variëren van de hoeveelheid transfectiereagens (bijvoorbeeld 0.05, 0.1, 0,15 en 0.2 μl per putje) en cel zaaien dichtheden (bijvoorbeeld 625, 1250, 2500 cellen per putje). Opnemen van replicaat-organismen onder de volgende omstandigheden: onbehandeld cellen, mock transfected cellen (d.w.z. cellen plus transfectiereagens) en cellen transfected met positieve en negatieve transfectie controle siRNA (Zie figuur 2A voor een monster plaat lay-out).
- In het algemeen, maak 80 nM verdunningen voor elk siRNA voor een uiteindelijke concentratie in de put van 10 nM (afhankelijk van de bibliotheek, een hogere concentratie van siRNA worden vereist). Tenzij anders aangegeven, Verdun siRNA met de transfectiereagens verdunningsmiddel. Maak verdunningen van het transfectiereagens.
- Pipetteer 5 μL van siRNA per putje gevolgd door 5 μL van verdunde transfectiereagens. Ter vergemakkelijking van deze stap, verdelen langs een kolom met een U-onder 96-wells-plaat, de siRNA mixen en de siRNA verdunningsmiddel alleen (voor onbehandeld en mock transfected cellen). Verdelen langs een tweede kolom en het verdunde transfectiereagens transfectie reagens verdunningsmiddel alleen (voor onbehandelde cellen).
- Met behulp van een elektronische Pipetteer, Pipetteer 5 μl per putje van de inhoud van de eerste kolom met siRNA of siRNA verdunningsmiddel in de overeenkomstige putjes van de plaat 384-well gevolgd door 5 μl per putje van de verdunde transfectiereagens of transfectiereagens verdunningsmiddel van de tweede kolom.
- Centrifugeer de platen bij 1026 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur, en incubeer gedurende de tijd die is voorgeschreven voor de transfectiereagens (bijvoorbeeld 5-20 min).
- Terwijl de platen aan het broeden zijn, bereiden cel schorsingen van verschillende dichtheden. Pipetteer 30 μL van celsuspensie per putje. Voordat u de platen plaatst in de incubator, laat u de platen zitten gedurende 45-60 minuten bij kamertemperatuur te voorzien in het uniforme regelen van cellen19.
Opmerking: Als de incubatietijd voorgeschreven voor het transfectiereagens met siRNA kort is, bereiden de schorsingen van de cel voor de incubatie. - Incubeer gedurende 48 tot 72 uur afhankelijk van de gewenste lengte van knockdown gekozen voor het scherm.
- Een vaststelling en kleurstofoplossing bestaande uit formaldehyde, Hoechst 33342 en PBS (phosphate buffered saline) voor een uiteindelijke concentratie in elk putje van 4% formaldehyde en 5 mg/mL van Hoechst 33342 voorbereiden. Zo nodig, probeer een hoger (bijvoorbeeld 7,5 mg/mL) of de lagere concentratie (bv 2 ug/mL) Hoechst als het signaal te zwak of te sterk, respectievelijk.
- Afzien 30 μL van de vaststelling en kleuring oplossing direct in alle putjes. Incubeer de platen gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Opslaan van de platen bij 4 ° C. Als u een niet-confocal microscoop, spoel de platen met PBS met behulp van een plaat wasmachine; in de meeste gevallen is wassen niet nodig bij gebruik van een confocal microscoop.
- Ontwikkelen een script om te kwantificeren van het aantal cellen per putje.
Opmerking: Er zijn verschillende software suites beschikbaar voor dit doel en, terwijl elk verschillende manieren van het genereren van scripts hebben kan, zij allen hebben over het algemeen een middel van identificeren kernen, cellen en regio's van belang evenals de berekening van de steunintensiteit en morfologische eigenschappen. Bij het ontwikkelen van een screening script, is het belangrijk dat de tijd die nodig is voor het uitvoeren van het script per plaat en misschien ook alleen essentiële afmetingen om te minimaliseren van de verwerkingstijd. Bijvoorbeeld om te kwantificeren celaantal, misschien een berekenen van de oppervlakte van Hoechst per putje boven een opgegeven intensiteit; en om te kwantificeren virus verspreiding, men kan het berekenen van de oppervlakte van de (groen fluorescent proteïne) GFP per putje boven een opgegeven intensiteit. Het "hervormingspakket neer" script moet worden vergeleken met de meer uitgebreide script om ervoor te zorgen dat geen essentiële informatie is verloren. - Analyseren van de resultaten om te bepalen van de optimale transfectie voorwaarden, thats de transfectie reagens bedrag en de cel zaaien dichtheid die resulteert in aanzienlijke celdood (0-30% de overleving van de cel) en is minimaal giftig voor de cellen (bijvoorbeeld 90-100% overleving van de cel). Opmerking: Kan het langer duren te observeren de cel dood fenotype in cellijnen met lange verdubbeling times. Zie figuur 2B en 2 C voor representatieve resultaten. Ook zorgen dat de cellen transfected met niet-targeting siRNA zijn ongeveer 90-100% heuvels ten tijde van fixatie later wil een cellen die van deze confluentie infecteren.
- Bepaling van de optimale hoeveelheid virus en lengte van infectie
- Voert u dezelfde omgekeerde transfectie stappen zoals beschreven hierboven (zie 1.1.4.1 aan 1.1.4.4); alleen de optimale transfectie voorwaarden (zie 1.1.8) echter wel gebruiken (bijvoorbeeld voor 786-O cellen: 1500 cellen per putje en 0,05 μl per putje van RNAiMAX) en daarnaast bevatten extra wells besmetting met virus [bijvoorbeeld putjes met onbehandelde cellen, mock transfected cellen, cellen transfected met niet-targeting siRNA en cellen transfected met positieve virus besturingselementen als degenen bekend zijn (dat wil zeggen siRNA gericht op host-genen die zal remmen of verbeteren van replicatie) in].
- Figuur 3A Zie voor een voorbeeld plaat lay-out. Incubeer gedurende 48-72 uur.
- De extra virus putten infecteren met een virus van de oncolytische uiting geven aan een fluorescerende verslaggever eiwit (bijvoorbeeld GFP) met een bereik van multipliciteit van infectie (MOIs) (bijvoorbeeld 0.001 tot en met 10; Het gekozen bereik worden afhankelijk van het niveau van resistentie of gevoeligheid van de cellijn.). Niet-geïnfecteerde putten ook omvatten. Pipetteer 40 μL van elke verdunning virus per putje voor een eindvolume van 80 μL. Centrifugeer elke plaat 400 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Volgende infectie, afbeelding de cellen met een hoge-content leven, geautomatiseerde Microscoop regelmatig (bijvoorbeeld elke 4-8 h). Zie figuur 3B en 3 C.
- Ontwikkelen een script om te kwantificeren virus verspreiding (bijvoorbeeld GFP gebied per putje) (zie 1.1.7). Analyseren van de beelden en selecteer een tijdstip en een MOI die voldoende zijn voor de detectie van verhogingen en verminderingen van verspreiding. De tijd-point en de daling van de MOI binnen een lineaire reeks te vergemakkelijken opsporing van kleine veranderingen in de verspreiding zorgen. Schatten van de Z-factor (of Z') voor de gegeven tijd-punt en de MOI.
Opmerking: Geschat Z-factor 1-3 (σp + σn) = / | μp- μn| waarbij σp is de standaarddeviatie van de steekproef van de besturingselementen van het positieve virus en σn is de standaarddeviatie van de steekproef van het negatieve virus controles; en μp is het gemiddelde van de steekproef van het positieve virus besturingselementen en μn het steekproefgemiddelde van de negatieve controles. Een geschatte Z-factor van 0,5 - 1.0 is beschouwd als een uitstekende analyse en geschikt voor het screenen van20,21. - Bevestigen dat de negatieve virus control siRNA geen invloed op de replicatie van het virus heeft door te vergelijken met de mock transfected en onbehandeld putten. Het is vaak nodig voor het testen van meerdere negatieve controles als sommige negatieve siRNA besturingselementen gevolgen voor de replicatie van het virus hebben kunnen.
- Voert u dezelfde omgekeerde transfectie stappen zoals beschreven hierboven (zie 1.1.4.1 aan 1.1.4.4); alleen de optimale transfectie voorwaarden (zie 1.1.8) echter wel gebruiken (bijvoorbeeld voor 786-O cellen: 1500 cellen per putje en 0,05 μl per putje van RNAiMAX) en daarnaast bevatten extra wells besmetting met virus [bijvoorbeeld putjes met onbehandelde cellen, mock transfected cellen, cellen transfected met niet-targeting siRNA en cellen transfected met positieve virus besturingselementen als degenen bekend zijn (dat wil zeggen siRNA gericht op host-genen die zal remmen of verbeteren van replicatie) in].
- Uiteindelijke validatie van de high-throughput screening test
- Herhaal stappen 1.2.1 en 1.2.2 hierboven, maar alleen deze keer verpesten cellen met de optimale MOI. In plaats van levende imaging, vast en vlekken van de plaat (zoals beschreven in 1.1.5 en 1.1.6) op het optimale tijdstip (zie 1.2.4).
- Het imago van de plaat. Analyseren van de resultaten met behulp van hetzelfde script dat zal worden gebruikt voor het scherm (zie 1.1.7 en 1.2.4). Bevestig de voorwaarden van de transfectie (dat wil zeggen goede knockdown in putten transfected met positieve transfectie controle en minimale toxiciteit in putten transfected met negatieve transfectie controle). Schatten van de Z-factor om te bepalen van de robuustheid van de test (zie 1.2.4).
- Verder te worden getest en overwegingen voor het uitvoeren van high-throughput screening
- Test de duurzaamheid van de microtiterplaat platen zoals sommige platen tijdens centrifugeren, kraken kunnen vooral wanneer de deksels worden gehouden op en meerdere platen worden gecentrifugeerd tegelijk. Centrifugeer zonder de deksels te verminderen kraken (mits de platen zeehonden), het aantal platen per emmer gecentrifugeerd of verkleinen.
- Test de stabiliteit van de transfectie reagens mix na verloop van tijd. Zodra de transfectiereagens wordt toegevoegd aan de platen, kan er een aanzienlijke vertraging voordat de toevoeging van cellen; het is daarom belangrijk om te weten van de periode waarvoor de transfectie reagens mix zal effectief blijven. Voor het scherm, is het wellicht nodig om te bereiden cellen voorafgaand aan de transfectie reagens mix toe te voegen aan de platen.
- Voorbereiden met behulp van de vloeistof dispenser. Bepalen van de volumes moeten afzien transfectiereagens, cellen, virus, en op te lossen rekening houdend met het volume dat de slang bezit, het volume verloor verstrekking vooraf (indien de eenheid over deze functie beschikt), en het restvolume vereist in de flessen gebruikt voor tapinstallaties.
- Instellen en testen van de programma's die worden gebruikt voor de verstrekking van transfectiereagens, cellen en virus. Om te minimaliseren van het verlies van transfectiereagens, limiet, indien mogelijk, het aantal vooraf uitdeelt. Vast een protocol voor de vloeistof dispenser kalibreren en testen van de nauwkeurigheid en precisie.
- Voorbereiden op de bulk aflevering transfectiereagens, cellen en virus
- Bepaal eerst het aantal platen worden verwerkt in een batch, gezien het aantal platen van cellen die redelijkerwijs in een keer kunnen worden trypsinized, het aantal microtiterplaat platen die kunnen worden gecentrifugeerd tegelijk, de lengte van de tijd die nodig is voor het verwerken van één partij platen met de vloeistof dispenser, en ook de tijd die nodig is voor de beeldvorming. Opmerking: In het algemeen ongeveer 30 platen tegelijk verwerken is heel haalbaar en verwerking van 3 loten van platen is beheersbaar in één dag.
- Empirisch Controleer of het volume van transfectiereagens vereist voor het verwerken van één partij van platen. Test die dit volume voldoende door verstrekking 5 μL van gedestilleerd water meerdere keren over één plaat het equivalent aantal malen die nodig zijn is voor het verwerken van één partij.
- Om te verzekeren de gelijkmatige verdeling van cellen, schatting van de tijd die nodig is om cellen in één partij van platen. Een fles met het volume van cellen die nodig zijn voor een batch voor te bereiden, en afzien van de cellen in meerdere kolommen van een plaat op een moment, op gezette tijden in de dezelfde loop van de tijd die het duurt om te beslissen over een batch van platen. Test hoe vaak het moet mengen de cellen om een gelijkmatige verdeling van de cellen.
- Om te verzekeren de gelijkmatige verdeling van virus, herhaal dezelfde procedure als hierboven (zie 1.4.4.3), maar ditmaal toedieningseenheden virus op confluente wells. Als het virus is niet gelijkmatig verdeeld, kunt u overwegen de voorbereiding van het virus in de conische buisjes en vortexing elke buis vóór de verstrekking.
- Het bijhouden van de groei van cellen om te bepalen van de tijdlijn voor de teelt van genoeg cellen voor het scherm. Ook de gemiddelde aantal cellen die kunnen worden geoogst per plaat van cellen groeien in logboek fase om de schatten van het nummer dat vereist is voor het scherm te kunnen bepalen.
- Laatste voorbereiding stappen voor high-throughput screening
- Omhoog tot een maand vóór de aanvang van de voorstelling alle bepalen van de materialen die nodig zijn voor het scherm. Bestel alle benodigde reagentia (Zie materiaal). Zorgen voor de benodigde hoeveelheid virus is aan kant (bij voorkeur gebruiken hetzelfde bestand dat werd gebruikt tijdens de optimalisatie).
- Tot twee weken vóór aanvang van de voorstelling ontdooien en de cellen die nodig zijn voor het scherm opgroeien. Zorgen voor de beschikbaarheid van de centrifuge en vierkante centrifuge emmers.
- Tijdens de week vóór screening, voorbereiden op media flessen de omgekeerde transfectie en infectie, een voorraad van 70% ethanol, 2 X transfectie reagens verdunningsmiddel (bv 2 X Opti-MEM), indien nodig (bijvoorbeeld als de bibliotheek van siRNA wordt verdund RNase-free water, één zult willen gebruiken 2 X naar transfect cellen), en aliquots van virus (één per batch van platen). Controleer of de toestand van de cellen.
- Bereiden van een stamoplossing van Hoechst 33342 vlek (bijvoorbeeld 5 mg/mL). Bereiden een evenwicht plaat als een vereist voor centrifugeren zijn zal.
- Zorg ervoor de plaat wasmachine in goede staat verkeert als het zal worden gebruikt. Zorg ervoor dat de vloeistof dispenser is goed gekalibreerd en verstrekking nauwkeurig en precies. Ook, Controleer dat de programma's zijn goed ingesteld op de vloeistof dispenser.
2. uitvoeren van de primaire hoge doorvoer-scherm
Opmerking: Voordat het RNAi-scherm te beginnen, microtiterplaat platen (bijvoorbeeld 384-Wells-platen) moeten worden bekleed met de bibliotheek van siRNA en screening controles. De volgende stappen zijn beste olv van twee personen met één persoon (d.w.z. persoon A) hoofdverantwoordelijke voor de verstrekking van de transfectiereagens en cellen in de hele de platen, en de tweede persoon (d.w.z. persoon B) verantwoordelijk voor centrifugeren van de platen onmiddellijk voorafgaand aan de transfectie en voor het voorbereiden van de cellen. Opgenomen in de tussen haakjes zijn sommige Details voor de verwerking van een batch van 33 platen (dat wil zeggen de helft van de bibliotheek) met de cellijn van 786-O.
- Voorbereiding voor omgekeerde transfectie
- Persoon A: plaats genoeg media, trypsine en PBS nodig voor het verwerken van één partij van platen in een waterbad 37 ° C. Optioneel: Trypsinize van een plaat van cellen, en het aantal cellen per plaat zodat een real-time schatting van het aantal platen per batch vereist.
- Verkrijgen van een partij van platen (bv 33 platen) uit de diepvries en wacht 20-30 min zodat de platen te ontdooien. Terwijl de platen zijn ontdooien, verder met de volgende stappen.
- Persoon A: Pipetteer in 50 mL conische buizen het bedrag van de transfectie reagens verdunningsmiddel nodig voor de verwerking van een batch van platen (bv 2 x 37.125 mL) en plaats ze in een waterbad 37 ° C. Twee flessen vullen met 70% ethanol (b.v. 250-500 mL flessen). Vul twee 50 mL conische buizen met PBS en een met gedestilleerd water.
- Persoon A: onderdompelen de vloeistof dispenser buizen in een fles van 70% ethanol. Als al de tips zal niet worden gebruikt voor de verstrekking van de transfectiereagens (bijvoorbeeld als de buitenste putjes van de plaat niet worden gebruikt), loskoppelen de geen onnodige buizen eerst. Plaats een stukje plakband rond de buis om de punt waarbeneden de buis kan beschouwd worden als steriel te markeren. Prime met ongeveer 25 mL. Giet extra ethanol in de fles ter vervanging van het verloren volume. Laat de buis zitten in ethanol voor een minimum van 5 min.
- Persoon B: voorbereiden om uit te trypsinize cellen. Spray de weefselkweek (TC) kap met 70% ethanol. Spray en plaatsen de nodige pipets, tips, flessen en microfuge buizen voor het voorbereiden van de cellen in de kap (zie 2.2.1.1 en 2.2.1.2). Centrifugeer de verzegelde platen in verzamelingen bij 1026 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de deksels van de platen in een TC-kap, als eerder vastgesteld dat de platen tijdens centrifugeren kraken kunnen wanneer de deksels worden gehouden (zie 1.4.1).
- Persoon A: Verwijder de zegels uit de platen. Vóór, tijdens of na de zegels zijn verwijderd (afhankelijk van de duur van incubatie vereist), Pipetteer het normbedrag van transfectiereagens (bijvoorbeeld 375 μL/buis voor een eindconcentratie van 0,05 μl van RNAiMAX per putje) in de conische buisjes die bevatten de voorverwarmde transfectie reagens verdunningsmiddel (b.v. 37.125 mL/buis).
- Meng door pipetteren op en neer 10 keer. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende de tijd die is voorgeschreven voor de transfectiereagens wordt gebruikt (bijvoorbeeld 0-10 min).
- Omgekeerde transfectie
- Persoon B voert u de volgende taken hebben.
- Begin trypsinizing van de cellen (bijvoorbeeld 3 platen van 786-O cellen). De media van elke plaat gecombineerd. Spoel met 9 mL PBS. Pipet 3 mL trypsine per plaat. Incubeer bij 37 ° C voor ongeveer 5 min. resuspendeer de cellen met 22 mL van media. Pipetteer op en neer 10 keer.
- Combineer de celsuspensie van elke plaat weefselkweek in een steriele fles. Meng de celsuspensie door omkeren. Pipet 1 mL aliquots van de celsuspensie in twee aparte microfuge buizen. Een steekproef uit elke microfuge buis verwijderen en de cellen tellen. Berekenen van het volume van de celsuspensie vereist voor de dichtheid vereiste (bv 1500 cellen per putje), en genoeg verdund celsuspensie te bereiden (bijvoorbeeld 500 mL) te zien in een partij van platen.
- Persoon A voert u de volgende taken parallel aan persoon B. hebben
- De vloeistof dispenser leeg buizen van ethanol. Prime de slang met ongeveer 25 mL PBS en maak vervolgens de leidingen leeg. Wees voorzichtig met het hanteren van de buis om ervoor te zorgen dat het gedeelte van de buis onder de plakband die zal worden ondergedompeld in transfectiereagens en later in de celsuspensie wordt steriel gehouden. Platen die veilig kunnen worden gedaan met een conische buis van transfectie reagens oplossing apart gezet.
- Pipetteer de transfectie reagens oplossingen op en neer van 10 keer. Prime de slang met de transfectie reagens oplossing. Prime om te minimaliseren van het verlies van transfectiereagens, met net genoeg oplossing nauwelijks wissen de tips. Selecteer het juiste programma op de vloeistof dispenser en afzien van 5 μl van transfectiereagens per putje.
Let op: Nauwlettend toezien op het niveau van de transfectiereagens zodat het wordt aangevuld voordat het afloopt. De voltooiing van de platen die apart gezet een cue om toe te voegen meer transfectie reagens oplossing moet bieden. - Centrifugeer de platen bij 1026 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Ditmaal de deksels zal liggen op, zodat het kan nodig zijn om te centrifugeren minder platen op een moment om te voorkomen dat kraken (bijv 2 platen per emmer). Incubeer de platen bij kamertemperatuur gedurende de tijd die is voorgeschreven voor de transfectiereagens wordt gebruikt (bijvoorbeeld 10-20 min).
- Tijdens de incubatie, legen van de buis van de transfectie reagens oplossing, en plaats deze in een volledige 50 mL conische buis met PBS. Spoel de slang met ongeveer 25 mL PBS door priming en ledigen.
- Als meer van de tips worden gebruikt gaat voor de verstrekking van cellen dan werden gebruikt voor de verstrekking van transfectiereagens, opnieuw aansluit de ongebruikte buis en opnieuw steriliseren alle de buis met 70% ethanol voor het spoelen van de buis met PBS (zie 2.1.2.2).
- Meng de fles met de celsuspensie zodra het is opgesteld. Plaats de buis in de celsuspensie en prime genoeg om te zien dat elke tip goed is verstrekking. Afzien 30 μl per putje van de celsuspensie over alle platen. Indien nodig, meng de celsuspensie regelmatig om te voorkomen dat regelen.
Let op: Soms kunnen druppels van schorsing met media vasthouden aan de zijkanten van de tips. Wanneer dit wordt waargenomen, zo spoedig mogelijk gecombineerd of veeg met pluisvrije weefsel overgoten in 70% ethanol. - Leeg de slang van de celsuspensie. Spoel de slang met ongeveer 25 mL PBS, gevolgd door ongeveer 50 mL gedestilleerd water.
- Laat de platen zitten voor 45-60 min vanaf het moment van zaaien bij kamertemperatuur voordat u de platen terugkeert naar de incubator cel. Incubeer de platen in een ongestoorde incubator voor de gewenste lengte van gene silencing (bijvoorbeeld 48 h) (zie 1.1.4.5).
- Persoon B voert u de volgende taken hebben.
- Infectie
- Als u wilt opslaan van de tijd, de dag vóór het infecteren van de cellen, Pipetteer in steriele flessen de precieze hoeveelheid media vereist te infecteren van elke batch van platen met inbegrip van media voor niet-geïnfecteerde putten (bv 2 x 350 mL en 2 x 50 mL voor 33 platen). Bovendien, de vloeistof dispenser voor precisie en nauwkeurigheid testen, en indien nodig opnieuw te kalibreren.
- Warm de media bij 37 ° C. Twee flessen vullen met 70% ethanol, twee 50 mL conische buisjes met PBS en een met gedestilleerd water. Controleer of de centrifuge bij kamertemperatuur.
- Steriliseren van de buis met 70% ethanol, en spoel met PBS als eerder beschreven (zie 2.1.2.2 en 2.2.2.1). Terwijl de slang in de ethanol zit, Pipetteer de precieze hoeveelheid virus in de fles die het medium bevat eerder vereiste voorbereid op infectie (zie 2.3.1). Spoel de buis met PBS door priming met 25 mL en vervolgens leegmaken.
- Verwijderen van de platen uit de incubator en plaats hen in de kap van de TC. Prime de buis met media. Afzien 40 μL van de media in de niet geïnfecteerde-controleputjes. Leeg de slang van media en spoel met 25 mL PBS. (zie 2.2.2.5 voor de Let op)
- Na het mengen van het virus, plaatst u de buis in de fles met het virus. Afzien 40 μl van virus over de platen. Centrifugeer de platen gedurende 30 minuten bij 400 x g bij kamertemperatuur. De platen terugkomen in de incubator. Incubeer de platen gedurende de vooraf bepaalde tijd (bijvoorbeeld 24 h) (zie 1.2.4).
- Vaststelling en kleuring van cellen
- Als u wilt opslaan van de tijd, de dag vóór de vaststelling, bereiden een fles vaststelling en kleurstofoplossing met formaldehyde en PBS (bijvoorbeeld 179 mL van 37% formaldehyde en 270 mL PBS voor een eindconcentratie van 4% formaldehyde) voor elke partij van platen, maar weglaten de Hoechst vlek. Opslaan in de kast weg van licht ontvlambaar.
- Spoel de buis met 70% ethanol en PBS als eerder beschreven (zie 2.1.2.2 en 2.2.2.1). Voeg de vereiste hoeveelheid Hoechst toe (bv. 2,5 mL van een 5 mg/mL van Hoechst voor een uiteindelijke concentratie in de put van 7,5 μg/mL) aan de vaststelling en kleuring van de oplossing en mix.
- Afzien 30 μL van vaststelling en kleurstofoplossing over alle platen. Plaats de platen in de incubator voor 30 min. Na incubatie, passen de zeehonden aan de platen en sla de platen bij 4° C beschermd tegen licht. Wassen van de platen indien nodig (zie 1.1.6).
- Beeldvorming en beeldanalyse
- Het imago van de platen met een geautomatiseerde, hoge-inhoud Microscoop. Gebruik de vooraf bepaalde instellingen, maar eerst test de instellingen om ervoor te zorgen dat geen aanpassingen moeten worden aangebracht.
- Kwantificeren van de GFP (of andere tl verslaggever) gebied en Hoechst gebied per goed met het eerder ontwikkelde script (zie 1.3.2). Test het script met een handvol platen eerst om te bepalen als lichte wijzigingen moeten plaatsvinden voordat de batch analyseren van alle van de platen.
- Identificeren van hits. Opmerking: De robuuste Z-score/MAD (mediane absolute deviatie)-methode is een methode die vaak wordt gebruikt voor dit doel. Doorgaans tientallen > 2 of < -2 zijn ingesteld als cut-offs. Deze methode is het best gebruikt wanneer de siRNA monsters zijn willekeurig verspreid over de platen en niet, bijvoorbeeld gegroepeerd per functie aangezien de monsters worden gebruikt aangezien de feitelijke negatieve controles. Uitfilteren cytotoxische siRNAS zoals deze zou worden verwacht om te verkleinen niet-specifiek virus verspreid (zie bespreking voor meer informatie over het uitfilteren van cytotoxische hits).
3. secundaire scherm validatie van hits met de TRC (The RNAi Consortium) shRNA bibliotheek
Opmerking: Zie bespreking voor meer informatie over het selecteren van de hits voor secundaire validatie en screening technologieën mogelijk. Als siRNA technologie is geselecteerd voor secundaire validatie, hetzelfde assay ontwikkelings- en valideringsfase protocol kan worden gebruikt als werd gebruikt voor het primaire scherm (zie 1).
- Een aangepaste TRC shRNA bibliotheek gericht op de kandidaat-genen van belang als glycerol voorraden te verkrijgen.
- Bereiden van transfectie kwaliteit plasmide DNA uit de voorraden van glycerol. Opmerking: Een gedetailleerd protocol (dat wil zeggen "shRNA/sgRNA/ORF Glycerol en plasmide DNA voorbereiding") kan hier worden gevonden: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
- Het produceren van lentivirussen uiten shRNA gericht op de genen van belang met de DNA-plasmiden. Opmerking: Een gedetailleerd protocol voor lentivirus productie in 96-wells-platen [d.w.z. "shRNA/sgRNA/ORF High Throughput virale productie (96 goed)"] kan hier worden gevonden: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
- Cellen met de lentivirussen infecteren. Opmerking: Een gedetailleerd protocol voor lentivirale infectie in 96-wells-platen (d.w.z. "Lentivirale infectie") is online beschikbaar op http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/dir/download?dirpath=protocols/production&filename=TRC%20viral % 20infection%20200909.pdf.
- Cellen met oncolytische virus te infecteren beide volgende puromycin selectie (zie 3.4 voor het selectie-protocol) met succes getransduceerde cellen of onmiddellijk daaropvolgende transductie (zonder puromycin selectie). Om te bepalen van de optimale hoeveelheid virus en de duur van incubatie met virus, dezelfde methode gebruikt voor het primaire scherm te gebruiken.
4. de tertiaire validatie
Opmerking: Het doel van tertiaire validatie is voornamelijk bevestigen dat de hit op doel, tumor specifieke, en verbetert de doeltreffendheid in vivo. Men kan ook testen of het moduleert verspreiding over een spectrum van tumor cellijnen
-
Bevestiging dat de vechtpartij van het kandidaat-gen is op-target
- Eerst bevestigen dat er een correlatie tussen het fenotype en gene zwijgen. Gebruik van de dezelfde bepaling die is ontwikkeld voor het scherm of wijzigen voor een 6-well-formaat om de verbetering of de remming van spread in een groter formaat te beoordelen. Het voeren van een tijd-cursus met cellen transfected met siRNA gericht op de gene(s) van belang plus en min virus.
- Beeld van de putjes met virus-geïnfecteerde cellen, en de cel lysates verzamelen uit de niet geïnfecteerde putten op regelmatige tijdstippen. Bepalen of er een correlatie tussen gene zwijgen en toebehoren of remming van verspreiding. Beoordelen gene zwijgen door kwantitatieve Polymerase Chain Reaction (qPCR) en/of het westelijke bevlekken.
- Uitvoeren van een experiment van de genetische redding te bevestigen dat de hit is op doelsoort zijn. Opmerking: In een typische redding experiment, het kandidaat-gen is klopte-down met RNAi terwijl op hetzelfde moment zijn cellen transfected Transient met resistente RNAi cDNA (bv . ortholog van het gen) die de kandidaat-gen uitdrukt om te bepalen of de fenotype van het gen is hersteld of "gered". Stabiele cellijnen die resistent RNAi cDNA van de kandidaat-gen van belang overexpressing kunnen ook worden toegepast.
- Als alternatief, in plaats van een genetische redding experiment, gebruiken meerdere orthogonale testen om te bevestigen dat de hit op de doelsoort [bijvoorbeeld bepalen of het hetzelfde fenotype wordt verkregen op knockdown van het target-gen met meerdere siRNAs, op knockdown van het doel-gen in meerdere stabiele cellijnen shRNA tegen het target-gen, en bij knock-out met CRISPR (Clustered regelmatig interspaced korte palindromische herhalen) uitdrukken-Cas9 technologie in meerdere cellijnen.].
-
Bevestiging dat de hit tumor-specifieke en moduleert verspreid over een aantal tumor cellijnen
- Het gedrag van een soortgelijke bepaling als in 4.1.1, maar met normale cellen, alsook met andere cellijnen tumor.
-
Bevestiging dat manipulatie van de kandidaat-gen werkzaamheid in vivo verbetert
Opmerking: Hieronder beschreven, zijn drie mogelijke methoden voor het manipuleren van het gen richten in vivo.- Vind een drug te manipuleren van de gen-doelstelling. Als er een drug zoals een klein molecuul Inhibitor van de omwenteling die zich richt op het zelfde gen, beheren met het oncolytische virus in vivo. Het is belangrijk om te bepalen van de optimale timing voor het beheer van de drug.
- Ingenieur het virus te remmen of overexpress van het doel van de gene afhankelijk van of men wenst te remmen of verbeteren van de gen-doelstelling. Ingenieur om het gen te remmen, het oncolytische-virus om uit te drukken een negatieve dominant van het gen of aan uitdrukkelijke shRNA gericht op het gen. Kloon ter verhoging van de uitdrukking van het gen doel, het oncolytische-virus met een overexpressing van het gen transgenic.
- Ingenieur cellijnen met het gen knock-down of knock-out met shRNA of CRISPR-Cas9-technologie, respectievelijk. De gemanipuleerde cellijn van het implantaat en het wild-type cel lijn in vivo en vervolgens besmetten met het virus oncolytische. Opmerking: Deze methode fungeert als een bewijs-van-principe en kunt u bepalen of investeren extra tijd en middelen voor de ontwikkeling van een medicijn om te manipuleren de gene in vivo, bijvoorbeeld, zou de moeite waard.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een overzicht van de workflow voor het identificeren van host doelstellingen ter verbetering van de oncolytische virus therapie wordt gepresenteerd in Figuur 1.
Zoals aangegeven in Figuur 1, is de kritieke eerste stap om het uitvoeren van een high-throughput RNAi scherm assay ontwikkeling. Figuur 2A biedt een monster plaat indeling voor de transfectie optimalisatie assay. Figuur 2B bestaat uit representatieve beelden van de verwachte resultaten, en figuur 2C is een representatieve complot van de verwachte resultaten. Naar aanleiding van siRNA knockdown voor PLK-1, een gen dat induceert celdood en kan worden gebruikt als positieve controle om te controleren van siRNA vechtpartij efficiëntie, zou men verwachten dat de overleving van de cel tussen 0-30%, tenzij de cellijn een lange heeft tijd in welk geval een verdubbeling duurt l onger te observeren het fenotype van cel dood. De niet-targeting siRNA moet ook minimaal giftig voor de cellen met een soortgelijke relatieve overleving die van onbehandeld cellen.
Een ander belangrijk element van ontwikkeling van de test is het bepalen van de MOI op waarnaar u de cellen en de tijdsduur voor infectie besmetten. Figuur 3A biedt een monster plaat lay-out voor het bepalen van de hoeveelheid virus en de duur van incubatie met virus. Figuur 3B ziet u de resultaten van een levende tijd-cursus van 786-O-cellen geïnfecteerd met vvDD-eGFP (oncolytische vacciniavirus verbeterde GFP uitdrukken met de genen van het Thymidine Kinase en "vacciniavirus" Growth Factor verwijderd) bij verschillende MOIs. Representatieve beelden van cellen geïnfecteerd met vvDD-eGFP bij een MOI van 0,05 worden weergegeven in Figuur 3 c. Gebaseerd op de resultaten die zijn uitgezet in figuur 3B, kan men selecteren een MOI van 0,05 en een lengte van infectie van 21u aangezien dit voor de detectie van stijgingen en dalingen in de verspreiding zou toestaan, aangezien dit tijdstip binnen een lineaire reeks, en de geschatte Z-factor bij deze ti me-punt is 0,6 voor cohorten die verhogen en cohorten die verspreiding te verminderen. Als onderdeel van het valideren van deze bepaling, zal men willen herstellen de cellen bij deze MOI en tijdstip en de Z-factor te berekenen.
Na het protocol beschreven, we uitgevoerd genoom-brede RNAi schermen over drie verschillende tumor cellijnen (bijvoorbeeld OVCAR-8, U373, NCI-H226) in tweevoud met een 18,120 genen15targeting siRNA-bibliotheek. De MAD-methode, we geïdentificeerd 1008 hits gemeen hebben ten minste 2 van de 3 kanker cellijnen (figuur 4A). Traject analyse van hits geïdentificeerd in de schermen geopenbaard verrijking van leden van de UPR (ongevouwen eiwitten reactie) en ERAD (endoplasmatisch reticulum-geassocieerde eiwit-afbraak) trajecten (figuur 4A). Wij hebben gekozen 10 hits binnen deze trajecten voor secundaire validatie met behulp van siRNA met verschillende targeting sequenties van die van het primaire scherm (figuur 4B). Als onderdeel van de tertiaire validatie, voerden we een genetische redding experiment met IRE1α en ATF6α (activerende transcriptie factor 6 alpha) om te bevestigen dat deze hits op doel (figuur 4C waren).
Figuur 1: schematische van workflow voor het identificeren van host doelstellingen ter verbetering van de oncolytische virus therapie. De eerste stap is het ontwikkelen en valideren van een assay voor high-throughput RNAi screening, waaronder transfectie voorwaarden voor de invoering van siRNA in cellen, het bepalen van de optimale hoeveelheid virus (d.w.z. MOI) aan de cellen infecteren met optimaliseren en de duur van incubatie met virus. De tweede stap is het voeren van een high-throughput genoom-brede scherm. Een bibliotheek van siRNA gericht op genen in het hele genoom is gekleed op platen van de microtiterplaat. Cellen zijn dan omgekeerde transfected met de siRNA bibliotheek. Na een incubatietijd van 48-72 uur toe voor gene silencing, cellen zijn besmet met de optimale hoeveelheid virus. Na de optimale duur van incubatie met virus, zijn cellen vaste gekleurd en vervolgens beeld met een hoog-inhoud Microscoop. Na diverse analyses van beeld en gegevens zal bijdragen tot het identificeren van genen die aanzienlijk moduleren virus replicatie, die worden aangeduid als "hits". Het scherm van een secundaire validatie wordt uitgevoerd op select hits uit het primaire scherm in het algemeen gebruik van siRNA of shRNA met zaad van de verschillende regio's. Tertiaire validatie experimenten worden uitgevoerd om te bevestigen dat de hits op doelsoort, tumor specifieke zijn en werkzaamheid in vivoversterken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: optimalisatie van transfectie voorwaarden voor high-throughput RNAi screening assay. (A) een monster plaat lay-out voor het optimaliseren van de transfectie voorwaarden met twee verschillende cellijnen. (B) representatieve beelden van 786-O cellen (1500 cellen per putje) gekleurd met Hoechst 33342 na 72 h incubatie met transfectie reagens verdunningsmiddel alleen (d.w.z. onbehandeld), met transfectiereagens en oplosmiddel (d.w.z. mock transfected), met niet-targeting siRNA en siRNA targeting PLK-1. (C) vertegenwoordiger resultaten van transfectie optimalisatie-experiment met 22% overleving van cellen transfected met PLK-1 siRNA (n = 24) en 94% overleving van cellen transfected met niet-targeting siRNA (n = 8). Foutbalken = ± SD, standaardafwijking; schaal bars = 200 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: bepaling van de hoeveelheid virus en duur van incubatie met virus voor high-throughput RNAi screening assay. (A) een monster plaat lay-out voor het optimaliseren van de hoeveelheid virus en duur van incubatie met virus. Kolommen 1 en 24 transfectie bevatten besturingselementen en links zijn niet-geïnfecteerde. Kolommen 2 tot en met 23 bevatten onbehandelde cellen, mock transfected cellen en cellen transfected met virus van positieve en negatieve controles alle besmet met een bereik van MOIs beginnen met geen virus in de kolommen 2 en 3. (B) 786-O cellen waren omgekeerde transfected met niet-targeting siRNA en 48 uur ge¨ uncubeerd. Ze werden vervolgens besmet met vvDD-GFP op de MOIs aangegeven en beeld tussenpozen 8 h beginnen bij 5 uur na infectie (hpi). De gemiddelde GFP gebied per putje (± SD) werd berekend voor elk moment-punt (n = 12) en die in de grafiek zijn getekend. De Z-factor berekend tussen de punten A en B is 0,6 en de Z-factor berekend tussen de punten B en C is 0,6. (C) vertegenwoordiger live beelden van een besmet met een MOI van 0,05 op de tijd-punten goed aangegeven. Vergroting, 10 x; 9 velden per putje; schaal bars = 200 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: genoom-brede scherm identificeert ER Stress Response blokkade als een krachtige sensibiliserende van Rhabdovirus-gemedieerde Oncolysis. (A) Venn-diagram waarin het aantal overlappende hits van high-throughput RNAi schermen in 3 tumor cellijnen, en een tabel (+, synthetische dodelijke;-, geen interactie) en schematisch diagram (hits aangegeven in rood) illustreren toetsaanslagen binnen de UPR en ERAD trajecten. (B) EG50 verschuivingen (zwarte balken, links van de y-as) waren vastbesloten voor U373 cellen behandeld met Maraba virus (48 uur) na de behandeling met siRNA (72 h) gericht op een reeks van UPR/ERAD hits van het scherm. Relatieve mRNA-expressie voor elk gen na siRNA knockdown (72 h) wordt afgebeeld in wit (juiste y-as). (C) cel levensvatbaarheid testen werden uitgevoerd 48u na Maraba virusbesmetting, in U373 muis cellen uiten van ectopically ATF6α (of besturingselement GFP) ± siRNA gericht op menselijke ATF6α (of niet-gericht op [NT] controle; linkerpaneel) of menselijke XBP1(s) (of besturingselement ) ± siRNA gericht op menselijke IRE1α (of controle; rechts paneel). Westelijke vlekken aantonen van gene zwijgen en ectopische genexpressie worden weergegeven. EG50 verschuivingen = de verschuiving in de dosis van virus nodig om te doden van 50% van de cellen; Foutbalken = ±SD; XBP1(s) = X-box-bindend-proteïne 1 (verbinding aan de randen); In (B), one-way ANOVAs werden uitgevoerd gevolgd door een Bonferroni meerdere vergelijking van post hoc test te ontlenen van p-waarden; In (C), werden van de student t-tests uitgevoerd om te ontlenen van p-waarden; * p < 0.05; #p < 0.05. (Dit cijfer is gewijzigd van Mahoney et al.., 201115). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren we een protocol voor de toepassing van high-throughput RNAi screening te identificeren host doelen die kunnen worden gemanipuleerd om het verbeteren van oncolytische virus therapie. Dit is met succes getest met oncolytische Maraba virus en oncolytische vacciniavirus, maar, zoals opgemerkt, het kan worden aangepast voor gebruik met andere oncolytische virussen of andere virussen in het algemeen ter identificatie van de host-genen die virus replicatie moduleren. Het protocol van de screening is ook ontworpen om genen die stijgen of dalen verspreiding te identificeren, maar kan het gemakkelijk worden gewijzigd voor andere uitlezingen. Onze schermen met Maraba virus, bijvoorbeeld, werden ontworpen om genen moduleren van oncolysis met behulp van een eenvoudige resazurin gebaseerde vitale kleurstof assay te scoren van de levensvatbaarheid van de cellen te identificeren (Zie Figuur 4)15. In deze schermen, na incubatie met virus, in plaats van vaststelling van cellen met formaldehyde en kleuring met Hoechst, we afgezien resazurin kleurstof in elk putje (eindconcentratie van 20 μg/mL) en, na een incubatie 6 h we gemeten extinctie (573 nm) met een afleesapparaat. We kunnen ook hebben gebruikt celaantal op basis van Hoechst kleuring als een uitlezing. Terwijl met behulp van een surrogaat-verslaggever te controleren van de replicatie van het virus was niet nodig in dit scherm, levend een virus met een verslaggever eiwit, met name een fluorescente proteïne scherm optimalisatie vergemakkelijken, zoals een kunt, bijvoorbeeld, virus replicatie controleren; Bovendien, een virus met een verslaggever proteïne is minder omslachtig en kostbaar dan het gebruik van antilichamen om vlek voor virale antigenen, maar is het mogelijk om scherm zonder een. Bovendien kan men zelfs verdere aanpassingen aan de bepaling te onderzoeken gastheer factoren die van invloed zijn op de infectiviteit, burst size, en zelfs meer gedetailleerde sub fenotypen zoals immunologische celdood zou kunnen maken. In elk geval, zou men een soortgelijke bepaling ontwikkeling protocol, screening strategie en secundaire en tertiaire validatie methoden volgen.
In het protocol, is het raadzaam de transfectie voorwaarden liefst met meerdere tumor cellijnen optimaliseren. Er zijn ten minste twee redenen voor het optimaliseren van met meerdere cellijnen. Een van de redenen is dat niet elke cellijn vatbaar voor high-throughput screening is zoals sommige moeilijk te transfect of niet goed kunnen houden, maar een belangrijke reden is om screening met meerdere cellijnen teneinde cel intrinsieke bias. De keuze van de cellijnen is grotendeels afhankelijk van iemands doelstellingen. Een mag ervoor kiezen zich te richten op een bepaalde kanker type of selecteer ongelijksoortige kanker typen ter dekking van een breder spectrum. Anderzijds kan een willen toespitsen op tumor cellijnen die resistent zijn tegen gastheer factoren die kunnen worden gemanipuleerd zodat de tumor cellijnen minder bestand tegen oncolytische virusinfectie te identificeren.
Naast de selectie van cellen lijnen is de selectie van positieve en negatieve virus besturingselementen een belangrijke overweging voor elk scherm. In sommige gevallen, virus genen die nodig zijn voor of beperken van replicatie niet bekend kunnen zijn, of, als zij bekend zijn, kunnen zij cel-specifieke. Bijgevolg kan men nog steeds de geschatte robuustheid en het dynamisch bereik van de bepaling bepalen met behulp van surrogaat besturingselementen. Bijvoorbeeld, kon men niet-geïnfecteerde cellen of cellen besmet met een lage MOI als surrogaat positieve controle voor de identificatie van genen die verspreiding op knockdown verkleinen gebruiken. Voor de identificatie van genen die verspreiding op knockdown verbeteren, kan een cellen met een verdunningsreeks van het virus besmetten en putten met het maximale signaal gebruiken als surrogaat positieve controle.
Selectie van hits voor secundaire scherm validatie en het soort technologie te gebruiken is een andere zaak die vereist zorgvuldige beraadslaging. Kandidaten zijn in het algemeen geselecteerd voor secundaire scherm validatie op basis van de omvang van de hit op of ze aanzienlijk verspreiding in meerdere kanker cellijnen moduleren (als primaire schermen werden uitgevoerd in meerdere cellijnen) en biologische belang. Bioinformatica tools zoals DAVID22,23, PANTHER24, STRING25 en PINdb26 kunnen helpen om trajecten en hits van biologische belang te isoleren. Mercer et al. 8 beschrijven het gebruik van de software van de analyse van de open-source image en hebben ook ter beschikking gesteld een algoritme dat ze ontwikkeld voor de visualisatie en de analyse van hits. Een van de factoren rekening te houden bij de interpretatie van de resultaten dat gene silencing is wellicht verschillende effecten afhankelijk van de fase in de levenscyclus van virus dat wordt onderzocht. Het is bijvoorbeeld mogelijk dat knockdown van een gen vroeg in de levenscyclus virus replicatie, kan remmen, terwijl knockdown in een later stadium replicatie kan verhogen. Secundaire schermen worden vaak uitgevoerd met siRNA van een andere leverancier met verschillende zaad regio's met meerdere siRNAs per gen. Complementaire technologieën gericht op kandidaat-genen kunnen echter worden gebruikt zoals CRISPR-Cas9 of lentivirus vectoren shRNA uitdrukken.
De analysemethode is ook een essentiële overweging. We raden aan hier gebruiken de robuuste Z-score of MAD20,,27 met gesuggereerd cut-offs voor hit roeping van > 2 of < -2. De cut-offs kunnen worden verhoogd of verlaagd al naar gelang de focus op meer valse positieven te elimineren of te vangen meer valse negatieven. Bijvoorbeeld, in een recente hoge gegevensdoorvoer scherm met vaccinia virus9, werd de licht-donkerscheiding lager vastgesteld op-1.5 (geen bovenste cut-offs werden omschreven als de nadruk lag op het identificeren van genen die daalde van verspreiding op knockdown). Er zijn ook andere methoden die kunnen worden ingezet met inbegrip van de z-score, SSMD (strikt gestandaardiseerde gemiddelde verschil) en de B score20,28,29,30. Barrows et al.31 hitlijsten gegenereerd door som rang, MAD, z-score en SSMD vergeleken en gevonden dat elke methode van analyse resulteerde in verschillende hitlijsten. In toto, er is geen perfecte methode of de licht-donkerscheiding. Uiteindelijk zal de secundaire scherm validatie en tertiaire validatieonderzoek waar hits bevestigen.
De methode voor het uitfilteren van cytotoxische hits moet ook worden overwogen. Een manier is om uit te voeren van primaire schermen in parallelle plus of min virus. Hierdoor kan de detectie van siRNAs die cytotoxisch zijn op hun eigen. Dit was onze aanpak in onze Maraba virus schermen15; Dit is echter niet vaak praktisch. Misschien is een meer praktische methode, naast het feit dat robuust, om na te gaan van de hits die cytotoxisch zijn als onderdeel van secundaire scherm validatie, vooral als iemands focus is het identificeren van de hits die daling replicatie op knockdown. Bijvoorbeeld, in een hele genoom primaire scherm met Myxoma virus, Teferi et al. 11 geïdentificeerd 1,588 siRNAs dat virus replicatie op knockdown daalde. Als u wilt filteren op cytotoxische siRNAs, voerden zij een secundaire cytotoxiciteit scherm met deze siRNAs; ze gemeten cel levensvatbaarheid 72 h na transfectie met behulp van een resazurin gebaseerde cel levensvatbaarheid assay. Cytotoxische siRNAs werden geïdentificeerd op basis van een Z-score van ≤-1.96. Een andere benadering is gewoon cytotoxische siRNAs uit de gegevens van de primaire screening op basis van een vermindering van het aantal cellen met een bepaald percentage, bijvoorbeeld door een vermindering van > 50% zoals in Sivan et al. uitfilteren 9, of op basis van een bepaalde score zoals Lee et al. 14; in hun studie van gastheer factoren nodig zijn voor vesiculaire stomatitis virus replicatie, zij uitgesloten siRNA hits die de levensvatbaarheid van de cellen met > 3.0 standaarddeviaties verminderd ten opzichte van het gemiddelde. Het gemiddelde aantal cellen werd bepaald op basis van de Hoechst kleuring van celkernen en, hoewel niet expliciet vermeld, het gemiddelde schijnbaar was berekend op basis van de per plaat als het is duidelijk dat het gemiddelde GFP signaal werd berekend op basis van de per plaat.
Een beperking van een willekeurig hoge gegevensdoorvoer RNAi scherm is het vaak hoge aantal valse positieven en negatieven, die komen kunnen als gevolg van het ontwerp van de bepaling, de gebruikte technologie of door middel van systematische fouten. Bijvoorbeeld, een proteïne kan grote invloed op de replicatie van het virus, maar de tijd gekozen voor gene silencing mogelijk te kort gegeven van het eiwit half-life te detecteren het effect ervan leiden tot een vals negatief op grond van het ontwerp van de test. Het is reeds lang gevestigd dat onvolledige knockdown en de gevolgen van de af-target van siRNA technologie ook valse positieven en negatieven invoeren kunnen. Systematische fouten, zoals het randeffect32, kunnen ook misleidende resultaten genereren. Hier kan het signaal in de buitenste putjes van de plaat worden systematisch hoger of lager is dan de rest van de plaat als gevolg van verdamping. Er zijn strategieën naar adres sommige van deze kwesties met inbegrip van, bijvoorbeeld: verminderen van de concentratie van siRNA om uit-target effecten33, herconfigureren plaat lay-outs om te vullen van de buitenste wells met media te verzachten het effect van de rand of dienst computationele methoden die zijn ontwikkeld voor het opsporen en bestrijden van systematische fouten zoals het randeffect32,34,35. Een algemene methode om te gaan met valse positieven is tot het voeren van een secundaire scherm volgens het primaire scherm. Als een manier van omgaan met de valse negatieven, kan een ontspannen van de licht-donkerscheiding voor hit bellen en opnemen van potentiële valse negatieven voor secundaire vertoning. Dit, natuurlijk, zal geen valse negatieven die ver onder de licht-donkerscheiding vastleggen. Primaire schermen moeten ook plaatsvinden in dubbele of drievoud om valse resultaten te beperken. Uiteindelijk, ongeacht welke strategieën werkzaam zijn, geen hoge gegevensdoorvoer scherm zal uitvoerig alle ware hits identificeren, maar kan bieden een schat aan gegevens waaruit een waarschijnlijk sommige waardevolle hits die kunnen worden omgezet in een hoofdletter is bij de mijne.
In dit protocol beschreven we het gebruik van gekleed siRNA en shRNA technologie, hoewel een ander alternatief het gebruik van de gepoolde shRNA en CRISPR-Cas9-bibliotheken is. Een gepaarde shRNA bibliotheek was werkzaam in de Workenhe et al. 12 onderzoek uiteengezet in de inleiding. Gebundelde CRISPR-Cas9-technologie heeft geweest tweedehands voor het voeren van genoom-schaal schermen ter identificatie van de gastheer factoren nodig is voor replicatie van virussen zoals Zika virus36, West-Nijl virus37,38, dengue virus39 en hepatitis C virus39. Het voordeel van het gebruik van de gepoolde bibliotheken is dat ze minder duur zijn om te kopen, vereisen geen gespecialiseerde infrastructuur (bijvoorbeeld vloeibaar behandeling van apparaten, high-inhoud microscopen en robotachtige uitrusting), noch hebben ze de hoge kosten van en het onderhoud van deze infrastructuur, en ze vereisen minder verbruiksartikelen. Het nadeel is dat de soorten uitlezingen beperkter zijn. In de meeste zo niet alle gebundelde bibliotheek de schermen van de interactie van het host-virus tot nu toe is de uitlezing levensvatbaarheid van de cellen of het ontbreken daarvan; Men kan niet gemakkelijk sonde voor complexere fenotypen. De keuze van formaat is afhankelijk van de biologische vraag.
De vooruitgang in genetische screening technologie in de afgelopen decennia die eerste ingeschakelde schermen in bacteriën en gist om nu huidige genoom-schaal schermen in menselijke cellen de deur wijd voor ontdekking hebt geopend in uiteenlopende vakgebieden. Deze genetische schermen hebben niet alleen laten ons naar de fundamentele biologie vragen beantwoorden, maar ons toetsen te ontgrendelen inzicht in de ontwikkeling en verbetering van de biotherapeutics hebben gegeven. Terwijl er nog steeds lessen moeten worden getrokken en uitdagingen moeten worden overwonnen met deze technologie, hebben de resultaten tot nu toe spannend geweest. De ontdekkingen zullen waarschijnlijk nog groter als roman screening van technologie, met inbegrip van de bibliotheken van de CRISPR-Cas9, microfluidics en in vivo screening technologieën blijven om te rijpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door subsidies van het Ontario Instituut voor kankeronderzoek, de Stichting van Canada voor de innovatie, de Ottawa regionale Cancer Foundation en de Terry Fox Research Institute. K.J.A. werd gesteund door een Vanier Canada Graduate beurs, een Canadees Instituut voor gezondheid onderzoek-Master Award, en een Graduate beurs van Ontario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| siRNA library | GE Dharmacon | G-005005-02 | |
| Corning 384-well plate | Corning | 3985 | |
| Falcon 384-well plate | Becton Dickinson | 353962 | |
| Water | Sigma | W4502 | |
| siGenome SMARTpool PLK1 | GE Dharmacon | M-003290-01 | |
| AllStars Negative Control siRNA | Qiagen | SI03650318 | |
| siGenome Non-targeting siRNA Pool #2 | GE Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| DMEM/HIGH Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30022.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F15051-500ML | |
| HEPES solution (1M) | Sigma | H3535-100ML | |
| Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare Life Sciences | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 2500056 | |
| DPBS/Modified | GE Healthcare Life Sciences | SH30028.02 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778100 | |
| Oligofectamine | Thermo Fisher Scientific | 1225011 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 22600-050 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma | R7017-5G | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H21492 | |
| Formaldehyde (37% by weight) | Fisher Scientific | F79-4 | |
| 500 ml bottles | Corning | 430282 | |
| Adhesive Sealing Film For Microplates | Excel Scientific | 361006007 | |
| Peelable Heat Sealing Foil | Thermo Fisher Scientific | AB-3720 | |
| BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette | Fisher Scientific | 11-120-625 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MicroFlo Select (liquid dispenser) | Fisher Scientific | 11120621 | |
| BioTek Synergy HT plate reader | Biotek | N/A | |
| Opera Imaging and Analysis Instrument | PerkinElmer | HH10000115 | |
| KiNEDx Robotic Arm | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | KX-300-660 | |
| Cytomat 24C Series Automated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 50080227 | |
| JANUS Automated Workstation | PerkinElmer | AJI4M01 | |
| Plate Carousel | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | N/A | |
| Alps 3000 plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-3000 |
References
- Cherry, S. What have RNAi screens taught us about viral-host interactions? Curr. Opin. Microbiol. 12 (4), 446-452 (2009).
- Panda, D., Cherry, S. Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions. Curr. Opin. Virol. 2 (6), 784-792 (2012).
- Houzet, L., Jeang, K. T. Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis. Exp. Biol. Med. 236 (8), 962-967 (2011).
- Friedel, C. C., Haas, J. Virus-host interactomes and global models of virus-infected cells. Trends Microbiol. 19 (10), 501-508 (2011).
- Gao, S., Yang, C., et al. Applications of RNA interference high-throughput screening technology in cancer biology and virology. Protein Cell. 5 (11), 805-815 (2014).
- Kilcher, S., Mercer, J. Next generation approaches to study virus entry and infection. Curr. Opin. Virol. 4, 8-14 (2014).
- Ramage, H., Cherry, S. Virus-Host Interactions: From unbiased genetic screens to function. Annu. Rev. Virol. 2 (1), 497-524 (2015).
- Mercer, J., Snijder, B., et al. RNAi screening reveals proteasome- and Cullin3-dependent stages in vaccinia virus infection. Cell Rep. 2 (4), 1036-1047 (2012).
- Sivan, G., Martin, S. E., et al. Human genome-wide RNAi screen reveals a role for nuclear pore proteins in poxvirus morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (9), 3519-3524 (2013).
- Beard, P. M., Griffiths, S. J., et al. A loss of function analysis of host factors Influencing vaccinia virus replication by RNA Interference. PLoS ONE. 9 (6), e98431 (2014).
- Teferi, W. M., Dodd, K., Maranchuk, R., Favis, N., Evans, D. H. A whole-genome RNA interference screen for human cell factors affecting myxoma virus replication. J. Virol. 87 (8), 4623-4641 (2013).
- Workenhe, S. T., Ketela, T., Moffat, J., Cuddington, B. P., Mossman, K. L. Genome-wide lentiviral shRNA screen identifies serine/arginine-rich splicing factor 2 as a determinant of oncolytic virus activity in breast cancer cells. Oncogene. 35 (19), 2465-2477 (2015).
- Panda, D., Das, A., et al. RNAi screening reveals requirement for host cell secretory pathway in infection by diverse families of negative-strand RNA viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (47), 19036-19041 (2011).
- Lee, A. S. -Y., Burdeinick-Kerr, R., Whelan, S. P. J. A genome-wide small interfering RNA screen identifies host factors required for vesicular stomatitis virus infection. J. Virol. 88 (15), 8355-8360 (2014).
- Mahoney, D. J., Lefebvre, C., et al. Virus-tumor interactome screen reveals ER stress response can reprogram resistant cancers for oncolytic virus-triggered Caspase-2 cell death. Cancer Cell. 20 (4), 443-456 (2011).
- Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. A call to arms: Using RNAi screening to improve oncolytic viral therapy. Cytokine Growth Factor Rev. 21 (2-3), 161-167 (2010).
- Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. Functional genomic screening to enhance oncolytic virotherapy. Br. J. Cancer. 108 (2), 245-249 (2012).
- Allan, K. J., Stojdl, D. F., Swift, S. L. High-throughput screening to enhance oncolytic virus immunotherapy. Oncolytic Virother. 5, 15-25 (2016).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8 (5), 566-570 (2003).
- Birmingham, A., Selfors, L. M., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6 (8), 569-575 (2009).
- Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
- Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).
- Thomas, P. D., Campbell, M. J., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
- Szklarczyk, D., Morris, J. H., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D362-D368 (2017).
- Luc, P. -V., Tempst, P. PINdb: a database of nuclear protein complexes from human and yeast. Bioinformatics. 20 (9), 1413-1415 (2004).
- Chung, N., Zhang, X. D., et al. Median absolute deviation to improve hit selection for genome-scale RNAi screens. J. Biomol. Screen. 13 (2), 149-158 (2008).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z Score, SSMD*, z* Score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
- Zhang, X. D., Lacson, R., et al. The use of SSMD-based false discovery and false nondiscovery rates in genome-scale RNAi screens. J. Biomol. Screen. 15 (9), 1123-1131 (2010).
- Amberkar, S. High-throughput RNA interference screens integrative analysis: towards a comprehensive understanding of the virus-host interplay. World J. Virol. 2 (2), 18-31 (2013).
- Barrows, N. J., Le Sommer, C., Garcia-Blanco, M. A., Pearson, J. L. Factors affecting reproducibility between genome-scale siRNA-based screens. J. Biomol. Screen. 15 (7), 735-747 (2010).
- Carralot, J. -P., Ogier, A., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28 (2), 261-268 (2011).
- Caffrey, D. R., Zhao, J., et al. siRNA off-target effects can be reduced at concentrations that match their individual potency. PLoS ONE. 6 (7), e21503-e21511 (2011).
- Makarenkov, V., Zentilli, P., Kevorkov, D., Gagarin, A., Malo, N., Nadon, R. An efficient method for the detection and elimination of systematic error in high-throughput screening. Bioinformatics. 23 (13), 1648-1657 (2007).
- Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Brief. Bioinform. 16 (6), 974-986 (2015).
- Savidis, G., McDougall, W. M., et al. Identification of Zika virus and dengue virus dependency factors using functional genomics. Cell Rep. 16 (1), 232-246 (2016).
- Ma, H., Dang, Y., et al. A CRISPR-Based screen identifies genes essential for West-Nile-virus-induced cell death. Cell Rep. 12 (4), 673-683 (2015).
- Zhang, R., Miner, J. J., et al. A CRISPR screen defines a signal peptide processing pathway required by flaviviruses. Nature. 535 (7610), 164-168 (2016).
- Marceau, C. D., Puschnik, A. S., et al. Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens. Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).
