Summary
Hier beschrijven we een co-immunoprecipitation protocol om te bestuderen van de eiwit-eiwit interactie tussen endogene nucleaire eiwitten hypoxische omstandigheden. Deze methode is geschikt voor de demonstratie van de interacties tussen transcriptiefactoren en transcriptionele co regelgevers op hypoxie.
Abstract
Lage zuurstofniveaus (hypoxie) leiden tot een verscheidenheid van adaptieve reacties met de hypoxie-afleidbare factor 1 (HIF-1) complexe fungeert als een meester regulator. HIF-1 bestaat uit een heterodimeric zuurstof-gereglementeerde α subeenheid (HIF-1α) en constitutively uitgedrukt β subeenheid (HIF-1β) ook bekend als aryl koolwaterstof receptor nucleaire translocator (ARNT), regulering van de genen die betrokken zijn bij verschillende processen, met inbegrip van angiogenese , Erytropoëse en glycolyse. De identificatie van HIF-1 interacterende eiwitten is de sleutel tot het begrip van de signalering traject hypoxie. Naast de regulering van de HIF-1α stabiliteit leidt hypoxie ook tot de nucleaire translocatie van vele transcriptiefactoren waaronder HIF-1α en ARNT. Met name, zijn de meeste van de huidige methoden gebruikt bij het bestuderen van deze eiwit-eiwitinteractie (PPIs) gebaseerd op systemen waar eiwitniveaus kunstmatig worden verlengd door middel van eiwit overexpressie. Eiwit overexpressie vaak leidt tot niet-fysiologische resultaten die voortvloeien uit de temporele en ruimtelijke artefacten. Hier beschrijven we een gemodificeerde co-immunoprecipitation protocol na hypoxie behandeling met behulp van endogene nucleaire eiwitten, en als een proof of concept, om te laten zien van de interactie tussen HIF-1α en ARNT. In dit protocol, de hypoxische cellen zijn geoogst hypoxische omstandigheden en van de Dulbecco zoute Phosphate-Buffered (DPBS) was buffer was ook vooraf equilibrated hypoxische voorwaarden vóór gebruik ter vermindering van de aantasting van het proteïne of eiwit complex Dissociatie tijdens heroxygenatie. Daarnaast werden de nucleaire breuken vervolgens gehaald om te concentreren en het stabiliseren van de endogene nucleaire eiwitten en het voorkomen van mogelijke valse resultaten vaak gezien tijdens eiwit overexpressie. Dit protocol kan worden gebruikt om aan te tonen van endogene en inheemse interacties tussen transcriptiefactoren en transcriptionele co regelgevers hypoxische omstandigheden.
Introduction
Hypoxie treedt op wanneer onvoldoende zuurstof aan de cellen en weefsels van het lichaam wordt geleverd. Het speelt een cruciale rol in verschillende fysiologische en pathologische processen zoals stamcel differentiatie, ontsteking en kanker1,2. Hypoxie-afleidbare factoren (HIFs) fungeren als heterodimers samengesteld uit een zuurstof-gereglementeerde α subeenheid en een constitutively uitgedrukt β-subunit ook bekend als ARNT3. Drie isoforms van de HIF-α-subunits (HIF-1α, HIF-2α en HIF-3α) en drie HIF-β-subunits (ARNT/HIF-1β, ARNT2 en ARNT3) zijn tot nu toe geïdentificeerd. HIF-1α en ARNT worden overal uitgedrukt, overwegende dat de HIF-2α HIF-3α, ARNT2 en ARNT3 hebben meer expressie patronen4beperkt. De HIF-1 eiwit complex is de belangrijke regulator van de reactie van hypoxie. Hypoxische omstandigheden HIF-1α wordt gestabiliseerd, vervolgens translocates op de nucleus en dimerizes met ARNT5. Vervolgens dit complex wordt gebonden aan bepaalde nucleotiden hypoxie responsieve elementen (HREs) genoemd en regelt de uitdrukking van de doelgenen die betrokken zijn bij verschillende processen, met inbegrip van angiogenese, Erytropoëse en glycolyse6. Naast deze "canonieke" reactie, de signalering traject van hypoxie is ook bekend Overspraak met meerdere cellulaire respons op de signalering van studierichtingen zoals de Inkeping en Nuclear Factor-kappa B (NF-recombination)7,8,9.
De identificatie van roman HIF-1 interacterende eiwitten is belangrijk voor een beter begrip van de signalering traject hypoxie. In tegenstelling tot ARNT, die ongevoelig voor zuurstofniveaus en constitutively uitgedrukt is, worden de HIF-1α eiwitniveaus strak gereguleerd door cellulaire zuurstofniveaus. Normoxia (21% zuurstof) zijn HIF-1α proteïnen snel aangetaste10,11. De korte halfwaardetijd van HIF-1α op normoxia biedt specifieke technische uitdagingen voor de detectie van het eiwit uit cel extracten, alsook voor de identificatie van eiwitten HIF-1α-interactie. Bovendien translocate verschillende transcriptiefactoren met inbegrip van die van het complex HIF-1 in de kern onder hypoxische voorwaarden12,13,14. De meeste van de huidige methoden voor PPI studies worden uitgevoerd met behulp van niet-fysiologische overexpressie van eiwitten. De overexpressie van dergelijke eiwitten is gemeld aan de verschillende cellulaire defecten veroorzaken door meerdere mechanismen, met inbegrip van resource overbelasting, stoichiometrische onbalans, promiscue interacties en traject modulatie15,16. In termen van PPI studies, kan eiwit overexpressie leiden tot valse positieve, of zelfs valse negatief, resultaten, afhankelijk van de eigenschappen van de eiwitten en de functies van de overexpressie eiwitten. Daarom moeten de huidige methoden voor PPI studies worden gewijzigd om te onthullen het fysiologisch relevante PPIs onder hypoxische voorwaarden. Wij hebben eerder aangetoond dat de interactie tussen HIF-1 en de familie transcriptiefactor Ets GA-bindend-proteïne (GABP) in hypoxische P19 cellen, die tot de reactie van de Hes1 -promotor op hypoxie17 bijdraagt. Hier beschrijven we een co-immunoprecipitation protocol om te studeren van PPIs tussen endogene nucleaire eiwitten hypoxische omstandigheden. De interactie tussen HIF-1α en ARNT wordt weergegeven als een proof of concept. Dit protocol is geschikt voor het aantonen van de interacties tussen transcriptiefactoren en transcriptionele co regelgevers hypoxische voorwaarden, met inbegrip van maar niet beperkt tot de identificatie van HIF-1 interacterende eiwitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit gedeelte van het protocol, die gebruik maakt van menselijke embryonale nier 293A (HEK293A) de cel, s volgt de richtsnoeren van de Commissie van de ethiek van de menselijke onderzoek in Nanyang Technological University, Singapore.
1. de inductie van hypoxie in HEK293A cellen
- Bereiden vier 10 cm schotels en zaad 3 – 5 x 106 HEK293A cellen per schotel in 10 mL Dulbecco van Eagle's medium (DMEM, 4.5 g/L glucose bewerkt) aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 110 mg/L natrium pyruvaat, 100 U/mL penicilline en 100 mg / mL streptomycine. Cultuur van de cellen in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
Opmerking: Cel zaaien moet worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast (BSC). De oppervlakken van alle materialen worden geplaatst in de BSC moeten worden afgeveegd met 70% ethanol. - 24 h na het zaaien, wanneer de cellen 80 – 90% confluentie gekomen, twee gerechten in gezet de hypoxie-subchamber in de incubator ' glovebox ' (Zie Tabel van materialen) met 1% O2 en 5% CO2 bij 37 ° C, en houd de andere twee gerechten op normoxia (21% O 2, 5% CO2 bij 37 ° C) voor 4 h. één set normoxic en hypoxische cellen te gebruiken om te evalueren van de behandeling van hypoxie door westelijke vlek en gebruik maken van de andere set cellen voor de co-immunoprecipitation experimenten.
Opmerking: De zuurstofniveaus kunnen worden ingesteld op 0 – 5%, en de duur van de behandeling van hypoxie kan gevarieerd worden afhankelijk van het celtype en studeren doelstelling.
2. de hele cel en nucleaire extractie
Opmerking: Zie tabel 1 voor meer informatie over buffers gebruikt in dit protocol.
-
Oogst de normoxia cellen.
- Verwijderen van de voedingsbodems door aspiratie en spoel de cellen met 10 mL DPBS (PH 7.0-7.2) met behulp van een precisiepipet 10 mL.
Opmerking: Raak de enkelgelaagde van de cel met het pipet. Tijdens het wassen, Pipetteer zachtjes de DPBS onderaan de muur van de cel cultuur plaat om te voorkomen dat het verlies van de cel. - Pipetteer 5 mL ijskoud DPBS in de plaat en de cellen uit het oppervlak van de plaat in ijskoude PBS met een cel schraper Schraap.
- Spoel de celsuspensie in 15 mL conische buizen en houd op ijs.
- Verwijderen van de voedingsbodems door aspiratie en spoel de cellen met 10 mL DPBS (PH 7.0-7.2) met behulp van een precisiepipet 10 mL.
-
Het oogsten van de cellen gekweekt hypoxische omstandigheden.
- Vooraf equilibreer de DPBS hypoxische voorwaarden door het plaatsen van een ongedekte 100 mL experiment glazen reagens fles gevuld met DPBS in de subchamber van hypoxie (1% O2 en 5% CO2 bij 37 ° C) gedurende 24 uur op voorhand.
- Ongeveer 1 uur vóór het oogsten van de cellen van hypoxie behandeld, plaats een koelbox met ijs in de kamer van de verwerking van de ' glovebox ', die heeft zijn geëquilibreerd 1% O2 en 5% CO2. Overdracht van de fles met de vooraf equilibrated hypoxische DPBS van de subchamber van hypoxie in de zaal van de verwerking en plaats deze op het ijs.
- 4 uur na de behandeling van hypoxie, overbrengen in de cellen van de hypoxie-subchamber de verwerking kamer die al vooraf equilibrated 1% O2 en 5% CO2.
- Verwijderen van de voedingsbodems door aspiratie en spoel de cellen zodra met 10 mL Pipetteer ijskoude vooraf zijn geëquilibreerd hypoxische DPBS met een 10 mL.
- Voeg 5 mL ijskoud vooraf zijn geëquilibreerd DPBS met 5 mL Pipetteer en verjagen de cellen door schrapen met een cel schraper.
- Kantelen van de cel cultuur plaat en het verzamelen van de vrijstaande cellen met behulp van een precisiepipet 10 mL. Spoel de celsuspensie in DPBS in 15 mL conische buizen en houd op ijs.
- Open de deur tussen de verwerking en buffer kamers van de ' glovebox ', die beide vooraf equilibrated naar 1% O2 en 5% CO2 zijn. Overdracht van de conische buisjes van 15 mL op ijs met hypoxie behandeld cellen uit de zaal van de verwerking naar de kamer van de buffer. Open de deur van de kamer van de buffer en de cellen volledig te verwijderen uit de ' glovebox '.
- Zowel de cellen van de normoxic van 2.1 en de hypoxische cellen van 2.2 pellet door centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
-
Bereid de hele cel extracten.
- Resuspendeer de cel pellets in 500 µL van ijskoude radio immunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer met 50 mM Trisaminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) pH 8.0, 150 mM natriumchloride (NaCl), 1% tergitol-type NP-40 (NP-40), 0,5% natrium deoxycholate, en 0,1% natrium dodecyl sulfaat (SDS), aangevuld met 1 x proteaseinhibitor cocktail (Zie Tabel van materialen) waarbij de cel pellets op en neer meerdere malen.
- Breng de cel lysates in nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buizen en houd op ijs voor 30 min met de occasionele vortexing.
- Centrifugeer de cel lysates bij 13.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- Het supernatant, aliquoot 50 µL van het supernatant in 1,5 mL microcentrifuge buizen verzamelen en opslaan bij-80 ° C.
-
Voorbereiden van de nucleaire extracten met behulp van een nucleaire extractie kit (zie tabel van materialen).
- Zachtjes resuspendeer de cel pellets in 500 µL van lysis buffer NL aangevuld met 1 x proteaseinhibitor cocktail en 0,1 M dithiothreitol (DTT) waarbij de cel pellets op en neer meerdere malen.
- 25 µL van schoonmaakmiddel NP toevoegen aan de celsuspensie en vortex voor 10 s op maximale snelheid.
- Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Het supernatant (cytoplasmatische extracten), aliquoot 50 µL van het supernatant in 1,5 mL microcentrifuge buizen, verzamelen en opslaan bij-80 ° C.
- Resuspendeer de pellet met celkernen in 500 µL van lysis buffer NL aangevuld met 1 x proteaseinhibitor cocktail en 0,1 M DTT met vortexing voor 5 s op maximale snelheid.
- Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en sla de nucleaire pellet.
- Resuspendeer de pellet van nucleaire in 50 µL van extractie Buffer NX1 aangevuld met 1 x proteaseinhibitor cocktail met pipetteren de pellet op en neer meerdere malen.
- Incubeer gedurende 30 min op ijs, vortexing voor 10 s elke 5 minuten op maximale snelheid.
- Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
-
Desalt de nucleaire extracten.
- Het supernatant van stap 2.5.9 en overdracht in de mini dialyse-apparaten met een maximumvolume van 100 µL per eenheid verzamelen.
- Cap de mini dialyse-apparaten en plaats ze in een flotatie-apparaat.
- De flotatie-apparaat te zetten in een bekerglas van 500 mL pre gekoeld dialyse buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 20% glycerol, 100 mM kaliumchloride (KCl), 0,2 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA), 0,2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) en 0,5 mM DTT) en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C met zachte roeren.
Let op: PMSF is gevaarlijk. Vermijd direct contact met de huid of bij inademing. - Verzamelen van de monsters van de hoek van de mini dialyse-apparaten en breng in nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buizen.
- Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C, aliquoot 25 µL van elke bovendrijvende substantie in een 1,5 mL microcentrifuge buis, en opslaan bij-80 ° C.
3. evaluatie van de behandeling van hypoxie door detectie van het eiwit expressie en Subcellular Localisatie van HIF-1α
- Bepaal de concentratie van de eiwitten van de hele cel of nucleaire/cytoplasmatische extracten met behulp van de microplate-bepaling van een bicinchoninic zuur (BCA) eiwit assay kit volgens fabrikant instructies18.
- Verdun de cel lysates in 1 x Laemmli monster buffer met 5% 2-Mercaptoethanol en kook bij 95 ° C gedurende 5 min.
Let op: Raak het oppervlak van het blok van de verwarming, niet omdat het kan brandwonden veroorzaken. -
Scheid de eiwitten door elektroforese natrium dodecyl sulfaat polyacrylamidegel (SDS-pagina).
- Gelijke hoeveelheden eiwit (25 µg) in elk putje van een SDS-pagina voorgegoten kleurovergang gelen (4-20%), samen met 3 µL van het molecuulgewicht markering laden.
- Stel de gel in het runnen van de buffer met 2.5 mM Tris, 19,2 mM glycine, 0,01% SDS, PH8.3 gedurende 30 minuten bij 200 V.
-
De eiwitten aan uit de gel overbrengen in het membraan van het nitrocellulose.
- Voeg de overdracht sandwich (filtreerpapier-gel-membraan-filtreerpapier) met de gel op de kant van de anode en de membraan op de kathode-kant van de cassette.
- Plaats de cassette in de overdracht tank gevuld met overdracht buffer met 2.5 mM trisaminomethane (Tris), 19,2 mM glycine en 20% methanol.
Let op: Methanol is brandbaar en binnen het kabinet ontvlambare vloeibare opslag moet worden opgeslagen. - Verrichten de overdracht gedurende 1 uur bij 100 V in de koelruimte.
- Het blokkeren van de vlek in 10 mL blokkeerbuffer met 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0.1 Tween-20 en 5% non-fat melk gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een shaker.
- Incubeer de vlek met anti-HIF-1α antilichaam (1/500 verdunning) in de dezelfde blokkeerbuffer 's nachts bij 4 ° C.
- Wassen van de vlek 3 keer voor 5 min telkens met 50 mL TBS-T.
- Incubeer de vlek met horseradish peroxidase (HRP)-geconjugeerd secundair antilichaam (1/1000 verdunning) in 10 mL TBS-T met 5% vetvrije droge melk gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Wassen van de vlek 3 keer voor 5 min telkens met 50 mL TBS-T.
- Mix 500 µL, elk voor verbeterde chemilumescent (ECL) reagens A en B in een tube van 1,5 mL microcentrifuge en vortex kort.
- Het ECL substraat van toepassing op de vlek en laat 1 minuut bij kamertemperatuur inwerken.
-
Vangen de chemiluminescentie signalen met behulp van een charge - coupled apparaat (CCD) camera gebaseerde imaging systeem.
- Afvoer van overtollige ECL substraat door het aanraken van de rand van het membraan met een papieren zakdoekje en plaats het membraan in een beschermer van het blad.
- Plaats het membraan op de monster-lade van de CCD camera gebaseerde imaging systeem.
- Lanceren van beeld processing software (Zie Tabel van materialen) en vastleggen van de beelden met de volgende instellingen: bestand → nieuw protocol → enkellijns → Protocol Setup → Gel imaging (toepassing: Chemi; Imaging gebied: Bio-Rad klaar gel; Imaging blootstelling: De software zal automatisch optimaliseren de belichtingstijd voor intense bands) → Run protocol
Opmerking: De belichtingstijd kan handmatig worden ingesteld om de optimale beelden.
4. Immunoprecipitation en detectie van de Immunoprecipitated eiwitten
- Wassen van 50 µL van eiwit A/G sepharose kralen in 500 µL van TBS buffer in 1,5 mL microcentrifuge buizen- and -pellet de kralen door centrifugeren bij 3000 x g gedurende 2 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de kralen in 100 µL van TBS buffer.
- Voeg 2 µL van muis monoklonaal anti-ARNT antilichaam (1,4 mg/mL) of muis immunoglobuline G (IgG) (1,4 mg/mL), dat werd opgesteld door de bijenpopulatie 0.7 mg muis IgG in 500 µL TBS buffer.
- Plaats van de 1,5 mL microcentrifuge buizen met de kralen in een buis rotator en incubeer gedurende 2 h 10 rpm op de koude kamer.
Opmerking: De buizen voorzichtig omgaan en houden de schorsing bevattende de bolletjes onderin de buis. - Pellet de kralen door centrifugeren bij 3000 x g gedurende 2 min bij 4 ° C en gooi het supernatant.
- Verdun 200 µg van het nucleaire eiwit lysate verkregen in stap 2.6.5 in 800 µL van de IP-buffer bestaande uit 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 180 mM NaCl, 20% glycerol, 0,2% NP-40 en 1 x proteaseinhibitor cocktail. Incubeer de lysate met de antilichaam-coupled kralen verkregen in stap 4.5 's nachts bij 4 ° C.
- Pellet de kralen door centrifugeren bij 3000 x g gedurende 2 min bij 4 ° C, gooi het supernatant en wassen van de parels 3 keer met 1 mL ijskoud TBS met 0,2% NP-40.
- Kook de kralen in 50 µL Laemmli monster buffer bij 95 ° C gedurende 5 min.
- Centrifugeer de kralen bij 10.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, verzamelen het supernatant en negeren van de kralen.
Opmerking: Het supernatant kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor de korte termijn of -20 ° C voor de lange termijn. - Detecteren van de aanwezigheid van HIF-1α van de immunoprecipitated-eiwitcomplexen door westelijke vlek zoals hiervoor is beschreven in stap 3.3 vanaf.
Opmerking: Eiwit kwantificering is niet vereist voor deze stap. Laden van hele volume (50 µL) van het supernatans van elk monster in elk putje van een SDS-pagina voorgegoten kleurovergang gelen (4-20%)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om te evalueren van de cellulaire reactie op hypoxie, de expressie niveaus en subcellular localisatie van de componenten van de HIF-1 complexe volgende hypoxie behandeling werden onderzocht. HEK293A cellen werden gekweekte hypoxische voorwaarden voor 4 uur of als besturingselementen op normoxia gehouden. HIF-1α en ARNT eiwitniveaus werden onderzocht in hele cel of nucleaire/cytoplasmatische uittreksels door westelijke vlek. Zoals verwachte, totale HIF-1α niveaus upregulated door hypoxie, waren terwijl ARNT niveaus in totaal cellulaire lysates niet aanzienlijk waren veranderd (figuur 1A). Bovendien, veroorzaakte hypoxie nucleaire accumulatie van zowel HIF-1α en ARNT in HEK293A cellen (figuur 1B), die met de eerdere verslagen, strookt hoewel cytoplasmatische uitdrukking van ARNT niet in een aantal van de geteste cel lijnen19 aangetroffen is.
Daarna, we toonden de interactie tussen HIF-1α en ARNT na hypoxie behandeling. Nucleaire extracten werden bereid uit HEK293A cellen blootgesteld aan normoxic of hypoxische voorwaarden voor 4 h. Co-immunoprecipitation experimenten werden uitgevoerd met behulp van nucleaire extracten uit HEK293A cellen. Zoals blijkt uit Figuur 2, was HIF-1α co-immunoprecipitated samen met ARNT uit de nucleaire extracten van hypoxische HEK293A cellen.
Samen genomen, het protocol beschreven kan met succes worden gebruikt voor het opwekken van een hypoxische reactie in cellen en controleer verdere fysiologische eiwit binding van endogeen uitgedrukt HIF-1α/ARNT complexen in de kern.
Figuur 1: Verordening van eiwit expressie en subcellular localisatie van HIF-1 componenten door hypoxie. (A) Immunoblot analyse van totale HIF-1α of ARNT expressie in HEK293A cellen. De cellen waren blootgesteld aan hypoxie voor 4 h (H) of op normoxia (N) gehouden. Eiwitten van hele cellen extracten werden gescheiden door SDS-PAGE en geanalyseerd door immunoblotting met anti-HIF-1α, anti-ARNT en antilichamen anti-glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH). GAPDH werd gebruikt als een besturingselement laden. (B) Immunoblot analyse van HIF-1α en ARNT expressie in subcellular breuken van HEK293A cellen. HEK293A cellen werden gekweekte hypoxische voorwaarden voor 4 h (H) of op normoxia (N) gehouden. 25 µg eiwit uit nucleaire of cytoplasmatische extracten werden geanalyseerd door immunoblotting met behulp van anti-HIF-1α, anti-ARNT, anti-yin en yang 1 (YY1) en anti-GAPDH antilichamen. YY1 en GAPDH werden gebruikt als het laden van besturingselementen voor nucleaire en cytoplasmatische breuken, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: HIF-1α communiceert met ARNT hypoxische voorwaarden. HEK293A cellen werden blootgesteld aan hypoxie voor 4 uur of als besturingselementen op normoxia gehouden. Nucleaire extracten uit HEK293A cellen waren voorbereid en immunoprecipitations werden uitgevoerd met behulp van een anti-ARNT antilichaam. Nucleaire extracten (input) en immunoprecipitated proteïnen werden geanalyseerd door immunoblotting met anti-HIF-1α, anti-ARNT en anti-YY1 antilichamen. YY1 werd gebruikt als een besturingselement laden voor de ingangen, terwijl IgG werd gebruikt als de negatieve controle voor de co-immunoprecipitation experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Oplossing | Onderdelen | Opmerkingen |
| Dialyse buffer | 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 20% glycerol, 100 mM KCl, 0,2 mM EDTA, 0,2 mM PMSF en 0,5 mM DTT | Voeg PMSF en DTT onmiddellijk vóór gebruik. |
| Lopende buffer | 2.5 mM Tris-HCl (PH 8.3), 19,2 mM glycine en 0,01% SDS | Meng 100 mL 10 x Tris/Glycine/SDS buffer met 900 mL ddH2O. |
| Overdracht buffer | 2.5 mM Tris-HCl (PH 8.3), 19,2 mM glycine en 20% methanol | Meng 100 mL 10 x Tris/Glycine buffer met 200 mL methanol en 700 mL ddH2O. |
| TBS buffer | 50 mM Tris-Cl (pH 7,6) en 150 mM NaCl | Mix 100 mL 10 x TBS buffer met 900 mL ddH2O. |
| TBS-T buffer | 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), 150 mM NaCl en 0,1% Tween 20 | Mix 100 mL 10 x TBS buffer met 900 mL ddH2O en 1 mL tween-20. |
| Buffer met blokkerend | 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20 en 5% vetvrije melk | Los 5 g Blotting-Grade Blocker in 100 mL TBS-T buffer. |
| IP-buffer | 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 180 mM NaCl, 20% glycerol, 0,2% NP-40 en 1 x proteaseinhibitor cocktail | Voeg protease inhibitor cocktail onmiddellijk vóór gebruik. |
Tabel 1: Oplossing voorbereiding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De HIF-1-complex is een meester regulator van cellulaire zuurstof homeostase en regelt een overvloed van genen die betrokken zijn bij verschillende cellulaire adaptieve reacties op hypoxie. Identificatie van nieuwe HIF-1 interacterende eiwitten is belangrijk voor het begrijpen van hypoxische signaaltransductie. Co-immunoprecipitation experimenten worden vaak gebruikt voor PPIs studies af te bakenen Cellulaire signaaltransductie trajecten. Echter, eiwit overexpressie is nog steeds veel gebruikt en dit kan leiden tot experimentele artefacten. Daarnaast HIF-1α is een uiterst instabiele eiwit en het wordt snel aangetaste tijdens Re oxygenatie11. Bovendien triggert hypoxie nucleaire translocatie van HIF-1 componenten in meest zoogdieren cellijnen. Daarom moeten de conventionele co-immunoprecipitation protocollen worden geoptimaliseerd voor de identificatie van fysiologisch relevante HIF-1 interacterende eiwitten na hypoxie behandeling. Hier beschrijven we een gemodificeerde co-immunoprecipitation-protocol dat wordt gebruikt om aan te tonen van de interactie tussen HIF-1α en ARNT op hypoxie.
Om te voorkomen dat de afbraak van de HIF-1α tijdens Re oxygenatie, zijn de hypoxische cellen geoogst binnen de kamer van de verwerking van de incubator ' glovebox ' die was vooraf geëquilibreerd hypoxische voorwaarden. De DPBS was buffer was ook geëquilibreerd hypoxische voorwaarden voor gebruik. Als er geen hypoxie-werkstation beschikbaar voor verwerking, kunnen de hypoxische cellen worden gewassen met vooraf zijn geëquilibreerd hypoxische DPBS en daarna snel geoogst op het ijs. Gezien het feit dat hypoxie leiden de nucleaire translocatie van HIF-1 componenten tot kan en dat eiwit overexpressie artefactual resultaten veroorzaken, werden endogene nucleaire eiwitten gebruikt in dit protocol. Het gebruik van nucleaire fragmenten in het co-immunoprecipitation protocol geweest ook door anderen20gerapporteerd. Het vertegenwoordigt een technische voordeel voor de studie van interacties tussen nucleaire eiwitten, omdat het minimaliseert de kans op nucleaire eiwitten uit wordt verdund uit door geheel-cel eiwitten. Bovendien, het gebruik van nucleaire extracten kan nuttig zijn voor de vermindering van de niet-specifieke interacties, vooral van zeer overvloedig irrelevant cytoplasmatische eiwitten, en voor de verbetering van de nucleaire eiwitstabiliteit door het minimaliseren van de blootstelling aan proteasen aanwezig in het cytoplasma. Het gebruik van endogene nucleaire extracten in plaats van de hele cel extracten voor de co-immunoprecipitation toont een aanzienlijke technische verbetering, als we alleen de interactie tussen HIF-1α en GABPα met behulp van endogene nucleaire extracten maar niet geheel kan detecteren cel extracten17.
In het protocol beschreven, kunnen de verschillende voorwaarden verder ter verbetering van de resultaten worden geoptimaliseerd. We geïnduceerde hypoxie in HEK293A cellen door ze te behandelen met 1% zuurstof voor 4 uur. De zuurstofniveaus en de duur van de behandeling van hypoxie kunnen echter worden gevarieerd voor verschillende soorten cellen en aangepast volgens de doelstellingen van de studie. Bijvoorbeeld, HIF-1α en HIF-2α differentieel regelbaar door hypoxie in een cel type specifieke wijze, met vermelding van hun verschillende rollen in verschillende biologische contexten. Het is aangetoond dat in de cellen van het neuroblastoom, HIF-1α meest actieve gedurende korte perioden van intense hypoxie (1% O2), is terwijl HIF-2α ook actief onder milde hypoxie (5% O2 is) en actiever volgende behandeling van de chronische hypoxie (48-72 uur van wordt hypoxische blootstelling)21. 0 – 5% O2 niveaus worden vaak gebruikt voor in vitro hypoxie behandelingen, waar 1 – 5% O2, 0,1-1% O2 en 0-0,1% O2 worden vaak gedefinieerd als mild hypoxie, hypoxie en Anoxie, respectievelijk22. Zoute concentratie is een andere parameter waarvoor optimalisatie, vooral omdat het speelt een cruciale rol voor Ionische interacties in PPIs23. Nucleaire extracten werden gebruikt in deze studie met de nucleaire eiwitten meestal geëxtraheerd met behulp van een buffer met hoge concentraties van zout. Daarom wellicht de nucleaire extracten worden ontzout voorafgaand aan de co-immunoprecipitation experimenten. Hier, ontzout wij de nucleaire extracten met behulp van een buffer van de dialyse met 100 mM KCl, en de dialyzed extracten gemengd met de IP-buffer met 180 mM NaCl proportioneel aan het bereiken van een definitieve zoutconcentratie dicht bij 150 mM, dat is vergelijkbaar met fysiologische intracellulaire PPIs voorwaarden. De definitieve concentratie van het zout kan worden aangepast afhankelijk van de eigenschappen van de PPIs van belang. In dit protocol werd GAPDH gebruikt als een besturingselement laden voor de hele cel extracten en cytoplasmatische breuken. Wij deden niet kijken elke significante hypoxie-geïnduceerde regelgevende effect is op GAPDH expressie in HEK293A cellen. Echter is GAPDH eerder aangetoond dat upregulated worden door hypoxie in bepaalde cel typen24. Met dit in gedachten, wellicht een alternatieve juiste laden bepaalt wanneer nodig gebruiken25. Afzonderlijk, zien we een aanzienlijk niveau van achtergrond signaal die voortvloeien uit de kralen of antilichamen gebruikt in het huidige protocol. Verklein de achtergrond en kan verlengen de stappen wassen (10-15 min) of uitvoeren van meer dan 3 wasbeurten (5-10 keer). Als alternatief kan de Ionische sterkte van de was-buffer ook worden verhoogd door het titrating van de zoutconcentratie van 150 tot 500 mM tijdens wasbeurten. De lysates kan ook vooraf worden goedgekeurd door het broeden met eiwit A/G sepharose kralen gedurende 1 uur bij 4 ° C met rotatie.
Dit protocol is beperkt tot nucleaire extracten en als zodanig niet geschikt kan zijn voor de studie van PPIs binnen andere cellulaire compartimenten zoals mitochondriën en het endoplasmatisch reticulum. Gelijkaardig aan andere conventionele co-immunoprecipitation protocollen, deze methode niet worden gebruikt om te studeren van PPIs in real-time of om te bepalen als de PPIs direct of indirect zijn.
Kortom bieden wij een gemodificeerde co-immunoprecipitation-protocol voor de identificatie van nieuwe fysiologisch relevante HIF-1 interacterende eiwitten. Dit protocol is ook geschikt voor de studie van de interactie tussen transcriptiefactoren en transcriptionele co regelgevers hypoxische omstandigheden. Hoewel dit protocol speciaal voor de co-immunoprecipitation experimenten onder hypoxia voorwaarden ontworpen is, kan een deel van het beschreven protocol voor de normoxia cellen ook worden gebruikt om te bestuderen van de nucleaire PPIs onder normoxia omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Wij danken Assoc. Prof. Sin Tiong Ong voor het gebruik van het werkstation van hypoxie. Dit werk werd ondersteund door de volgende: Singapore ministerie van onderwijs, MOE 1T1-02/04 en MOE2015-T2-2-087 (naar Y.A.), Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University start-up subsidie M4230003 (P.O.B.), de Zweedse Raad voor onderzoek, de Familie Erling Persson Stichting, de Novo Nordisk Stichting, de Stichting af Jochnick Foundation, de Zweedse vereniging van de Diabetes, de verzekeringsmaatschappij Scandia, het onderzoek naar Diabetes en Wellness Foundation, ligplaats von Kantzow van de Stichting, de Strategische onderzoeksprogramma in Diabetes op Karolinska Institutet, de ERC ERC-2013-AdG-338936-Betalmage, en de Knut en Alice Wallenberg Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4 | 1st BASE | 1415 | |
| Protein A/G Sepharose beads | Abcam | ab193262 | |
| Natural Mouse IgG protein | Abcam | ab198772 | |
| EDTA | Bio-Rad | 1610729 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Blotting-Grade Blocker | Bio-Rad | 1706404 | Non-fat dry milk for western blotting applications |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | Bio-Rad | 1706435 | |
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 1610732 | |
| 10x Tris/Glycine Buffer | Bio-Rad | 1610771 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610374 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | |
| SignalFire ECL Reagent | Cell Signaling | 6883 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-030-CV | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Merck Millipore | 52332 | |
| ARNT/HIF-1 beta Antibody | Novus Biologicals | NB100-124 | Concentration: 1.4 mg/mL |
| HIF-1 alpha Antibody | Novus Biologicals | NB100-479 | Concentration: 1.0 mg/mL |
| YY1 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-46218 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Qproteome Nuclear Protein Kit | Qiagen | 37582 | Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz | sc-47724 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Glycerol (≥99%) | Sigma | G5516 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | 71376 | |
| NP-40 | Sigma | 127087-87-0 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| HEK293A cell line | Thermo Fisher Scientific | R70507 | |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88660 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| QSP gel loading tip | Thermo Fisher Scientific | QSP#010-R204-Q-PK | 1-200 uL |
| Equipment/Instrument | |||
| Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cm | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1658034 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561083 | |
| ChemiDoc XRS+ System | Bio-Rad | 1708265 | |
| I-Glove | BioSpherix | I-Glove | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | BTS1LFTA | |
| Costar 5mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4487 | |
| Costar 10mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4488 | |
| Costar 25mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4251 | |
| Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3631 | |
| 15mL High Clarity PP conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | |
| Small Cell Scraper | Corning | 3010 | |
| Gilson Pipetman L 4-pipettes kit | Gilson | F167370 | P2, P20, P200, P1000 and accessories |
| 1.5mL Polypropylene Microcentrifuge Tubes | Greiner Bio-One | 616201 | |
| PIPETBOY acu 2 Pipettor | INTEGRA Biosciences | 155 000 | |
| Justrite Flammable Liquid Storage Cabinets | Justrite Manufacturing Co. | 896000 | |
| Vortex mixer | Labnet | S0200 | |
| CO2 incubator | NuAire | NU-5820 | |
| Orbital shakers | Stuart | SSL1 | |
| Tube rotator SB3 | Stuart | SB3 | |
| MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002470 | |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004240 | |
| Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device | Thermo Fisher Scientific | 69580 | 10K MWCO, 0.1 mL |
| Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices | Thermo Fisher Scientific | 69588 | |
| LSE Digital Dry Bath Heaters | Thermo Fisher Scientific | 1168H25 | |
| Thermo Scientific 1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 13-261-308 | |
| Software | |||
| Image Lab Software | Bio-Rad | 1709691 |
References
- Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine. Cell. 148 (3), 399-408 (2012).
- Bartels, K., Grenz, A., Eltzschig, H. K. Hypoxia and inflammation are two sides of the same coin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18351-18352 (2013).
- Jiang, B. H., Rue, E., Wang, G. L., Roe, R., Semenza, G. L. Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 271 (30), 17771-17778 (1996).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. J Appl Physiol. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Kallio, P. J., et al. Signal transduction in hypoxic cells: Inducible nuclear translocation and recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factor-1alpha. EMBO J. 17 (22), 6573-6586 (1998).
- Ke, Q., Costa, M. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). Mol Pharmacol. 70 (5), 1469-1480 (2006).
- Gustafsson, M. V., et al. Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state. Dev Cell. 9 (5), 617-628 (2005).
- Zheng, X., et al. Interaction with factor inhibiting HIF-1 defines an additional mode of cross-coupling between the Notch and hypoxia signaling pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3368-3373 (2008).
- D'Ignazio, L., Bandarra, D., Rocha, S. NF-kappaB and HIF crosstalk in immune responses. FEBS J. 283 (3), 413-424 (2016).
- Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5510-5514 (1995).
- Zheng, X., et al. Cell-type-specific regulation of degradation of hypoxia-inducible factor 1 alpha: Role of subcellular compartmentalization. Mol Cell Biol. 26 (12), 4628-4641 (2006).
- Depping, R., et al. Nuclear translocation of hypoxia-inducible factors (HIFs): involvement of the classical importin alpha/beta pathway. Biochim Biophys Acta. 1783 (3), 394-404 (2008).
- Wei, H., et al. Hypoxia induces oncogene yes-associated protein 1 nuclear translocation to promote pancreatic ductal adenocarcinoma invasion via epithelial-mesenchymal transition. Tumour Biol. 39 (5), (2017).
- Chang, H. Y., et al. Hypoxia promotes nuclear translocation and transcriptional function in the oncogenic tyrosine kinase RON. Cancer Res. 74 (16), 4549-4562 (2014).
- Moriya, H.
- Prelich, G. Gene overexpression: Uses, mechanisms, and interpretation. Genetics. 190 (3), 841-854 (2012).
- Zheng, X., et al. A Notch-independent mechanism contributes to the induction of Hes1 gene expression in response to hypoxia in P19 cells. Exp Cell Res. 358 (2), 129-139 (2017).
- Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials. J Vis Exp. (110), e53819 (2016).
- Chilov, D., et al. Induction and nuclear translocation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1): heterodimerization with ARNT is not necessary for nuclear accumulation of HIF-1alpha. J Cell Sci. 112 (Pt 8), 1203-1212 (1999).
- Yin, S., et al. Arylsulfonamide KCN1 inhibits in vivo glioma growth and interferes with HIF signaling by disrupting HIF-1alpha interaction with cofactors p300/CBP. Clin Cancer Res. 18 (24), 6623-6633 (2012).
- Holmquist-Mengelbier, L., et al. Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype. Cancer Cell. 10 (5), 413-423 (2006).
- Koh, M. Y., Powis, G. Passing the baton: The HIF switch. Trends Biochem Sci. 37 (9), 364-372 (2012).
- Dumetz, A. C., Snellinger-O'brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization. Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).
- Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia. J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).
- Caradec, J., et al. Desperate house genes': The dramatic example of hypoxia. Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).
