Summary
כאן נתאר פרוטוקול co-immunoprecipitation ללמוד אינטראקציות חלבון בין חלבונים גרעיניים אנדוגני בתנאים ובשפתיים. שיטה זו מתאימה הפגנה של אינטראקציות בין גורמי שעתוק גנים ברמת השעתוק הרגולטורים שותף ב היפוקסיה.
Abstract
רמות חמצן נמוכות (היפוקסיה) לעורר מגוון תגובות מסתגלת עם הגורם היפוקסיה-inducible 1 (HIF-1) מורכבים מתנהג כמו הרגולטור הראשי. HIF-1 כוללת יחידת משנה α מוסדר חמצן heterodimeric (HIF-1α) והביע צורונים β יחידה משנית (HIF-1β) הידוע גם בשם aryl פחמימן קולטן הגרעין translocator (ARNT), ויסות גנים המעורבים בתהליכים מגוונים כולל אנגיוגנזה , אריתרופויזה, גליקוליזה. זיהוי חלבונים שמעצבת HIF-1 היא המפתח להבנת היפוקסיה איתות. מלבד ויסות HIF-1α יציבות, היפוקסיה מפעיל גם רוברטסונית הגרעין של גורמי שעתוק רבים כולל HIF-1α ו- ARNT. ראוי לציין, מרבית השיטות הנוכחיות המשמשות ללימוד כזה אינטראקציות חלבון-חלבון (להדברה) מבוססים על מערכות שבו רמות החלבון גדלו באופן מלאכותי באמצעות ביטוי חלבון. ביטוי חלבון לעיתים קרובות מובילה לתוצאות-פיזיולוגיים הנובעים חפצים הגיאופוליטיות והמרחביות טמפורלית. כאן נתאר co-immunoprecipitation שונה של פרוטוקול בעקבות טיפול היפוקסיה באמצעות חלבונים גרעיניים אנדוגני, וכהוכחה של המושג, כדי להציג את האינטראקציה בין HIF-1α ARNT. פרוטוקול זה, התאים ובשפתיים נבצרו בתנאים שתקבעו, מאגר שטיפת מלוחים Phosphate-Buffered (DPBS) של Dulbecco היה גם מראש equilibrated לתנאים ובשפתיים לפני השימוש כדי להמתיק חלבון השפלה או החלבונים דיסוציאציה במהלך reoxygenation. בנוסף, שברים גרעיני חולצו לאחר מכן להתרכז, ייצוב חלבונים גרעיניים אנדוגני, להימנע מתוצאות כדין ניתן לראות לעיתים קרובות במהלך ביטוי חלבון. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להדגים אנדוגני, יליד האינטראקציות בין גורמי שעתוק, תעתיק שיתוף הרגולטורים בתנאים ובשפתיים.
Introduction
היפוקסיה מתרחשת כאשר חמצן לקוי מסופקים של תאים ורקמות של הגוף. זה ממלא תפקיד קריטי תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים כגון התמיינות תאי גזע, דלקת סרטן1,2. היפוקסיה-inducible גורמים (לשתול) לפעול heterodimers מורכב של יחידת משנה של α מוסדר חמצן של יחידת משנה של β צורונים ביטוי ידוע גם ARNT3. שלושה איזופורמים של subunits HIF-α (HIF-1α, HIF-2α ו- HIF-3α), שלושה subunits HIF-β (ARNT/HIF-1β, ARNT2 ו- ARNT3) זוהו עד כה. HIF-1α ו- ARNT ubiquitously מבוטאים, ואילו HIF-2α, HIF-3α, ARNT2, ARNT3 שיש יותר מוגבלת דפוסי ביטוי4. החלבונים HIF-1 הוא המתקן מפתח של התגובה היפוקסיה. בתנאים שתקבעו, HIF-1α הופך התייצב, ואז translocates את הגרעין, dimerizes עם ARNT5. לאחר מכן, מתחם זה נקשר נוקלאוטידים ספציפיים המכונה רכיבי מגיב היפוקסיה (HREs), מסדיר את הביטוי של היעד גנים המעורבים בתהליכים מגוונים כולל אנגיוגנזה, אריתרופויזה, גליקוליזה6. בנוסף תגובה זו "קנונית", מסלול איתות היפוקסיה ידוע גם crosstalk עם תגובת תאי מרובים איתות משעולים כגון חריץ גרעיני גורם-kappa B (NF-κB)7,8,9.
זיהוי חלבונים שמעצבת את הרומן HIF-1 חשוב להבין טוב יותר היפוקסיה איתות. בניגוד ARNT, אשר הוא רגישות רמות החמצן צורונים ביטוי, רמות חלבון HIF-1α מוסדרים בחוזקה על ידי רמות החמצן הסלולר. Normoxia (21% חמצן), חלבונים HIF-1α הם מפורק במהירות10,11. מחצית החיים הקצר של HIF-1α-normoxia מציג אתגרים טכניים ספציפיים עבור זיהוי החלבון מן התא תמציות, כמו גם לצורך זיהוי חלבונים HIF-1α-אינטראקציה. יתר על כן, מספר גורמי שעתוק, כולל אלה של המתחם HIF-1 translocate לתוך הגרעין תחת תנאים ובשפתיים12,13,14. רוב השיטות הנוכחי המשמש ללימודי PPI מבוצעות באמצעות ביטוי-פיזיולוגיים של חלבונים. ביטוי חלבון כזה דווח כדי לגרום למומים הסלולר שונים באמצעות מנגנונים מרובים כולל עומס יתר של משאבים, חוסר איזון stoichiometric, אינטראקציות מופקרת של מסלול אפנון15,16. מבחינת לימודי PPI, ביטוי חלבון יכול להוביל שלילי חיובי, או אפילו שקר שקר, תוצאות בהתאם החלבון המאפיינים והפונקציות של חלבונים overexpressed. לכן, השיטות ללימודי PPI חייב להיות שונה על מנת לחשוף את להדברה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית בתנאים ובשפתיים. בעבר הראו את האינטראקציה בין HIF-1 גורם שעתוק משפחה של Ets GA מחייב חלבון (GABP) בתאי P19 מחוסר חמצן, אשר תורמת התגובה של האמרגן Hes1 היפוקסיה17. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול co-immunoprecipitation ללמוד להדברה בין חלבונים גרעיניים אנדוגני בתנאים ובשפתיים. האינטראקציה בין HIF-1α ו- ARNT מוצג בתור הוכחה של המושג. פרוטוקול זה מתאים הממחיש את האינטראקציות בין גורמי שעתוק גנים ברמת השעתוק הרגולטורים לעבודה בתנאים שתקבעו, לרבות אך לא רק לזיהוי של חלבונים שמעצבת HIF-1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
סעיף זה פרוטוקול, אשר משתמשת כליה אנושית עובריים 293A תא (HEK293A), s מנחים את ועדת האתיקה האנושית מחקר בסינגפור, אוניברסיטת הטכנולוגי Nanyang.
1. אינדוקציה של היפוקסיה בתאים HEK293A
- הכינו ארבע מנות 10 ס מ ואת הזרע 3-5 x 10 תאים6 HEK293A לכל מנה ב- 10 מ"ל של Dulbecco שונה בינוני של הנשר (DMEM, גלוקוז 4.5 g/L) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), 2 מ מגלוטמין, 110 מ ג/ליטר נתרן פירובט, 100 פניצילין U/mL, 100 מ ג / mL סטרפטומיצין. התרבות התאים 37 ° C, 5% CO2 מיכלים.
הערה: תא זריעה צריכה להתבצע ב בטיחות ביולוגית cabinet (BSC). המשטחים של כל החומרים להציב BSC שאמור להימחק עם 70% אתנול. - 24 שעות לאחר זריעה, כאשר התאים הגיעו 80-90% confluency, להכניס שתי מנות היפוקסיה subchamber בתא הכפפות חממה (ראה טבלה של חומרים) עם 1% או2 ו- 5% CO2 -37 מעלות צלזיוס, והשאר השניים האחרים מנות ב- normoxia (21% O 2, 5% CO2 ב 37 ° C) במשך 4 h להשתמש ערכה אחת של normoxic ותאים ובשפתיים להעריך את הטיפול היפוקסיה מאת תספיג ולנצל את הסט השני של תאים עבור הניסויים co-immunoprecipitation.
הערה: רמות החמצן ניתן להגדיר ב- 0 – 5%, וכן את משך הזמן של הטיפול היפוקסיה יכולים להיות מגוונים בהתאם לסוג התא וללמוד אובייקטיבי.
2. כל תא והפקת גרעינית
הערה: ראה טבלה 1 למידע על מאגרי בשימוש בפרוטוקול זה.
-
לקצור תאי בקרה normoxia.
- להסיר את התקשורת התרבות על ידי השאיפה ולשטוף את התאים עם 10 מ"ל DPBS (PH 7.0-7.2) באמצעות פיפטה של 10 מ"ל.
הערה: להימנע מלגעת חד שכבתי את התא עם פיפטה. במהלך הכביסה, pipette בעדינות את DPBS מטה לאורך הקיר של צלחת התרבות התא כדי למנוע איבוד תאים. - פיפטה 5 מ"ל DPBS הקר המשקולת לשפשף את התאים מעל פני השטח של הצלחת ב- PBS קר כקרח עם המגרד התא.
- להעביר את המתלים תא לתוך צינורות חרוט 15 מ"ל ולשמור על קרח.
- להסיר את התקשורת התרבות על ידי השאיפה ולשטוף את התאים עם 10 מ"ל DPBS (PH 7.0-7.2) באמצעות פיפטה של 10 מ"ל.
-
לקצור את התאים תרבותי בתנאים ובשפתיים.
- Equilibrate את DPBS לתנאים ובשפתיים מראש על-ידי הצבת חשפו 100 mL ניסוי ריאגנט בקבוק זכוכית מלאים DPBS ב subchamber היפוקסיה (1% או2 ו- 5% CO2 ב 37 ° C) במשך 24 שעות מראש.
- כ 1 h לפני הקטיף תאי היפוקסיה מטופלים, מקום מקרר המכיל קרח לתוך התא עיבוד של בתא הכפפות, אשר יש כבר equilibrated 1% או2 , 5% CO2. להעביר את הבקבוק המכיל את DPBS שתקבעו מראש equilibrated מן subchamber היפוקסיה אל התא עיבוד ומניחים אותו על קרח.
- 4 שעות לאחר הטיפול היפוקסיה, להעביר את התאים היפוקסיה subchamber תא עיבוד כי כבר מראש equilibrated 1% או2 , 5% CO2.
- להסיר את התקשורת התרבות על ידי השאיפה ולשטוף את התאים ברגע עם 10 מ"ל כקרח DPBS שתקבעו מראש equilibrated עם 10 מ"ל פיפטה.
- הוסף 5 מ ל DPBS מראש equilibrated קר כקרח 5 מ ל פיפטה ועוקרות התאים על ידי גירוד עם המגרד התא.
- להטות את הצלחת תרבות תא ולאסוף את התאים מנותקים באמצעות פיפטה של 10 מ"ל. להעביר התליה תא ב DPBS לתוך צינורות חרוט 15 מ"ל ולשמור על קרח.
- פתח את הדלת. בין העיבוד ומאגר לאהלי בתא הכפפות, אשר שניהם כבר מראש equilibrated ל- 1% O2 ו- 5% CO2. העברת הצינורות חרוט 15 מ"ל על הקרח המכיל תאים היפוקסיה מטופלים מן החדר עיבוד לתא מאגר. לפתוח את הדלת של החדר מאגר, להסיר התאים לחלוטין בתא הכפפות.
- גלולה הן התאים normoxic מ 2.1 והן תאים ובשפתיים מן 2.2 על ידי צנטריפוגה ב x 1000 g למשך 5 דקות ב 4 º C.
-
להכין כל התא תמציות.
- Resuspend כדורי תא ב- 500 µL רדיו כקרח immunoprecipitation assay (ריפה) פירוק מאגר המכיל 50 מ"מ Trisaminomethane הידרוכלוריד (טריס-HCl) pH 8.0, 150 מ מ נתרן כלורי (NaCl), 1% tergitol-סוג NP-40 (NP-40), 0.5% נתרן deoxycholate, ו 0.1% dodecyl סולפט נתרן (מרחביות), בתוספת 1 x מעכב פרוטאז קוקטייל (ראה טבלה של חומרים) על ידי pipetting כדורי תא לאורך מספר פעמים.
- להעביר את lysates תא לתוך צינורות microcentrifuge החדש של 1.5 mL ולשמור בקירור למשך 30 דקות עם vortexing מדי פעם.
- Centrifuge את lysates תא ב x 13,000 g 10 דקות ב 4 º C.
- לאסוף את µL 50 supernatant, aliquot של תגובת שיקוע לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 mL, ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
-
הכנת תמציות גרעינית באמצעות מיצוי הגרעין של קיט (ראה טבלה של חומרים).
- Resuspend בעדינות את כדורי תא µL 500 של פירוק מאגר NL בתוספת 1 x מעכב פרוטאז קוקטיילים ו- 0.1 M dithiothreitol (DTT) מאת pipetting כדורי תא לאורך מספר פעמים.
- להוסיף 25 µL של דטרגנט פתרון NP תא ההשעיה, מערבולת 10 s במהירות המרבית.
- צנטריפוגה ב 10,000 x g למשך 5 דקות ב 4 º C.
- לאסוף את תגובת את (תמציות cytoplasmic), שיקוע aliquot 50 µL של תגובת שיקוע לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 mL, ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
- Resuspend בגדר המכיל גרעינים תא ב- 500 µL פירוק מאגר NL בתוספת 1 x מעכב פרוטאז קוקטיילים ו- 0.1 M DTT על ידי vortexing על 5 s במהירות המרבית.
- צנטריפוגה ב x 10,000 g למשך 5 דקות ב 4 ° C ולשמור בגדר גרעינית.
- Resuspend בגדר גרעינית ב- 50 µL של מיצוי מאגר NX1 בתוספת 1 x מעכב פרוטאז קוקטייל על-ידי pipetting בגדר לאורך מספר פעמים.
- תקופת דגירה של 30 דקות על קרח, vortexing 10 s כל 5 דקות במהירות המרבית.
- צנטריפוגה ב 12,000 x g 10 דקות ב 4 º C.
-
Desalt תמציות גרעינית.
- לאסוף את תגובת שיקוע שלב 2.5.9 והעברת לתוך המכשירים דיאליזה מיני עם נפח מרבי של µL 100 לכל יחידה.
- קאפ המכשירים דיאליזה מיני ומניחים השטה.
- לשים את חגורת הצלה גביע המכיל 500 מ"ל של מאגר צוננת טרום דיאליזה (20 מ מ טריס-HCl pH 7.4, גליצרול 20%, 100 מ מ אשלגן כלורי (אשלגן), 0.2 מ מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), 0.2 מ מ phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PMSF) ו- 0.5 מ מ DTT) תקופת דגירה של 30 דקות ב 4 ° C עם ערבוב עדין.
התראה: PMSF. הוא דבר מסוכן להימנע ממגע ישיר עם העור או באינהלציה. - לאסוף הדגימות מן הפינה של המכשירים דיאליזה מיני ולהעביר לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 mL החדש.
- צנטריפוגה ב x 12,000 g 10 דקות ב 4 ° C, aliquot 25 µL של כל תגובת שיקוע לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL, ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
3. הערכת הטיפול היפוקסיה על ידי זיהוי של ביטוי חלבון ו- Subcellular לוקליזציה של HIF-1α
- לקבוע את ריכוז חלבון כל התא או גרעיני/cytoplasmic תמציות באמצעות וזמינותו microplate של bicinchoninic חומצה (BCA) חלבון assay ערכת לפי הוראות היצרן18.
- לדלל את lysates תא 1 מאגר מדגם x Laemmli, המכילה 5% מרקפטואתנול והרתיחו ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
התראה: אל תיגע השטח של בלוק חימום, שכן הוא עלול לגרום לכוויות. -
להפריד את החלבונים על-ידי נתרן dodecyl סולפט לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד).
- לטעון כמויות שוות של חלבון (25 µg) כל טוב של ג'ל הדרגתיות מרחביות-דף טרומיים (4 – 20%), יחד עם 3 µL של דה מרקר משקל מולקולרי.
- להפעיל את הג'ל הפעלת מאגר המכיל 2.5 מ"מ טריס, גליצין 19.2 מ"מ, מרחביות 0.01%, PH8.3 במשך 30 דקות ב- 200 וולט.
-
להעביר את החלבונים כדי מן הג'ל קרום ניטרוצלולוזה.
- להרכיב את הכריך העברה (נייר סינון-ג'ל-ממברנה-מסנן נייר) עם הג'ל על הצד אנודת ואת הקרום בצד קטודית בקלטת.
- מקם את הקלטת במיכל העברת מלא עם העברת מאגר המכיל trisaminomethane 2.5 מ מ (טריס), 19.2 מ"מ גליצין ו- 20% מתנול.
התראה: מתנול הוא דליק ויש לאחסנו בתוך האחסון נוזל דליק בארון. - לבצע את ההעברה עבור 1 h ב- 100 וולט החדר הקרה.
- לחסום את האבן החשופה במאגר חסימה 10 מ"ל המכיל 50 מ"מ טריס-קלרנית (pH 7.6), 150 מ מ NaCl, 0.1 Tween 20 ו- 5% שומן חלב לשעה בטמפרטורת החדר על מטרף.
- דגירה את האבן החשופה עם נוגדן anti-HIF-1α (1/500 דילול) במאגר חסימה באותו לילה ב 4 º C.
- לשטוף את האבן החשופה 3 פעמים במשך 5 דקות בכל פעם עם 50 מל TBS-טי
- דגירה את האבן החשופה עם חזרת peroxidase (HRP)-נוגדנים משניים מצומדת (1/1000 דילול) ב- 10 מ"ל TBS-T המכילה 5% שומן חלב יבש לשעה בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את האבן החשופה 3 פעמים במשך 5 דקות בכל פעם עם 50 מל TBS-טי
- מיקס 500 µL כל של chemilumescent משופרת (ECL) ריאגנט A ו- B צינור microcentrifuge 1.5 mL ו מערבולת בקצרה.
- להחיל את המצע ECL האבן החשופה, תקופת דגירה של 1 דקות בטמפרטורת החדר.
-
ללכוד את אותות chemiluminescent באמצעות של תשלום מצמידים מכשיר (CCD) מערכת הדמיה מבוסס מצלמה.
- ניקוז עודפי ECL המצע על ידי לגעת בקצה של הקרום עם נייר טישו ולמקם את הקרום מגן גיליון.
- במקום הקרום על המגש דגימה של ה-CCD מצלמה המבוסס על מערכת הדמיה.
- השקת תוכנת עיבוד תמונה (ראה טבלה של חומרים) ללכוד התמונות עם ההגדרות הבאות: קובץ ← החדש פרוטוקול → ערוץ אחד ← ההתקנה הפרוטוקול ← ג'ל הדמיה (יישום: חמי; איזור הדמיה: ביו-ראד מוכן ג'ל; הדמיה חשיפה: התוכנה יהיה באופן אוטומטי לייעל את זמן החשיפה ללהקות אינטנסיבי) ← בניהול הפרוטוקול
הערה: זמן החשיפה ניתן להגדיר באופן ידני כדי להשיג את התמונות אופטימלית.
4. Immunoprecipitation וזיהוי של החלבונים Immunoprecipitated
- 50 µL של חלבון A/G sepharose חרוזים ב µL 500 TBS מאגר 1.5 mL microcentrifuge צינורות וקונטה הצניפה החרוזים על ידי צנטריפוגה ב x 3000 g למשך 2 דקות ב 4 º C.
- למחוק את תגובת שיקוע, resuspend את החרוזים ב 100 µL מאגר TBS.
- להוסיף 2 µL של נוגדן monoclonal anti-ARNT העכבר (1.4 מ"ג/מ"ל) או עכבר אימונוגלובולין G (IgG) (1.4 מ"ג/מ"ל) זה הוכן על ידי לשחזר מ"ג 0.7 העכבר IgG במאגר TBS 500 µL.
- מקם הצינורות microcentrifuge 1.5 mL המכיל את החרוזים ב rotator שפופרת ולאחר תקופת דגירה של 2 h ב- rpm 10 בחדר הקר.
הערה: להתמודד עם הצינורות בעדינות ולשמור את המתלים המכיל את החרוזים בחלק התחתון של הצינור. - גלולה החרוזים על ידי צנטריפוגה ב x 3000 g למשך 2 דקות ב 4 ° C וזורקים את supernatants.
- לדלל µg 200 של גרעיני החלבון lysate ב שלב 2.6.5 ב 800 µL של המאגר IP בהיקף של 50 מ מ טריס-HCl (pH 7.4), 180 מ"מ NaCl, 20% גליצרול, מעכבי פרוטאז NP-40 ו- 1 x 0.2% קוקטייל. דגירה של lysate עם החרוזים מצמידים נוגדן שהושג בשלב 4.5 בן לילה ב 4 º C.
- גלולה החרוזים על ידי צנטריפוגה ב x 3000 g למשך 2 דקות ב 4 ° C, למחוק את supernatants ולשטוף את החרוזים 3 פעמים עם 1 מ"ל TBS כקרח המכיל 0.2% NP-40.
- מרתיחים את החרוזים מאגר מדגם Laemmli µL 50-95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
- Centrifuge את החרוזים ב x 10,000 g למשך 5 דקות ב 4 ° C, לאסוף את תגובת שיקוע, ולמחוק את החרוזים.
הערה: תגובת שיקוע שניתן לאחסן ב 4 ° C לטווח הקצר או-20 ° C לטווח ארוך. - לזהות הנוכחות של HIF-1α מ מתחמי חלבון immunoprecipitated על ידי תספיג כאמור שמתואר בשלב 3.3 ואילך.
הערה: חלבון כימות אין צורך בשלב זה. לטעון בפול ווליום (50 µL) של תגובת שיקוע של כל מדגם לתוך כל טוב של ג'לים הדרגתיות מרחביות-דף טרומיים (4 – 20%)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להעריך את התגובה התאית היפוקסיה, הביטוי נבדקו רמות ולוקליזציה subcellular של רכיבי HIF-1 מתחם הבאים היפוקסיה הטיפול. HEK293A תאים בתרבית בתנאים ובשפתיים במשך 4 שעות או שמרו ב normoxia כפקדים. רמות חלבון HIF-1α ו- ARNT נבחנו בתא כל או תמציות גרעיני/cytoplasmic מאת תספיג חלבון. כמו הצפוי, הכולל רמות HIF-1α היו upregulated על ידי היפוקסיה, ואילו רמות ARNT סה כ lysates הסלולר לא היו באופן משמעותי שינו (איור 1 א'). בנוסף, היפוקסיה המושרה גרעיני הצטברות HIF-1α וגם ARNT בתאים HEK293A (איור 1B), דבר העולה בקנה אחד עם דוחות קודמים, למרות cytoplasmic הביטוי של ARNT לא זוהה בכמה קווי בדוקות תא19.
בשלב הבא, להדגים את האינטראקציה בין HIF-1α ARNT לאחר הטיפול היפוקסיה. תמציות גרעיני הוכנו מתאי HEK293A נחשפים normoxic או תנאים ובשפתיים לניסויים 4 h Co-immunoprecipitation בוצעו באמצעות תמציות גרעיני מתאי HEK293A. כפי שמוצג באיור2, HIF-1α היה co-immunoprecipitated יחד עם ARNT של תמציות הגרעין של תאים HEK293A ובשפתיים.
יחדיו, הפרוטוקול המתואר ניתן להשתמש בהצלחה כדי לגרום לתגובה חמצן בתאים והביע כדי לברר איגוד חלבון פיזיולוגיים של endogenously מתחמי HIF-1α/ARNT בתוך הגרעין.
איור 1: רגולציה של ביטוי חלבון ולוקליזציה subcellular של רכיבים HIF-1 על ידי היפוקסיה. (א) Immunoblot ניתוח הכולל ביטוי HIF-1α או ARNT בתאים HEK293A. התאים היו חשופים היפוקסיה במשך 4 שעות (H), או שמרו ב normoxia (N). חלבונים מן השלם-תא תמציות היו מופרדים על-ידי מרחביות-דף, נותחו על ידי immunoblotting עם אנטי-HIF-1α, אנטי-ARNT, נוגדנים נגד גליצראלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH). GAPDH שימש פקד הטעינה. (B) ניתוח Immunoblot של הביטוי HIF-1α ו- ARNT שברים subcellular של תאים HEK293A. HEK293A תאים בתרבית בתנאים ובשפתיים במשך 4 שעות (H) או שמרו ב normoxia (N). 25 µg של חלבון מן הגרעין או cytoplasmic תמציות נותחו על ידי immunoblotting באמצעות אנטי-HIF-1α, אנטי-ARNT, אנטי-יין ויאנג 1 (YY1), נוגדנים אנטי-GAPDH. YY1, GAPDH שימשו לטעון פקדי לשברים גרעינית, cytoplasmic, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: HIF 1α אינטראקציה עם ARNT בתנאים ובשפתיים. HEK293A התאים היו נחשפים היפוקסיה במשך 4 שעות או שמרו ב normoxia כפקדים. תמציות גרעיני מתאי HEK293A היו מוכנים, immunoprecipitations בוצעו באמצעות נוגדן anti-ARNT. גרעיני תמציות (תשומות), חלבונים immunoprecipitated נותחו על ידי immunoblotting באמצעות נוגדנים anti-HIF-1α, אנטי-ARNT, אנטי-YY1. YY1 שימש פקד הטעינה התשומות ואילו IgG שימש הפקד שלילי הניסויים co-immunoprecipitation. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| פתרון | רכיבים | הערות |
| מאגר דיאליזה | 20 מ מ טריס-HCl (pH 7.4), 20% גליצרול, 100 מ מ, אשלגן כלורי 0.2 מ מ EDTA, 0.2 מ מ PMSF ו- 0.5 מ מ DTT | הוסף את PMSF ואת DTT מיד לפני השימוש. |
| מאגר הפעלה | 2.5 מ"מ טריס-HCl (PH 8.3), 19.2 מ"מ גליצין ו- 0.01% מרחביות | לערבב 100 מ ל 10 x טריס/גליצין/מרחביות מאגר עם 900 מל ddH2O. |
| מאגר ההעברה | 2.5 מ"מ טריס-HCl (PH 8.3), 19.2 מ"מ גליצין ו- 20% מתנול | לערבב 100 מ ל 10 x טריס/גליצין מאגר עם מתנול 200 מ ל ו- 700 מ"ל ddH2O. |
| TBS מאגר | 50 מ מ טריס-קלרנית (pH 7.6) ו- 150 מ מ NaCl | לערבב 100 מ ל 10 x TBS מאגר עם 900 מל ddH2O. |
| מאגר TBS-T | 50 מ מ טריס-קלרנית (pH 7.6), 150 מ"מ NaCl ו 0.1% Tween 20 | מיקס 100 מ ל 10 מאגר x TBS עם 900 מל ddH2O ו 1 מ"ל של Tween 20. |
| חסימת מאגר | 50 מ מ טריס-קלרנית (pH 7.6), 150 מ מ NaCl, חלב דל שומן Tween 20 ו- 5% 0.1% | להמיס 5 g הסופג כיתה חוסם במאגר 100 מ ל TBS-T. |
| מאגר ה-IP | 50 מ מ טריס-HCl (pH 7.4), 180 מ"מ NaCl, 20% גליצרול, מעכבי פרוטאז NP-40 ו- 1 x 0.2% קוקטייל | הוסף קוקטייל מעכב פרוטאז מיד לפני השימוש. |
טבלה 1: הכנה פתרון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המתחם HIF-1 הוא מווסת הבסיס של חמצן הסלולר הומאוסטזיס ומסדיר שפע של גנים המעורבים שונים התגובות היפוקסיה מסתגלת הסלולר. זיהוי של הרומן HIF-1 שמעצבת חלבונים חשוב להבנה של אותות ובשפתיים. Co-immunoprecipitation ניסויים משמשים בדרך כלל ללימודי להדברה להתוות מסלולים התמרה חושית אות סלולרי. עם זאת, ביטוי חלבון עדיין נפוצה, זה עשוי להוביל חפצים ניסיוני. בנוסף, HIF-1α הוא חלבון מאוד לא יציב, הוא הופך להיות מפורק במהירות במהלך חמצון מחדש11. בנוסף, היפוקסיה מפעיל רוברטסונית הגרעין של רכיבים HIF-1 שורות תאים יונקים ביותר. לכן, פרוטוקולים קונבנציונאלי co-immunoprecipitation צריך להיות מותאם לצורך זיהוי רלוונטי מבחינה פיזיולוגית HIF-1 שמעצבת חלבונים לאחר הטיפול היפוקסיה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ששונה co-immunoprecipitation המשמש כדי להדגים את האינטראקציה בין HIF-1α ARNT-היפוקסיה.
כדי למנוע ההשפלה של HIF-1α במהלך חמצון מחדש, התאים ובשפתיים נבצרו בתוך התא עיבוד של הכפפות חממה אשר היה מראש equilibrated לתנאים ובשפתיים. המאגר לשטוף DPBS היה equilibrated גם לתנאים ובשפתיים לפני השימוש. אם יש תחנת העבודה אין היפוקסיה זמינים לעיבוד, התאים ובשפתיים ניתן להיות שטוף DPBS שתקבעו מראש equilibrated, לאחר מכן שנקטפו במהירות על קרח. בהתחשב בכך היפוקסיה. יוכל להפעיל רוברטסונית הגרעין של רכיבים HIF-1 ו זה ביטוי חלבון עלול לגרום לתוצאות artefactual, חלבונים גרעיניים אנדוגני שימשו פרוטוקול זה. השימוש של תמציות גרעיני בפרוטוקול co-immunoprecipitation היה גם דיווח על-ידי אחרים20. הוא מייצג יתרון טכני עבור חקר אינטראקציות בין חלבונים גרעיניים, כי היא מקטינה את הסיכוי של חלבונים גרעיניים מ להיות מדולל החוצה על ידי חלבונים שלמים-cell. יתר על כן, השימוש של תמציות גרעיני עשוי להיות מועיל על ההפחתה של אינטראקציות בלתי מסוימים, במיוחד של חלבונים cytoplasmic לא רלוונטי מאוד שופע, ועל שיפור היציבות חלבון גרעיני על-ידי מזעור חשיפה פרוטאזות מציגים בציטופלסמה. השימוש אנדוגני תמציות גרעיני במקום התא כולו תמציות co-immunoprecipitation מציגה שיפור טכני משמעותי, כפי שאנו יכולים רק לגלות את האינטראקציה בין HIF-1α GABPα באמצעות תמציות גרעיני אנדוגני אבל לא באמצעות כל תא תמציות17.
ב פרוטוקול המתואר, מספר תנאים ניתן למטב נוסף כדי לשפר את התוצאות. אנחנו המושרה היפוקסיה בתאים HEK293A אם תתייחס אליהם עם 1% חמצן במשך 4 שעות. עם זאת רמות החמצן ומשך הטיפול היפוקסיה להיות מגוונות לסוגי תאים שונים, מותאם על פי מטרות המחקר. למשל, HIF-1α ו- HIF-2α יכול להיות באופן שונה מוסדר על ידי היפוקסיה סוג התא באופן ספציפי, המציינת את תפקידיהם ברורים בהקשרים ביולוגיים שונים. הוכח כי בתאי נוירובלסטומה, HIF-1α הוא פעיל ביותר במהלך תקופות קצרות של היפוקסיה אינטנסיבי (1% או2), ואילו HIF-2α פעילה גם תחת היפוקסיה מתונה (5% או2) והופך להיות פעיל יותר טיפול כרוני היפוקסיה הבאים (48-72 שעות של חשיפה ובשפתיים)21. 0 – 5% O2 רמות משמשות עבור במבחנה היפוקסיה טיפולים, שבו 1 – 5% O2, 0.1 – 1% או2 , 0 – 0.1% O2 מוגדרים לעתים קרובות מתון היפוקסיה, היפוקסיה ו אנוקסיה, בהתאמה22. ריכוז מלח הינו פרמטר נוסף הדורש אופטימיזציה, במיוחד כי זה משחק תפקיד קריטי עבור אינטראקציות יוניים להדברה23. תמציות גרעיני שימשו במחקר זה עם החלבונים גרעיני בדרך כלל חילוץ באמצעות מאגר המכיל ריכוז גבוה של מלח. לכן, תמציות גרעינית, ייתכן שיהיה עליך להיות desalted לפני הניסויים co-immunoprecipitation. כאן, אנחנו desalted תמציות גרעינית באמצעות מאגר דיאליזה המכיל 100 מ מ אשלגן כלורי, בשילוב תמציות dialyzed עם המאגר IP המכיל 180 מ מ NaCl באופן פרופורציונלי כדי להשיג ריכוז מלח הסופי קרובים 150 מ מ, בדומה פיזיולוגיים תנאים להדברה תאיים. ריכוז מלח הסופי ניתן לשנות בהתאם מאפייני להדברה עניין. ב פרוטוקול זה, GAPDH שימש פקד הטעינה עבור התא כולו תמציות ושברים cytoplasmic. לא נתבונן אל כל היפוקסיה-induced רגולטוריות השפעה משמעותית על הביטוי GAPDH בתאים HEK293A. עם זאת, GAPDH שהוצג בעבר להיות upregulated על ידי היפוקסיה סוגים מסוימים תא24. עם זאת, אחד ייתכן שיהיה עליך להשתמש בפקדים טעינת הנכונה חלופי בעת הצורך25. בנפרד, הבחנו רמה משמעותית של רקע אות הנובעות חרוזים או נוגדנים בשימוש בפרוטוקול הנוכחי. כדי להפחית את הרקע, אפשר להאריך את השלבים כביסה (10-15 דקות) או לבצע יותר מ 3 מנקי (5 – 10 פעמים). לחלופין, כוח יונית המאגר שטיפת יכול גם להיות מוגברת על ידי titrating את ריכוז המלח מ 150 עד 500 מ מ במהלך שוטף. Lysates ניתן גם מראש לנקות על ידי המקננת עם חלבון A/G sepharose חרוזי h 1 ב 4 ° C עם סיבוב.
פרוטוקול זה מוגבל כדי תמציות גרעינית, וככזה מתאים בהכרח לחקר להדברה בתוך אחרים תאים סלולריים כגון המיטוכונדריה את רשתית תוך-פלזמית. בדומה פרוטוקולים אחרים קונבנציונאלי co-immunoprecipitation, שיטה זו לא ניתן להשתמש כדי ללמוד להדברה בזמן אמת או כדי לקבוע אם להדברה ישיר או עקיף.
לסיכום, אנו מספקים פרוטוקול ששונה co-immunoprecipitation הזיהוי של הרומן רלוונטי מבחינה פיזיולוגית HIF-1 שמעצבת חלבונים. פרוטוקול זה מתאים גם לצורך המחקר של האינטראקציות בין גורמי שעתוק, תעתיק שיתוף הרגולטורים בתנאים ובשפתיים. למרות פרוטוקול זה תוכנן במיוחד עבור הניסויים co-immunoprecipitation בתנאים היפוקסיה, חלק הפרוטוקול המתואר עבור התאים בקרה normoxia יכול לשמש גם ללמוד את להדברה גרעיני בתנאים normoxia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
אנו מודים פרופ ' / ח' חטא Tiong אונג לשימוש של תחנת העבודה היפוקסיה. עבודה זו נתמכה על ידי הבאות: סינגפור משרד החינוך, מו 1T1-02/04, MOE2015-T2-2-087 (כדי דיאגנוסטיקה), לי קונג Chian בית הספר לרפואה, אוניברסיטת הטכנולוגי Nanyang סטארט-אפ מענק M4230003 (ת. ד.), המועצה למחקר השבדי, קרן משפחת ארלינג-פרסון, קרן נובו נורדיסק, את af Stichting Jochnick קרן, האגודה לסוכרת שוודית, חברת הביטוח Scandia, במחקר הסוכרת, בריאות קרן, הקרן של דרגש פון Kantzow, תוכנית מחקר אסטרטגי סוכרת-Institutet קרולינסקה, ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage, ואת קנוט אליס ולנברג קרן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4 | 1st BASE | 1415 | |
| Protein A/G Sepharose beads | Abcam | ab193262 | |
| Natural Mouse IgG protein | Abcam | ab198772 | |
| EDTA | Bio-Rad | 1610729 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Blotting-Grade Blocker | Bio-Rad | 1706404 | Non-fat dry milk for western blotting applications |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | Bio-Rad | 1706435 | |
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 1610732 | |
| 10x Tris/Glycine Buffer | Bio-Rad | 1610771 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610374 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | |
| SignalFire ECL Reagent | Cell Signaling | 6883 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-030-CV | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Merck Millipore | 52332 | |
| ARNT/HIF-1 beta Antibody | Novus Biologicals | NB100-124 | Concentration: 1.4 mg/mL |
| HIF-1 alpha Antibody | Novus Biologicals | NB100-479 | Concentration: 1.0 mg/mL |
| YY1 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-46218 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Qproteome Nuclear Protein Kit | Qiagen | 37582 | Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz | sc-47724 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Glycerol (≥99%) | Sigma | G5516 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | 71376 | |
| NP-40 | Sigma | 127087-87-0 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| HEK293A cell line | Thermo Fisher Scientific | R70507 | |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88660 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| QSP gel loading tip | Thermo Fisher Scientific | QSP#010-R204-Q-PK | 1-200 uL |
| Equipment/Instrument | |||
| Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cm | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1658034 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561083 | |
| ChemiDoc XRS+ System | Bio-Rad | 1708265 | |
| I-Glove | BioSpherix | I-Glove | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | BTS1LFTA | |
| Costar 5mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4487 | |
| Costar 10mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4488 | |
| Costar 25mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4251 | |
| Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3631 | |
| 15mL High Clarity PP conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | |
| Small Cell Scraper | Corning | 3010 | |
| Gilson Pipetman L 4-pipettes kit | Gilson | F167370 | P2, P20, P200, P1000 and accessories |
| 1.5mL Polypropylene Microcentrifuge Tubes | Greiner Bio-One | 616201 | |
| PIPETBOY acu 2 Pipettor | INTEGRA Biosciences | 155 000 | |
| Justrite Flammable Liquid Storage Cabinets | Justrite Manufacturing Co. | 896000 | |
| Vortex mixer | Labnet | S0200 | |
| CO2 incubator | NuAire | NU-5820 | |
| Orbital shakers | Stuart | SSL1 | |
| Tube rotator SB3 | Stuart | SB3 | |
| MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002470 | |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004240 | |
| Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device | Thermo Fisher Scientific | 69580 | 10K MWCO, 0.1 mL |
| Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices | Thermo Fisher Scientific | 69588 | |
| LSE Digital Dry Bath Heaters | Thermo Fisher Scientific | 1168H25 | |
| Thermo Scientific 1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 13-261-308 | |
| Software | |||
| Image Lab Software | Bio-Rad | 1709691 |
References
- Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine. Cell. 148 (3), 399-408 (2012).
- Bartels, K., Grenz, A., Eltzschig, H. K. Hypoxia and inflammation are two sides of the same coin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18351-18352 (2013).
- Jiang, B. H., Rue, E., Wang, G. L., Roe, R., Semenza, G. L. Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 271 (30), 17771-17778 (1996).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. J Appl Physiol. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Kallio, P. J., et al. Signal transduction in hypoxic cells: Inducible nuclear translocation and recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factor-1alpha. EMBO J. 17 (22), 6573-6586 (1998).
- Ke, Q., Costa, M. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). Mol Pharmacol. 70 (5), 1469-1480 (2006).
- Gustafsson, M. V., et al. Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state. Dev Cell. 9 (5), 617-628 (2005).
- Zheng, X., et al. Interaction with factor inhibiting HIF-1 defines an additional mode of cross-coupling between the Notch and hypoxia signaling pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3368-3373 (2008).
- D'Ignazio, L., Bandarra, D., Rocha, S. NF-kappaB and HIF crosstalk in immune responses. FEBS J. 283 (3), 413-424 (2016).
- Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5510-5514 (1995).
- Zheng, X., et al. Cell-type-specific regulation of degradation of hypoxia-inducible factor 1 alpha: Role of subcellular compartmentalization. Mol Cell Biol. 26 (12), 4628-4641 (2006).
- Depping, R., et al. Nuclear translocation of hypoxia-inducible factors (HIFs): involvement of the classical importin alpha/beta pathway. Biochim Biophys Acta. 1783 (3), 394-404 (2008).
- Wei, H., et al. Hypoxia induces oncogene yes-associated protein 1 nuclear translocation to promote pancreatic ductal adenocarcinoma invasion via epithelial-mesenchymal transition. Tumour Biol. 39 (5), (2017).
- Chang, H. Y., et al. Hypoxia promotes nuclear translocation and transcriptional function in the oncogenic tyrosine kinase RON. Cancer Res. 74 (16), 4549-4562 (2014).
- Moriya, H.
- Prelich, G. Gene overexpression: Uses, mechanisms, and interpretation. Genetics. 190 (3), 841-854 (2012).
- Zheng, X., et al. A Notch-independent mechanism contributes to the induction of Hes1 gene expression in response to hypoxia in P19 cells. Exp Cell Res. 358 (2), 129-139 (2017).
- Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials. J Vis Exp. (110), e53819 (2016).
- Chilov, D., et al. Induction and nuclear translocation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1): heterodimerization with ARNT is not necessary for nuclear accumulation of HIF-1alpha. J Cell Sci. 112 (Pt 8), 1203-1212 (1999).
- Yin, S., et al. Arylsulfonamide KCN1 inhibits in vivo glioma growth and interferes with HIF signaling by disrupting HIF-1alpha interaction with cofactors p300/CBP. Clin Cancer Res. 18 (24), 6623-6633 (2012).
- Holmquist-Mengelbier, L., et al. Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype. Cancer Cell. 10 (5), 413-423 (2006).
- Koh, M. Y., Powis, G. Passing the baton: The HIF switch. Trends Biochem Sci. 37 (9), 364-372 (2012).
- Dumetz, A. C., Snellinger-O'brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization. Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).
- Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia. J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).
- Caradec, J., et al. Desperate house genes': The dramatic example of hypoxia. Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).
